野生和種植藜蒿不同部位提取物的抗氧化活性和酶抑制活性

謝 星 涂宗財(cái)，* 王 輝 張 露 王淑好 王振興

（1 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 南昌330022）

藜蒿（Artemisia selengnesis Turcz）是菊科蒿屬的多年生草本植物，又名水蒿、蘆蒿等，在我國廣泛生長在鄱陽湖地區(qū)，是一種深受人們喜愛的綠葉蔬菜。野生藜蒿具有很高的藥用價(jià)值，如消炎、祛風(fēng)濕、促消化和加強(qiáng)人體免疫力等[1-2]。每年我國藜蒿產(chǎn)量可達(dá)數(shù)百萬噸以上，除了藜蒿嫩莖加工成美食外，藜蒿根和葉常被當(dāng)作廢棄物丟棄，造成潛在資源的浪費(fèi)。Wang 等[3]研究表明，藜蒿葉多糖APS1 和APS2 具有很好的抗癌活性。A Ryun Kim 等[4]發(fā)現(xiàn)藜蒿提取物能抑制MG-63 細(xì)胞中IL-6 的增值，具有很好的抗炎活性。余宙等[5]通過動(dòng)物和人體試食試驗(yàn)研究野生藜蒿提取物具有降血壓的作用。涂宗財(cái)?shù)萚6]研究發(fā)現(xiàn)黎蒿50%乙醇提取物具有很好的抗氧化能力，多酚類化合物是其主要活性成分。Zhang 等[7]從藜蒿葉中初步鑒定出57 種化合物，其中的主要化合物是黃酮和酚酸。目前關(guān)于野生和種植藜蒿降血糖的研究文獻(xiàn)較少，關(guān)于野生和種植藜蒿在抗痛風(fēng)和抗老年癡呆病方面的研究未見報(bào)道。

本研究以野生藜蒿葉、莖和根以及種植藜蒿葉和莖為原料，比較藜蒿不同部位提取物的總酚和總黃酮含量，測定其DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力以及α-葡萄糖苷酶、黃嘌呤氧化酶和乙酰膽堿酯酶的抑制能力，評價(jià)野生和種植藜蒿不同部位提取物在抗氧化、降血糖、抗痛風(fēng)和預(yù)防老年癡呆病方面的應(yīng)用潛力，為其高值化利用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

野生和種植藜蒿于2016年4月分別采集于江西省鄱陽湖和江蘇省南京市，原料用水漂洗去除泥垢，將其莖、葉和根分開，凍干機(jī)凍干后粉碎，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

Folin-Ciocalteu 試劑、Na2CO3、AlCl3、沒食子酸、槲皮素、甲醇等，索萊寶生物科技有限公司；2，2'-azino-bis （3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid）（ABTS）、1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶（來源于釀酒酵母）、黃嘌呤氧化酶（來源于牛奶）、黃嘌呤、別嘌呤醇和p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、乙酰膽堿酯酶、加蘭他敏、碘代硫化膽堿、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），美國sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1 酶標(biāo)分析儀，美國Bio Tek 公司；ML104 電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；TGL-10C 高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 分別稱取10 g 野生藜蒿葉、根和莖以及種植藜蒿的葉和莖的粉末，按1∶30 的料液比加入90%甲醇，超聲波160 W、50 ℃提取80 min，4 000 r/min 離心5 min，收集上清液，所有樣品重復(fù)提取3 次，最后合并上清液，50 ℃真空濃縮，最后分別用甲醇定容至50 mL。樣品-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu 法[7]測定樣品的總酚含量。以沒食子酸（10～60 μg/mL）為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 （Y=0.0046X+0.0665，R2=0.9993）。藜蒿樣品中的總酚含量表示為毫克沒食子酸當(dāng)量每克干原料（mg GAE/g DM）。

