短乳桿菌AR247的抗氧化成分及其抗衰老作用

林祥娜 王光強 楊昳津 熊智強 艾連中 夏永軍

（上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海食品微生物工程技術研究中心 上海200093）

氧化應激是當機體產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和體內的抗氧化防御系統(tǒng)不平衡時導致的[1-2]。當活性氧的含量積累過多，超過內源性的清除劑的中和能力后，機體內的蛋白質、核酸、細胞等易受到氧化損傷，從而會引起多種與氧化應激相關的疾病，例如炎癥、癌癥、帕金森、阿茲海默和動脈粥樣硬化等疾病[3-8]?？商砑硬煌愋偷目寡趸瘎┤p輕或者阻止胞內氧化損傷，從而幫助機體減輕氧化損傷[9]。盡管目前一些合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚 （Butylated Hydroxyanisole，BHA）、2，6-二叔丁基對甲酚（Butylated Hydroxytoluene，BHT）等廣泛地用于阻滯脂質過氧化，但是損傷肝臟導致它們的安全性受到質疑。目前從自然界中開發(fā)天然、安全、可代替合成抗氧化劑的天然抗氧化劑受到極大的關注。

乳酸菌（Lactic Acid Bateria，LAB）是一類可發(fā)酵糖水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱。近年來，國內外不少報道稱乳酸菌具有抗氧化作用，Kullisaar 等[7]研究發(fā)現具有抗氧化活性的菌株發(fā)酵乳桿菌 （Lactobacillus fermentum）E-3 和E-8 在一定濃度的過氧化氫中存活時間較長；Li等[9]研究發(fā)現植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）C88 有較高的清除羥基自由基和DPPH 自由基的能力，清除率分別為44.31%和53.05%；Kuda 等[10]研究發(fā)現乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）S-SU2 有較高的對超氧根離子的清除能力，且植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）S-SU1 的滅活菌體對3 mmol/L H2O2損傷的釀酒酵母細胞有保護作用。關于乳酸菌的抗氧化研究雖然很多，但是對其抗氧化成分及其抗氧化機制并沒有系統(tǒng)的闡述。

前期研究表明，短乳桿菌AR247 具有較好的抗氧化活性，其菌體對DPPH 和O2-·的清除力分別為（48.95±0.17）%和（26.85±0.05）%，且其能抗脂質過氧化，對酵母細胞具有一定的保護作用[11]。本文研究了具有抗氧化活性的短乳桿菌AR247不同組分的抗氧化能力，并進一步研究了短乳桿菌AR247 對D-gal 致衰老的氧化小鼠的保護作用，測定其血清、肝臟和腦組織中的過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力和谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，同時測定小鼠血清中的白介素2 （interleukin 2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor，TNFα）含量，以期為開發(fā)具有抗氧化性的功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

上海理工大學食品生物技術研究所分離保藏的短乳桿菌AR247（CGMCC 12786）。

菌株活化培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基：液體MRS 培養(yǎng)基，按文獻配制[12]。

固體MRS 培養(yǎng)基：液體MRS 培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂粉。

正己烷、正丁醇、乙酸乙酯：國藥集團化學試劑有限公司。D-半乳糖、LiCl：上海生物工程有限公司。胃蛋白酶、胰酶：上海源葉生物科技有限公司。

ICR 小鼠：雄性，體質量（20±2）g，SPF 級，購于上海杰思捷實驗動物有限公司。

過氧化氫酶 （CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、白介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

3-18 K 型離心機，德國sigma 公司；分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒；厭氧培養(yǎng)箱，英國Ruskin 公司；恒溫水浴鍋，上海一恒；超凈工作臺，蘇州凈化；酶標儀，奧地利Molecular Devices。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化以及無細胞提取物和完整細胞菌體的制備 將凍藏在-80 ℃的短乳桿菌AR247傳代3 次，以1%的接種量接種于100 mL 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h 后，在4 ℃、6 000 r/min 的條件下離心10 min，分離得到無細胞提取物，-20 ℃放置備用；將菌體用無菌PBS 洗滌3 次后重懸于PBS 中，調整菌體濃度為1.0×109CFU/mL，此即完整菌體細胞。

