曲酸、抗壞血酸及檸檬酸對(duì)鮮切蘋果褐變的影響

張婷婷 蒲云峰 王 雷 葉興乾 劉東紅，2*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 浙江大學(xué)馥莉食品研究院 杭州310058）

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，消費(fèi)者在意識(shí)到合理健康飲食重要性的同時(shí)，更傾向一種便捷的飲食方式。鮮切水果滿足了上述兩個(gè)條件，受到越來越多的消費(fèi)者歡迎，其行業(yè)經(jīng)濟(jì)重要性也日益顯著[1]。作為最常見的水果，蘋果含有大量生物活性分子，例如具有強(qiáng)抗氧化能力，抗炎和抗腫瘤特性的酚類化合物[2]。然而，食品加工企業(yè)現(xiàn)在面臨的主要挑戰(zhàn)是鮮切水果表面的酶促褐變，組織軟化，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的流失等問題，而對(duì)鮮切蘋果來說，褐變是影響其貨架期的主要原因[3]。鮮切蘋果的傳統(tǒng)保鮮方式包括物理、化學(xué)以及生物保鮮[4]。國(guó)內(nèi)外鮮切蘋果的化學(xué)保鮮研究報(bào)道很多，包括抗壞血酸[3]、檸檬酸[5-7]、D-異抗壞血酸鈉[6-7]、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）[7]以及有機(jī)酸結(jié)合其它保鮮方法[8-10]對(duì)鮮切蘋果酶促褐變的抑制。

曲酸是微生物的一種弱酸性代謝物，在食品生產(chǎn)中被用作抗氧化劑，通過螯合酶結(jié)構(gòu)中的銅離子，保持食物色澤，并能夠抑制黑色素形成的必需酶--酪氨酸酶[11]。何世微等[12]研究曲酸對(duì)菠蘿蜜多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用效果，發(fā)現(xiàn)曲酸對(duì)菠蘿蜜多酚氧化酶酶活的抑制作用較強(qiáng)且抑菌效果較好；孫蕊等[13]在0，4 ℃的條件下，研究不同濃度曲酸對(duì)鮮切山藥色澤及相關(guān)生理變化的影響，發(fā)現(xiàn)0.1%，0.3%或0.5%曲酸均不同程度地緩解褐變，抑制多酚氧化酶酶活。然而，在比較曲酸與其它不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果褐變抑制效果方面卻鮮有研究報(bào)道。

本試驗(yàn)在同一濃度條件下比較曲酸、抗壞血酸及檸檬酸這3 種有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果褐變方面的影響。根據(jù)綜合分析，確定3 種物質(zhì)中抑制褐變效果最佳的有機(jī)酸，為今后鮮切果蔬保鮮方面提供理論依據(jù)和試驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇相同成熟度的富士蘋果，表面無明顯病蟲害以及外觀損傷，大小均勻、新鮮；330 mL 長(zhǎng)方形保鮮盒（PP 食品級(jí)）。

無水檸檬酸（食用級(jí)）；曲酸、抗壞血酸（＞99.0%）、交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP，USP 級(jí)）、2，6-二氯靛酚鈉鹽水合物 （＞95.0%）、Triton X-100（生化級(jí)試劑）、聚乙二醇6000，購(gòu)于阿拉??；福林酚試劑（生化試劑）、三水合乙酸鈉（分析純）、二水合草酸（優(yōu)級(jí)純）、鄰苯二酚（化學(xué)純）、無水碳酸鈉（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗裝置（50 Hz，功率240 W），深圳市吉利特超聲洗凈設(shè)備有限公司；TA.XT2i 質(zhì)構(gòu)儀，北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；HC600 電子天平 （0.01 g），慈溪市華徐衡器實(shí)業(yè)有限公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Color-Flex EZ 色差儀，鼎韻中國(guó)公司；Waters e2695，沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

蘋果用純凈水洗凈，去核，切成0.5 cm 厚的三角片狀，分別在1%的曲酸、抗壞血酸以及檸檬酸中浸泡3 min 后，取出瀝干，再裝入保鮮盒，4℃貯藏。

1.3.1 硬度的測(cè)定 用TA.XT2i 質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定果實(shí)硬度，探頭直徑5 mm。