1.3.3 總黃酮含量測定 采用氯化鋁比色法[7]測定藜蒿樣品的總黃酮含量。以槲皮素為標(biāo)品（2～12 μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.0209X-0.0197，R2=0.9976）。藜蒿樣品中的總黃酮含量表示為毫克槲皮素當(dāng)量每克干原料（mg QE/g DM）。

1.3.4 DPPH·清除能力測定 參照Wang 等[8]的方法測定藜蒿樣品的DPPH·清除能力。以BHT 為陽性對照，試驗(yàn)結(jié)果用IC50值表示。IC50值為50%自由基被清除時(shí)所需要的樣品濃度。

1.3.5 ABTS+·清除能力測定 參照Lu Zhang 等[7]的方法測定藜蒿樣品的ABTS+·清除能力。以槲皮素為陽性對照，試驗(yàn)結(jié)果用IC50值表示。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 參照Sengul Uysal 等[9]的方法測定藜蒿樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。取50 μL 適宜濃度的樣品溶液與100 μL 0.1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶于96孔酶標(biāo)板上混勻，室溫反應(yīng)6 min 后加入50 μL 5.0 mmol/L 對硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（0.1 mol/L pH=6.8 PB 配制），再于37 ℃反應(yīng)10 min，加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，最后在405 nm 測吸光值（Ai）。以不加酶和樣品的反應(yīng)體系為空白，阿卡波糖為陽性對照。酶抑制作用計(jì)算公式為：

以不含酶的反應(yīng)體系 （Aj）為樣品空白，用90%甲醇代替樣品作控制組（Acontrol）。50%的酶活性被抑制時(shí)所需要的樣品濃度用IC50值表示（mg DM/mL）。

1.3.7 黃嘌呤氧化酶抑制活性的測定 參照Salma Kammoun El Euch 等[10]的方法測定藜蒿樣品的黃嘌呤氧化酶抑制活性。50 μL 適宜濃度的樣品溶液與60 μL 70 mmol/L pH=7.5 PB 和30 μL 0.1 U/mL 的黃嘌呤氧化酶于96 孔酶標(biāo)板上混勻，室溫反應(yīng)15 min 后加入60 μL 150 mmol/L 的黃嘌呤，再于室溫反應(yīng)5 min 后測定反應(yīng)體系在295 nm 處的吸光值（Ai）。以不加樣品的反應(yīng)體系為控制組，不加酶和樣品的反應(yīng)體系為空白，別嘌呤醇為陽性對照。酶抑制活性計(jì)算公式同（1），結(jié)果用IC50值表示。

1.3.8 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定 參照Salma Kammoun El Euch 等[10]的方法測定藜蒿提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性。取50 μL 適宜濃度的樣品溶液與125 μL 3 mmol/L 5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）和25 μL 1 U/mL 的乙酰膽堿酯酶于96 孔酶標(biāo)板上混勻，室溫反應(yīng)15 min 后加入25 μL BTCL （碘代硫化膽堿），室溫下反應(yīng)10 min 后于405 nm 下測吸光值（Ai）。以不加樣品的反應(yīng)體系為控制組，不加酶和樣品的反應(yīng)體系為空白，加蘭他敏為陽性對照。酶抑制活性計(jì)算公式同（1），結(jié)果用IC50值表示。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 19.0 和Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用皮爾森相關(guān)性分析總酚、總黃酮含量與抗氧化和酶抑制活性之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量