1.3.2 萃取樣品的制備 將得到的無細胞提取物置于分液漏斗中，采用極性依次增大的有機溶劑正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每次萃取到有機相無明顯顏色為止。分別得到正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相，如圖1。

圖1 無細胞提取物的連續(xù)萃取Fig.1 Continuous extraction of cell free extracts

1.3.3 菌體部分的處理 根據Li[9]的研究，稍有改動。將上述得到的完整菌體細胞分成6 組，其處理如下：在第1 組菌體中加入200 μL 20 mg/mL 的溶菌酶37 ℃處理30 min，隨后在冰浴條件下進行超聲波破碎，破碎參數如下：超聲5 s，停歇5 s，功率40%，超聲工作時間10 min。超聲結束后在4℃，6 000 r/min 離心10 min，取上清，即為胞內物質，沉淀加無菌水至原來體積；第2 組加入0.5 mg/mL 的胰酶；第3 組加入0.5 mg/mL 的蛋白酶K；第4 組加入5 mol/L 的氯化鋰；第5 組加入10 g/L 的偏高碘酸鈉；第6 組不處理，做空白對照。將2，3，4，5，6 組放置在37 ℃下培養(yǎng)30 min，隨后在4 ℃，6 000 r/min 離心10 min，取上清，沉淀加無菌水至原來體積，備用。

1.3.4 DPPH 清除能力的測定 據文獻[12]，稍有改動。取不同樣品各2 mL，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH 無水乙醇溶液1 mL，混勻后置于室溫下避光反應30 min，然后在6 000 r/min 下離心10 min，取上清液在517 nm 下測定吸光度Ai，平行測定3 次，取平均值。空白組以等體積無水乙醇代替DPPH 溶液，測得吸光度（Aj）；對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，測得吸光度（A0）；并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調零。

1.3.5 試驗動物及分組 將40 只小鼠飼養(yǎng)于動物房，12 h 光照/12 h 黑暗，相對濕度40%～60%，室溫（23±2）℃，自由進食和飲水，適應性飼養(yǎng)一周后，分組，每組10 只，即：（1）正常組；（2）模型組；（3）陽性對照組；（4）短乳桿菌AR247 組。正常組小鼠皮下注射生理鹽水，其它組小鼠皮下注射濃度為150 mg/kg 體重/天的D-半乳糖，注射6周。6 周后開始灌胃，陽性對照組灌胃10 mL/kg 體重濃度為1 mmol/L 的VC。短乳桿菌AR247 組灌胃10 mL/kg 體重的濃度為1.0×109CFU/mL 的短乳桿菌AR247，正常組和模型組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃6 周。

1.3.6 小鼠試驗樣本的采集 最后一次給藥12 h 后，稱重，取眼球取血，引頸處死小鼠，迅速取肝和腦用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸去水分后，稱量，器官指數為器官質量與體重的比值。血液于4℃、3 000 r/min 離心10 min，收集血清，用于血清生化指標的測定。器官用預冷PBS 制成10%的組織勻漿，于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min 后取上清，用于組織生化指標的測定。

1.3.7 血清和組織中的抗氧化酶活力的測定 血清、肝、腦組織勻漿的CAT、SOD、GSH-Px 活力和MDA 及GSH 含量測定按照試劑盒說明書的方法進行。血清里的IL-2 和TNF-α 按照試劑盒說明書的方法進行測定。

1.4 數據處理

所有數據均用 “平均值±標準差”（mean±SD）表示，采用SPSS 22.0 數據分析軟件進行顯著性差異分析，采用LSD 最小顯著性差異法分析其差異性，P＞0.05 無顯著性差異，P＜0.05 有顯著性差異，P＜0.01 有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 連續(xù)萃取的無細胞提取物對DPPH 自由基的清除能力

二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基是一種常見的評價抗氧化效果的測定方法[13]。DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，加入抗氧化物質后，其在517 nm 處有較強吸收，可通過這一變化評價物質的抗氧化能力。