1.3.2 色澤的測(cè)定 采用色差儀測(cè)定樣品的L*、a*、b*值，然后計(jì)算褐變指數(shù)（BI）[14]：

式中：x=（a*+1.75L*）/（5.645L*+a*-3.012b*）

1.3.3 總酚含量的測(cè)定[15]稱取5 g 果肉與20 mL 甲醇勻漿，定容至50 mL，然后超聲30 min，離心備用。

在15 mL 試管中，先加0.6 mL 提取液，然后加1 mL 福林酚試劑，混勻靜止5 min 后，再加3 mL 0.1 mol/L 碳酸鈉和5 mL 蒸餾水，充分混勻后避光反應(yīng)2 h，于760 nm 測(cè)定吸光度。

1.3.4 可溶性醌含量的測(cè)定[16]取1.3.3 節(jié)的提取液于437nm 測(cè)定吸光度。

1.3.5 還原型抗壞血酸含量的測(cè)定 采用2，6-二氯靛酚鈉法[17]。

1.3.6 多酚氧化酶（PPO）的測(cè)定 參考曹建康[18]的方法。10 g 樣品中加入5 mL 提取緩沖液，搖勻后，在4 ℃下離心10 min，取上清液200 μL 加入3 mL 0.2 mol/L 鄰苯二酚緩沖液，于420 nm 測(cè)吸光度變化。以每千克樣品每分鐘吸光度變化值增加1 為1 個(gè)活性單位。

1.3.7 模擬體系的建立 根據(jù)He qiang[19]的方法建立模擬體系：將酚類底物表兒茶素溶液0.1 mol/L、多酚氧化酶酶液0.5 mg/L 各1 mL 加入10 mL 試管中，再往10 mL 試管中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的曲酸、抗壞血酸、檸檬酸1 mL，最后用7 mL pH 5.5 的0.1 mol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液定容。以不含有機(jī)酸、不含底物的模擬體系作為對(duì)照組?？瞻捉M以蒸餾水代替有機(jī)酸。模擬體系配置完畢后放在4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，于420 nm 處測(cè)吸光度并記錄相應(yīng)數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)各處理均重復(fù)3 次，求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果用x±s 表示。用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果硬度的影響

由圖1可知，4 種處理對(duì)鮮切蘋果硬度影響差異不顯著（P＞0.05）。用不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在處理后一天的時(shí)間范圍內(nèi)每一組果肉硬度下降明顯，但隨著時(shí)間的逐漸推移，各組果肉硬度在10N 左右浮動(dòng)，處在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，而經(jīng)過有機(jī)酸浸泡處理的樣品的硬度高于經(jīng)過蒸餾水浸泡處理的樣品。說明3 種有機(jī)酸浸泡對(duì)鮮切蘋果質(zhì)構(gòu)的影響不大。

2.2 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果褐變指數(shù)的影響

鮮切蘋果的酶促褐變主要發(fā)生在暴露的果肉組織處，多酚氧化酶（PPO）在氧氣的存在下將多酚化合物催化為醌，無色的醌類物質(zhì)由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性進(jìn)一步聚合轉(zhuǎn)化為黑色素[20]。由圖2可以看出在整個(gè)儲(chǔ)藏階段，褐變指數(shù)BI 逐漸上升。褐變指數(shù)BI 的上升是褐變發(fā)生的信號(hào)[21]。經(jīng)曲酸處理的樣品的褐變指數(shù)BI 上升緩慢，與抗壞血酸、檸檬酸差異性非常顯著（P＜0.01）。而檸檬酸處理的樣品褐變較快，其BI 值高于對(duì)照組。Chen 等[22]發(fā)現(xiàn)在5 ℃儲(chǔ)藏后期，鮮切蘋果經(jīng)過檸檬酸處理比未經(jīng)處理的樣品更容易褐變。Amodio M L 等[23]使用1%，2%的檸檬酸處理洋薊時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)檸檬酸處理的洋薊相比于對(duì)照組有更低的L*值，更高的a*值?？偟膩砜?，曲酸和抗壞血酸能抑制鮮切蘋果褐變，而檸檬酸無抑制褐變的效果。

