抹竹膳食補充劑防護小鼠代謝綜合征的試驗研究

付詩堯 陳玉峰 李云虹 張 英

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室浙江省食品加工技術與裝備工程研究中心 杭州310058）

代謝綜合征（MS，Metabolic syndrome），曾被稱為“X 綜合征”，它是一類以體內(nèi)營養(yǎng)代謝紊亂或障礙為特征的慢性疾病的統(tǒng)稱，是一組包括肥胖、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病或糖耐量受損、血脂紊亂和高血壓等多種危險因素的臨床癥候群[1]。根據(jù)2011年流行病學數(shù)據(jù)統(tǒng)計，世界患MS 的成人數(shù)量高達20%～30%[2]。在我國，2012年成人MS 患病率為11%，而在高血壓、糖尿病或肥胖的人群中，MS 發(fā)病率高達50%～80%[3]。現(xiàn)代生活方式中，高碳水化合物和高脂肪食物的攝入增加，膳食纖維及植物化學素攝入的減少以及運動量的減少，使得代謝綜合癥的發(fā)病率急劇上升，成為威脅人類健康的公共問題。

世界衛(wèi)生組織（WHO）和各國政府的膳食指南都倡導增加水果和蔬菜的食物攝入量以應對當今世界的慢病高發(fā)[4]。果蔬中起主要作用的物質是以黃酮和酚酸類化合物為代表的植物化學素，是植物的次生代謝產(chǎn)物，又稱非營養(yǎng)素。大量研究報道了這類植物化學素具有降低脂質吸收、降血糖和抗炎、減肥等功效，其作用可能通過抑制胰脂肪酶、淀粉酶和葡萄糖苷酶等機制實現(xiàn)[5-7]。

竹葉在我國具有悠久的藥用和食用歷史，竹葉包裹的粽子被譽為人類歷史上最古老的半方便食品?！侗窘?jīng)逢原》記載：“竹葉兼行肌表，故能療瘡殺蟲”[8]。抹竹中含有諸多對人體有益的生物活性物質，尤其是黃酮、酚酸、萜類、多糖等，可以起到抗氧化、增強免疫、調(diào)節(jié)脂代謝和防治心血管疾病等功效[9-10]。筆者科研團隊創(chuàng)制的竹葉抗氧化物已于2004年列入國標GB 2760 作為食品添加劑使用，竹葉黃酮也于2014年被政府相關部門批準作為“新食品原料”。

抹竹是筆者科研團隊最新研發(fā)的專利產(chǎn)品[11]，它是一種以鮮竹葉為原料制得的平均粒徑介于800～5 000 目，膳食纖維總量＞70%、木質素含量＞20%、礦物質（灰分）＞7%的天然超微粉末。抹竹具有竹葉獨特的清香和穩(wěn)定的翠綠色澤，可廣泛應用于食品工業(yè)中，如蛋糕、曲奇、冰淇淋和巧克力等，尤其在高溫加工食品中更具優(yōu)勢。

本研究選擇2 種原料來源的抹竹，即苦竹-抹竹和冷箭竹-抹竹，以市售抹茶為參照，通過高脂膳食誘導建立小鼠代謝綜合癥模型，并將試樣植入高脂飼料中，進行為期12 周的膳食干預試驗，探究抹竹對小鼠MS 的改善作用及可能的作用機制，并考察抹竹與抹茶在生物學效應上的異同，為抹竹作為食品原料、功能食品配料和/或膳食補充劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料與實驗動物

抹竹（Matzhu）：實驗室自制，是以新鮮竹葉為原料制得的一種色澤明亮翠綠的超微粉末，具有典型的竹葉清香，制作方法參照文獻[11]。本研究使用竹葉原料分別為來自四川雅安的苦竹和冷箭竹，苦竹-抹竹的膳食纖維含量為77%，總黃酮2.44%，總酚3.93%；冷箭竹-苦竹的膳食纖維含量為70%，總黃酮1.94%，總酚為3.10%；兩者的平均粒徑均為1 000 目。