由表1可以看到，把短乳桿菌AR247 的無細胞提取物按極性依次增大的有機溶劑正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每次萃取到有機相無明顯顏色為止，分別得到正己烷相、乙酸乙酯相和正丁醇相，以及最后剩余的水相，經過逐級連續(xù)萃取，DPPH 自由基清除率最高的為水相，清除率為90.82%±1.21%，較空白MRS 明顯提高，極性最小的正己烷相的清除率最小，僅為2.7%±0.6%，乙酸乙酯相的清除率高于正丁醇相推測是無細胞提取物中的抗氧化物質被乙酸乙酯萃取出來，故下一級的正丁醇相清除率較低，但萃取完成后的水相清除率仍較高，這表示無細胞提取物中的抗氧化成分多在水溶液中。

表1 連續(xù)萃取的無細胞提取物對DPPH 自由基的清除能力Table 1 DPPH radical scavenging activity of continuous extraction of cell free extracts

2.2 菌體不同處理方法對DPPH 自由基的清除率

有文獻報道，益生菌中的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、含錳假性過氧化氫酶（Mn-Kat）、谷胱甘肽過氧化物酶（GP）以及硫氧還蛋白還原酶（TrxR）具有清除活性氧（ROS）和自由基作用[15]。對短乳桿菌AR247 的菌體進行不同的處理分析，結果如表2所示，不同菌體成分的DPPH 清除率能力不同，其中第6 組作為不加處理的完整細胞懸液來作為對照組。第1 組對菌體進行了破壁處理，使細胞內容物溶出，其清除率高達85.70% ±1.70%，與空白相比明顯提高，說明其內容物抗氧化能力較強；第2 組用胰酶處理了菌體表面的蛋白，使細胞的粘附性變差，其清除率為47.22%±1.23%，與對照組相比其清除率并無顯著性差異；第3 組用蛋白酶K 處理菌體后，其表面蛋白質被降解，其菌體清除率與對照組相比無顯著性差異，但上清中蛋白質降解產物的清除率提高至35.30%±0.80%；第4 組用LiCl 處理菌體，將菌體表面的S 層蛋白去除后，清除率降至25.79% ±0.88%，S 層蛋白的清除率為8.70%±1.21%。說明表面的S 層蛋白并非是主要抗氧化組分。第5 組用具有強氧化的偏高碘酸鈉處理菌體表面，加入偏高碘酸鈉后，表面的多糖被氧化，其清除率為43.98%±0.67%，與對照組并沒有顯著性差異，證明其表面多糖并不是主要的抗氧化成分。綜上，短乳桿菌AR247 的胞內成分以及菌體表面的莢蛋白具有一定的抗氧化性，且發(fā)現短乳桿菌AR247胞內物質的清除DPPH 自由基能力最強，這與之前的文獻報道相吻合。

2.3 短乳酸菌AR247 對小鼠體重和器官指數的影響

在一定時間內，連續(xù)給動物注射D-半乳糖，使動物機體內半乳糖濃度增高，使其在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，后者不能進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙，最終引起衰老[16]。這與正常衰老的過程較為相似，是衰老研究中常用的一種模型，構建簡單，且成功率高[17-18]。

表2 菌體不同處理方法對DPPH 自由基的清除率（%）Table 2 DPPH radical scavenging activity of different treatment on intact bacteria （%）

試驗期間各組小鼠均自由飲食、飲水，正常組小鼠生長狀況良好，模型組小鼠出現掉毛，毛發(fā)失去光澤，反應遲鈍，所有小鼠未發(fā)生意外損傷和死亡。由表3可發(fā)現，試驗結束后，模型組小鼠體重較正常組顯著下降，灌胃VC 和短乳桿菌AR247后，體重恢復至正常水平；模型組的肝臟和腦指數與正常組相比均顯著下降，其中灌胃短乳桿菌AR247 后，腦指數恢復至正常水平。

表3 短乳桿菌AR247 對衰老小鼠體重和器官指數的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of L.brevis AR247 on weight and organ index in D-galactose induced aging mice （±s，n=10）

表3 短乳桿菌AR247 對衰老小鼠體重和器官指數的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of L.brevis AR247 on weight and organ index in D-galactose induced aging mice （±s，n=10）