2.3 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果總酚的影響

多酚已被證明具有抗氧化能力并且可以抑制炎癥，從而抑制代謝綜合征，包括胰島素抵抗，血脂異常，脂肪肝[24]。蘋果中主要的酚類化合物可以分為黃酮苷（類黃酮、槲皮素以及槲皮素化合物）、兒茶素和表型兒茶素、花青素、二氫查耳酮（根皮素和根皮苷）、酚酸（沒食子酸和綠原酸）以及原花青素六大類[25]。由圖3可知，在第0 天，總酚含量在6 260 mg/kg，在0.5～1 d 內(nèi)，鮮切蘋果中總酚含量下降明顯。經(jīng)過曲酸處理的樣品在1～7 d 的時(shí)間范圍內(nèi)仍能維持在5 750 mg/kg 左右。而經(jīng)過抗壞血酸以及檸檬酸處理的樣品至第一天以后降至4 500 mg/kg，經(jīng)過蒸餾水處理的鮮切蘋果在第1天以后維持在5 150 mg/kg，可見經(jīng)過檸檬酸以及抗壞血酸處理的鮮切蘋果的總酚含量明顯低于曲酸處理的樣品，甚至低于蒸餾水處理的樣品。原因可能是由于曲酸是酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物，其產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用會(huì)防止酚類物質(zhì)被氧化[26]。因此，曲酸在維持鮮切蘋果多酚含量方面效果最好。

2.4 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果可溶性醌含量的影響

醌是多酚氧化酶（PPO）和酚類物質(zhì)在酶促褐變反應(yīng)過程中的氧化產(chǎn)物。醌的累積通常意味著果蔬中黑色素的形成。Hui Gao 等[15]研究2，4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)鮮切藕片酶促褐變影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組可溶性醌的含量是經(jīng)過2，4-表油菜素內(nèi)酯處理的1.5 倍，而且可溶性醌與L*值呈負(fù)相關(guān)，與a*值和b*呈正相關(guān)?？梢娍扇苄怎部梢宰鳛楹肿兊囊粋€(gè)間接觀察指標(biāo)。從圖4中可以看出經(jīng)過曲酸處理的樣品0～1 d 可溶性醌含量急劇升高，第一天以后吸光度值穩(wěn)定在0.09 處。經(jīng)過抗壞血酸處理的樣品其可溶性醌含量在0～5 d 一直維持在較低的狀態(tài)，第5 天之后急劇上升。經(jīng)檸檬酸和水處理的樣品其可溶性醌含量則一直處于上升的趨勢(shì)，但經(jīng)過水處理的樣品可溶性醌含量高于檸檬酸處理的樣品?？梢?，3 種有機(jī)酸均在一定程度上抑制了鮮切蘋果褐變。

圖1 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果硬度的影響Fig.1 Effect of different organic acid on hardness of fresh-cut apple slices

圖2 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果褐變指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different organic acid on browning index of fresh-cut apple slices

圖3 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果總酚的影響Fig.3 Effect of different organic acid on total phenols of fresh-cut apple slices

圖4 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果可溶性醌含量的影響Fig.4 Effect of different organic acid on soluble quinone of fresh-cut apple slices

2.5 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果多酚氧化酶的影響

多酚氧化酶的活性部位由兩個(gè)銅原子構(gòu)成，其作用機(jī)制是基于其氧化酚類化合物的能力。在氧氣存在的條件下，多酚氧化酶催化兩個(gè)不同的反應(yīng)：一是單酚的羥基化，二是鄰苯二酚氧化為鄰苯二醌。隨后醌經(jīng)過非酶聚合反應(yīng)形成黑色素[27]。從圖5可以看出，隨著儲(chǔ)藏天數(shù)的增加，多酚氧化酶（PPO）的活性逐漸降低。4 種處理對(duì)多酚氧化酶活性影響的差異不顯著（P>0.05）。對(duì)比3 種有機(jī)酸中鮮切蘋果中多酚氧化酶的活性發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸處理的樣品酶活最低，蒸餾水浸泡處理的樣品在第0.5 天上升到最高值，隨后下降很快，曲酸處理的鮮切蘋果酶活高于蒸餾水處理的樣品，而檸檬酸處理的樣品其多酚氧化酶酶活前5 天一直維持在較高的水平，第5 天之后開始下降，這可以解釋檸檬酸處理的樣品在總酚低的情況下（圖3）仍能保持較高的可溶性醌含量（圖4），是因?yàn)槠漭^高的多酚氧化酶活性。經(jīng)過曲酸處理的樣品其多酚氧化酶活性較強(qiáng)，且其總酚含量很高，然而其可溶性醌的含量并不高，可能是由于曲酸能夠?qū)⒑稚孽愇镔|(zhì)還原成聯(lián)醌[28]。此外，多酚氧化酶活性越強(qiáng)并不等同于褐變程度越高，因?yàn)榍袎K表面多酚氧化酶活性強(qiáng)不代表內(nèi)部酶活性強(qiáng)，而且酚類化合物的含量和成分也會(huì)影響酶活[22]。由圖5可以得出，在抑制多酚氧化酶酶活方面，抗壞血酸的抑制能力優(yōu)于曲酸和檸檬酸。