如圖1所示，野生和種植藜蒿不同部位提取物的總酚含量有明顯的差別。野生藜蒿葉的總酚含量最高 （30.12 mg GAE/g DM），野生藜蒿莖（22.62 mg GAE/g DM）和根 （15.72 mg GAE/g DM）次之，種植藜蒿葉（9.73 mg GAE/g DM）和莖（4.13 mg GAE/g DM）的總酚含量最低。野生藜蒿不同部位提取物的總酚含量均高于種植藜蒿對應(yīng)部位的提取物，其中野生藜蒿莖的總酚含量是種植藜蒿莖的5 倍。這種差異可能是由土壤環(huán)境、氣候條件（光照、降水量等）和生長周期等因素造成的[11]。Rodrigues 等[12]對15 種不同產(chǎn)地來源的藍(lán)莓的總酚含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同藍(lán)莓的總酚含量范圍為274.48～694.6 mg GAE/100 g。Tibbetts等[13]對多種野生海藻和養(yǎng)植海藻總酚含量進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)野生海藻的總酚含量為11～59 mg GAE/g DW，而養(yǎng)植海藻的總酚含量只有4～5 mg GAE/g DW。

圖1 野生和種植藜蒿不同部位提取物總酚（a）和總黃酮（b）含量Fig.1 The total phenolics （a）and total flavonoids （b）content of extracts from different parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

2.2 總黃酮含量

由圖1可知，不同藜蒿提取物總黃酮含量大小的順序?yàn)椋悍N植藜蒿葉＞野生藜蒿葉＞野生藜蒿莖＞野生藜蒿根＞種植藜蒿莖，野生和種植藜蒿不同部位提取物之間的總黃酮含量都偏低，張露等[7，14]研究表明藜蒿中主要的酚類化合物是酚酸。種植和野生藜蒿葉提取物具有最高的總黃酮含量，分別為0.63 和0.54 mg QuE/g DM（P＜0.05）；野生藜蒿根和莖提取物以及種植藜蒿莖提取物之間的總黃酮含量范圍在0.065～0.085 mg QuE/g DM 之間，野生藜蒿莖和根之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。由此可知，藜蒿中的黃酮類化合物主要存在于藜蒿葉之中。Ouerghemmi 等[15]在比較野生和種植蕓香總黃酮含量時(shí)也得到了相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其總黃酮含量分別為168.91 和163.26 mg CE/g DW，且兩者之間無顯著性差異。

2.3 DPPH·清除能力

圖2 野生和種植藜蒿不同部位提取物DPPH·清除能力Fig.2 The DPPH· scavenging ability of extracts from different parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

如圖2所示，所有藜蒿不同部位提取物都具有DPPH·清除能力，且其DPPH·清除能力與提取物的濃度呈明顯量效關(guān)系，其IC50值見表1。野生藜蒿葉提取物的DPPH·清除能力最強(qiáng)，IC50值為0.37 mg DM/mL，其次為野生藜蒿莖提取物（0.38 mg DM/mL），且兩者不存在顯著性差異（P＞0.05）。種植藜蒿莖的DPPH·清除能力最弱，其IC50值是野生藜蒿莖的31.5 倍。相關(guān)性分析表明，藜蒿提取物的DPPH·清除能力與其總酚和總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)分別為-0.78 和-0.293，說明藜蒿提取物中的酚類化合物對其DPPH·清除能力的貢獻(xiàn)最大。張露等[16]研究發(fā)現(xiàn)，藜蒿莖葉提取物具有很強(qiáng)的DPPH·清除能力，且與總酚含量的相關(guān)性最高。

表1 野生和種植藜蒿不同部位提取物DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、α-葡萄糖苷酶、黃嘌呤氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性抑制能力的IC50 值Table 1 The IC50 values of DPPH·scavenging ability，ABTS+·scavenging ability，α-glucosidase，xanthine oxidase and acetylcholinesterase inhibition of extracts from various parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