注：* 表示與模型組相比有顯著性差異，P＜0.05。

?分組 試驗前體重/g 試驗結束時體重/g 腦指數/% 肝指數/%正常組 28.14±0.90 38.43±2.15* 1.42±0.06* 4.41±0.25*模型組 28.56±1.46 35.83±1.79 1.24±0.13 3.35±0.16陽性對照組 28.00±1.53 38.17±3.20* 1.30±0.04 4.31±0.57*短乳桿菌AR247 組 27.83±1.47 38.61±1.66* 1.45±0.07* 3.59±0.16

2.4 短乳桿菌AR247 對小鼠MDA 含量的影響

在正常情況下，自由基的生成和清除處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，機體有一套防御體系，包括非酶系統(tǒng)如谷胱甘肽、VC、硒等，酶防御系統(tǒng)如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，抵抗自由基的攻擊[4，19-21]。當機體內自由基超過機體清除能力時，可導致脂質過氧化，MDA 是脂質過氧化的副產物之一，其含量，表征了細胞和器官的氧化應激水平[14，22-24]。

MDA 是脂質過氧化的產物之一，其含量表征了細胞和器官的氧化應激水平[14]。由圖2可以看到，模型組的肝臟和腦中的MDA 含量顯著高于正常組，分別為10.77 ± 1.22 和4.33 ± 1.32，衰老模型構建成功。灌胃VC 和短乳桿菌AR247 后，肝臟中MDA 含量顯著降低，分別降低至正常組的82.38%和66.13%；短乳桿菌AR247 處理后，腦中的MDA 含量恢復至正常水平。說明短乳桿菌AR247 可緩解小鼠肝臟和腦的氧化應激。

圖2 短乳桿菌AR247 對衰老小鼠的丙二醛含量的影響（±s，n=10）Fig.2 Effect of L.brevis AR247 on MDA in D-galactose induced aging mice （±s，n=10）

2.5 短乳桿菌AR247 對小鼠血清中的抗氧化水平的影響

SOD、CAT 和GSH-Px 是機體中非常重要的抗氧化酶，可清除體內自由基和活性氧，以及減少過氧化脂質的形成[25-27]。

表4 短乳桿菌AR247 對小鼠血清中的抗氧化水平的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of L.Brevi s AR247 on antioxidant status in serum （±s，n=10）

表4 短乳桿菌AR247 對小鼠血清中的抗氧化水平的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of L.Brevi s AR247 on antioxidant status in serum （±s，n=10）

注：* 表示與模型組相比有顯著性差異，P＜0.05。

?分組 SOD/U·mL-1 GSH-Px/U·mL-1 CAT/U·mL-1 GSH/mg·L-1正常組 24.56±0.52* 180.73±5.90* 5.24±2.72* 58.04±11.48*模型組 23.71±0.64 155.50±9.52 0 5.10±0.04陽性對照組 22.85±0.56 169.68±3.27* 5.57±1.00* 14.54±4.02短乳桿菌AR247 組 23.12±0.49 168.76±1.62* 1.77±0.70 7.99±2.60

由表4可見，灌胃短乳桿菌AR247 后，血清中的GSH-Px 活力與模型組對照，顯著提高（P＜0.05），提高至正常組的93.99%，CAT 活性和GSH含量雖有增加，但未有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；灌胃VC 后，其GSH-Px 和CAT 顯著高于模型組（P＜0.05），GSH 含量雖有增加，但未有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；所有組中的SOD 的活性除正常組明顯高于模型組（P＜0.05）外，灌胃VC 和短乳桿菌AR247并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.6 短乳桿菌AR247 對小鼠肝臟中的抗氧化水平的影響

如表5所示，與模型組相比，灌胃短乳桿菌AR247 后，其肝臟中的SOD、GSH-Px 活性以及GSH 含量均有顯著性提高（P＜0.05），分別提高至正常組的68.29%，132.86%和77.94%，且高于陽性對照組；CAT 的活性較模型組有提高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表5 短乳桿菌AR247 對小鼠肝臟中的抗氧化水平的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in liver （±s，n=10）

表5 短乳桿菌AR247 對小鼠肝臟中的抗氧化水平的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in liver （±s，n=10）