圖5 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果多酚氧化酶的影響Fig.5 Effect of different organic acid on polyphenol oxidase activity of fresh-cut apple slices

圖6 不同有機(jī)酸對(duì)多酚氧化酶酶活的影響Fig.6 Effect of different organic acid on polyphenol oxidase activity

通過模擬體系的試驗(yàn)，在圖5中可以發(fā)現(xiàn)0～0.5 d 區(qū)間的鮮切蘋果中酶活大小為蒸餾水>檸檬酸>曲酸>抗壞血酸。富士蘋果褐變主要與表兒茶素氧化有關(guān)[29]，故按照一致的比例，以表兒茶素為底物，比較不同有機(jī)酸對(duì)純酶的作用，并在420 nm 處觀察吸光度（圖6），可以看出，在不加有機(jī)酸的時(shí)候，由于酶的作用，吸光值不斷升高，于20 min 處達(dá)到平衡狀態(tài)，當(dāng)體系中加入占總體系1%的有機(jī)酸時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)，在同一濃度的3 種有機(jī)酸中，抗壞血酸對(duì)多酚氧化酶的抑制作用明顯強(qiáng)于其它兩種酸，抑制作用為抗壞血酸＞曲酸＞檸檬酸＞蒸餾水，與上述（圖5）中前0.5 天的結(jié)果一致。Qiang He 等[19]通過模擬體系，以綠原酸為底物，研究0～3 mmol/L 濃度的次氯酸對(duì)酪氨酸酶的影響，發(fā)現(xiàn)濃度越高對(duì)酶的抑制作用越強(qiáng)。根據(jù)此次模擬，可以得出，在鮮切蘋果儲(chǔ)藏初期，抗壞血酸的防褐變效果最好。

2.6 不同有機(jī)酸對(duì)鮮切蘋果還原型抗壞血酸含量的影響

維生素C（簡(jiǎn)稱VC），包括抗壞血酸和脫氫抗壞血酸，是植物性食物中的一種重要的維生素，在食品加工過程中容易降解[30]。根據(jù)表2可以看出，隨著存儲(chǔ)天數(shù)的增加，4 種處理樣品VC 的含量均逐漸降低。在0.5～9 d 的處藏階段，曲酸和檸檬酸處理樣的VC 含量高于對(duì)照組，且經(jīng)曲酸處理的鮮切蘋果的VC 含量高于檸檬酸處理的樣品，但差異不顯著（P＞0.05）。李慶鵬等[31]采用2.5%的曲酸浸泡處理鮮切西蘭花，發(fā)現(xiàn)曲酸處理的VC 含量明顯高于對(duì)照組，在第12 天是對(duì)照組的1.65倍?？梢娗岷蜋幟仕崮茌^為有效地抑制鮮切蘋果VC 的降解。

表1 鮮切蘋果的VC 含量的變化（mg/100g）Table 1 Ascorbic acid changes of fresh cut apple during storage （mg/100g）

3 結(jié)論

經(jīng)過曲酸、抗壞血酸以及檸檬酸這3 種有機(jī)酸浸泡處理的鮮切蘋果，在硬度以及多酚氧化酶活性與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。曲酸在抑制鮮切蘋果切塊表面褐變，總酚含量方面效果顯著優(yōu)于抗壞血酸、檸檬酸。在維持鮮切蘋果還原型抗壞血酸含量方面，曲酸作用效果優(yōu)于檸檬酸，這兩種有機(jī)酸的作用效果都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在短時(shí)間抑制多酚氧化酶方面，1%的抗壞血酸在儲(chǔ)藏初期效果最好（P＜0.05）。

綜合分析，3 種有機(jī)酸均對(duì)鮮切蘋果褐變有一定的抑制效果，曲酸在抑制鮮切蘋果褐變方面效果最佳，是一種具有潛力的鮮切蘋果護(hù)色保鮮劑。但是，曲酸對(duì)鮮切蘋果保鮮效果仍然有待于進(jìn)一步研究，曲酸抑制蘋果褐變的機(jī)理還值得深入探討。