2.4 ABTS+·清除能力

如表1和圖3所示，所有藜蒿樣品的ABTS+·和DPPH·清除能力的活性變化趨勢一致，且不同樣品之間的ABTS+·清除能力差異顯著（P＜0.05）。不同藜蒿提取物ABTS+·清除能力大小順序?yàn)椋阂吧驾锶~＞野生藜蒿莖＞野生藜蒿根＞種植藜蒿葉＞種植藜蒿莖。野生藜蒿葉提取物具有最高的ABTS+·清除能力，IC50值為0.39 mg DM/mL，其值是種植藜蒿葉的9 倍；種植藜蒿莖的ABTS+·清除能力最低，其值是野生藜蒿莖的13 倍。相關(guān)性分析表明，藜蒿提取物中酚類化合物含量與ABTS+·清除能力具有很高的相關(guān)性（r=-0.845），黃酮類化合物ABTS+·清除能力相關(guān)性低，其相關(guān)性系數(shù)為-0.242。因此，酚類化合物是藜蒿中最主要的ABTS+·清除劑。

2.5 α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

糖尿病是以持續(xù)高血糖為診斷特征的一種慢性代謝性的疾病，機(jī)體長期處于高血糖狀態(tài)將引發(fā)視網(wǎng)膜病變、腎病和心血管疾病等糖尿病并發(fā)癥[17]。α-葡萄糖苷酶抑制劑是臨床上用于治療糖尿病的一種有效的藥物，它能通過抑制小腸上α-葡萄糖苷酶的活性來減少機(jī)體對碳水化合物的吸收，降低糖尿病患者的餐后和空腹血糖水平[18]。但是合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有腹脹、腹瀉等副作用，因此，天然植物來源的無毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究熱點(diǎn)[19]。

如圖4所示，野生藜蒿根的α-葡萄糖苷酶抑制能力最強(qiáng)，IC50值為14.08 mg DM/mL，其抑制能力是阿卡波糖的1/15。野生和種植藜蒿的葉和莖提取物的IC50值范圍為18.19～25.25 mg DM/mL，野生和種植藜蒿的相同部位的提取物之間差異顯著（P＜0.05）。由此可知，相比藜蒿其它部位提取物，野生藜蒿根更適合作為天然抗糖尿病藥物的來源。相關(guān)性分析表明，藜蒿提取物中的多酚和黃酮類化合物與其α-葡萄糖苷酶抑制能力的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.371 和-0.165；藜蒿提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力與α-葡萄糖苷酶抑制活性相關(guān)性系數(shù)分別為0.590 和0.617，這表明藜蒿提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力是由于其中多種化合物的協(xié)同效果，抗氧化成分對α-葡萄糖苷酶活性有很大的抑制作用。

圖3 野生和種植藜蒿不同部位提取物ABTS+·清除能力Fig.3 The ABTS+· scavenging ability of extracts from different parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

2.6 黃嘌呤氧化酶抑制能力

黃嘌呤氧化酶是嘌呤代謝過程中的一種關(guān)鍵酶，它能催化次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，最終產(chǎn)生尿酸[20]。大部分尿酸是通過腎產(chǎn)生的，尿酸過量產(chǎn)生會(huì)引起痛風(fēng)和高尿酸血癥，同時(shí)也會(huì)提高高血壓和腎結(jié)石等疾病的發(fā)病率[21-22]。治療痛風(fēng)和高尿酸血癥常用的方法是運(yùn)用黃嘌呤氧化酶抑制劑降低人體內(nèi)黃嘌呤氧化酶的活性，從而減少尿酸的生成。但是目前臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑如別嘌呤醇具有發(fā)熱、引起過敏性皮疹和器官受損等副作用[23]。因此，本研究通過藜蒿提取物黃嘌呤氧化酶抑制活性來評估其作為黃嘌呤氧化酶抑制劑的潛力。

如圖5和表1所示，野生藜蒿根和葉具有最高的黃嘌呤氧化酶抑制活性，其IC50值分別為4.01 和4.39 mg DM/mL；種植藜蒿莖的黃嘌呤氧化酶抑制活性最弱，其IC50值高于16 mg DM/mL。當(dāng)樣品濃度小于10 mg DM/mL 時(shí)，藜蒿樣品對黃嘌呤氧化酶抑制能力呈濃度依賴性，但是其活性遠(yuǎn)低于陽性對照組別嘌呤醇（IC50=3.0 μg/mL）。相關(guān)性分析顯示，藜蒿提取物總酚和總黃酮含量與黃嘌呤氧化酶抑制能力的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.331 和-0.481，表明藜蒿中黃酮類化合物對黃嘌呤氧化酶的抑制能力貢獻(xiàn)大，藜蒿提取物的弱黃嘌呤氧化酶抑制能力可能與其低的黃酮含量有關(guān)。