注：* 表示與模型組相比有顯著性差異，P＜0.05。

?分組 SOD/U·mg-1 蛋白 GSH-Px/U·mg-1 蛋白 CAT/U·mg-1 蛋白 GSH/mg·mg-1 蛋白正常組 158.40±7.78* 1 342.42±219.61* 264.72±42.62* 198.16±10.85*模型組 53.82±5.01 350.00±108.34 56.90±13.70 124.39±11.50陽性對照組 82.87±13.40* 1 527.33±70.91* 74.57±10.56 135.95±88.33短乳桿菌AR247 組 108.17±6.33* 1 783.22±122.11* 61.29±16.20 154.44±6.37*

2.7 短乳桿菌AR247 對小鼠腦中的抗氧化水平的影響

由表6可見，與模型組相比，灌胃短乳桿菌AR247 后，其腦中的SOD 活性和GSH 含量均有顯著性提高（P＜0.05），且恢復至正常水平；GSHPx 和CAT 的活性較模型組稍有提高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。陽性對照對腦的氧化損傷也未見顯著改善。

表6 短乳桿菌AR247 對小鼠腦中的抗氧化水平的影響（±s，n=10）Table 6 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in brain （±s，n=10）

表6 短乳桿菌AR247 對小鼠腦中的抗氧化水平的影響（±s，n=10）Table 6 Effect of L.brevis AR247 on antioxidant status in brain （±s，n=10）

注：* 表示與模型組相比有顯著性差異，P＜0.05。

分組 SOD/U·mg-1 蛋白 GSH-Px/U·mg-1 蛋白 CAT/U·mg-1 蛋白 GSH/mg·mg-1 蛋白正常組 17.96±3.82 23.60±2.96* 66.88±1.70* 75.40±5.12*模型組 12.96±0.38 8.32±2.53 34.52±1.85 38.02±2.90陽性對照組 16.14±2.58 14.22±4.38 78.99±12.54* 47.50±5.65*短乳桿菌AR247 組 20.13±2.34* 12.39±1.79 46.99±25.64 70.11±3.74*?

2.8 短乳桿菌AR247 對小鼠免疫水平的影響

細胞因子IL-2 和TNF-α 是兩個重要的介導免疫反應的細胞因子。IL-2 具有很多的免疫增強作用，如促進T、B 細胞、NK 細胞和單核細胞的增殖，增強T 細胞、NK 細胞的細胞毒性。TNF-α 是一種具有抗腫瘤和免疫調節(jié)活性的細胞因子，被認為是一種重要的宿主防御腫瘤的細胞因子[28]。如圖3所示，與模型組相比，短乳桿菌AR247 可以顯著提高IL-2 的含量（P＜0.05），提高至正常組的104.50%，優(yōu)于VC；但其TNF-α 與模型組沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而VC 組恢復TNF-α 至正常水平。

圖3 短乳桿菌AR247 對小鼠免疫的影響（±s，n=10）Fig.3 Effect of L.brevis AR247 on immune function （±s，n=10）

3 結論

研究指出，自由基是機體的正常代謝產物，在平衡狀態(tài)下對機體沒有損傷，但平衡打破后，自由基便會產生破壞作用，引起疾病。

本試驗通過對已知具有抗氧化活性的短乳桿菌AR247 的無細胞提取物、菌體表面成分和胞內組分進行分析，得到了其胞外的抗氧化成分多在水溶液中，同時胞內的抗氧化能力也很高的結論，但具體成分仍需要進一步試驗證明。

本文進一步研究了短乳桿菌AR247 對D-半乳糖誘導的早衰小鼠的保護作用，結果表明，短乳桿菌AR247 能夠顯著提高衰老小鼠體重和腦指數，提高血清、腦組織和肝組織的SOD 活性、GSH-PX 活性、CAT 活性，降低MDA 含量，其中肝臟中MDA 含量降至正常組的66.13%，表明短乳桿菌AR247 可延緩衰老小鼠機體器官退化，可清除機體內的自由基和活性氧，以及提高抗氧化酶活力，且可提高機體的免疫水平。綜上所述，短乳桿菌AR247 具有抗氧化性和抗衰老作用，其機制可能與改善機體的抗氧化功能和增強免疫功能有關。本試驗對短乳桿菌AR247 抗衰老作用的研究，為深入探討其抗衰老機理提供理論基礎和試驗依據，為進一步開發(fā)延緩衰老的功能性食品提高依據。