圖4 野生和種植藜蒿不同部位提取物α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Fig.4 The inhibtion on α-glucosidase activity of extracts from different parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

2.7 乙酰膽堿酯酶抑制能力

乙酰膽堿酯酶可通過催化乙酰膽堿的裂解降低大腦內(nèi)乙酰膽堿的濃度。當(dāng)人體中乙酰膽堿酯酶活性過高時(shí)，就會(huì)造成大腦內(nèi)乙酰膽堿水平降低，從而終止神經(jīng)信號的傳輸，最終引發(fā)老年癡呆等疾病[24]。治療老年癡呆的有效方法之一是使用乙酰膽堿酯酶抑制劑降低乙酰膽堿酯酶活性[25]，因此，本研究采用乙酰膽堿酯酶活性抑制能力評定藜蒿提取物在老年癡呆病藥物治療方面的應(yīng)用前景。

由圖6可知，在測量濃度范圍內(nèi)，藜蒿提取物的乙酰膽堿酯酶抑制能力隨其濃度的提高不斷增強(qiáng)。如表1所示，藜蒿葉提取物具有相對較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，野生和種植藜蒿葉的IC50值分別為10.30 和13.68 mg DM/mL，但遠(yuǎn)低于樣品對照品加蘭他敏的活性（IC50=1.0 μg/mL）。野生藜蒿根和莖提取物以及種植藜蒿莖提取物的乙酰膽堿酯酶抑制能力分別是野生藜蒿葉提取物的2.9，3.6 和2.7 倍。相關(guān)性分析顯示，藜蒿提取物的總黃酮含量與乙酰膽堿酯酶活性的相關(guān)性系數(shù)為-0.923，呈高度的負(fù)相關(guān)，這說明藜蒿中的黃酮類化合物是其主要的乙酰膽堿酯酶抑制劑。

3 結(jié)論

圖5 野生和種植藜蒿不同部位提取物黃嘌呤氧化酶活性抑制能力Fig.5 The inhibtion on the activity of xanthine oxidase of extracts from different parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

圖6 野生和種植藜蒿不同部位提取物乙酰膽堿酯酶活性抑制能力Fig.6 The inhibtion on the activity of acetylcholinesterase of extracts from different parts of wild and cultivated Artemisia selengensis Turcz

本研究首次對野生和種植藜蒿各部位提取物的總酚含量、總黃酮含量、抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶、黃嘌呤氧化酶和乙酰膽堿酯酶的抑制能力進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明，野生藜蒿葉的總酚含量最高，種植藜蒿葉的總黃酮含量最高?？傮w上來說，野生藜蒿各部位提取物的抗氧化活性和酶抑制能力強(qiáng)于種植藜蒿對應(yīng)部位的提取物。野生藜蒿葉具有最強(qiáng)的DPPH·和ABTS+·清除能力，是藜蒿中最優(yōu)質(zhì)的抗氧化活性成分來源。野生藜蒿根提取物具有最好的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其IC50值是阿卡波糖的15 倍，可進(jìn)一步作為高活性α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選材料來源。相比其它藜蒿提取物，野生藜蒿葉和根提取物分別具有較好的乙酰膽堿酯酶和黃嘌呤氧化酶抑制能力，但其抑制能力與陽性對照組相差較大。多酚類化合物是藜蒿中最主要的抗氧化成分，黃酮類化合物是其主要的乙酰膽堿酯酶抑制劑。本研究可為野生和種植藜蒿資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供借鑒。