抹茶（Matcha）：市售一級品，由浙江省茶葉集團股份有限公司提供。色澤嫩綠稍黃，具有明顯海苔香，總膳食纖維含量為64%，平均粒徑為1 000目。

C57BL/6 小鼠雄性（6 周齡，體重18～20 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號為SCXK（滬）2012-0002）。高脂飼料（60 kcal%，TP23300）和基礎飼料（10 kcal %，TP23302）由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，含有不同抹竹和抹茶添加水平的高脂飼料也委托該公司定制。

1.2 儀器與試劑

儀器設備：Eon 酶標儀，美國BioTek 儀器有限公司；血糖測定儀，德國羅氏公司；3K-15 離心機，德國Sigma 公司；cobasR8000 全自動生化分析儀，德國羅氏公司；Bluepard 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；T10 高速組織勻漿機，德國IKA公司；JA21002 分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Nikon 80i 顯微鏡，日本尼康公司。

化學試劑：超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、游離脂肪酸（FFA）試劑盒，南京建成生物科技有限公司；胰島素Elisa 試劑盒購自DECO 杭州至瑞生物科技有限公司。

腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒、單核細胞趨化因子（MCP-1）試劑盒、瘦素（Leptin）試劑盒、脂聯(lián)素（ADP）試劑盒、脂多糖（LPS）試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司。

1.3 試驗動物分組與劑量設置

將60 只雄性C57BL/6 小鼠用基礎飼料適應性喂養(yǎng)5 d，選取正常進食、飲水的健康小鼠納入試驗。按體重隨機分為6 組，每組10 只。試驗期間，每5 只小鼠為一籠，在光照周期12 h、溫度23℃±2 ℃、相對濕度50%～70%的飼養(yǎng)環(huán)境下，自由進食飲水，飼養(yǎng)12 周。

將抹竹和抹茶分別按相應比例加入高脂飼料中，委托飼料供應商加工成試驗飼料。動物試驗分組及劑量配置見表1。

表1 實驗小鼠分組及劑量配制Table 1 Grouping and dosing of experimental mice

1.4 檢測指標

1.4.1 體重和各臟器質量 在12 周的飼養(yǎng)期間，每周稱重1 次，每兩天投放一次飼料，并記錄前次飼料剩余量和此次投放量，得到小鼠每天攝食量數(shù)據(jù)。試驗結束時，將禁食16 h 的小鼠用CO2安樂死，取血后解剖，分別取出肝臟、腎臟、脾臟、腎周脂肪和附睪脂肪，迅速稱重并記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 血清生化指標 將收集到的小鼠血液于室溫下靜置2 h，然后4 ℃下以3 000 r/min 離心分離10 min，取上清。采用相應試劑盒在羅氏8 000 全自動生化分析儀中檢測各組小鼠的血清總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）和游離脂肪酸（FFA）等指標。

1.4.3 胰島素抵抗相關指標 通過測定小鼠的空腹血糖（FBG）和空腹胰島素水平（FINS）可計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOME-IR=FBG（mmol/L）×FINS （mIU/L）/22.5。FBG 采用血糖儀及配套的血糖試紙檢測。FINS 用酶聯(lián)法檢測（按試劑盒說明書操作）。

胰島素耐受試驗（ITT）：小鼠在飼養(yǎng)到第12周時，禁食10 h 后，腹腔注射胰島素溶液（0.75 U/kg.BW），然后尾靜脈采血，用血糖儀分別檢測注射前（0 min）和注射后30，60，90，120 min 的血糖值。測試結束后，恢復供食。

葡萄糖耐量（GTT）測試為，小鼠在飼養(yǎng)到第12 周時，禁食12 h 后，腹腔注射葡萄糖溶液（1.5 g/kg.BW），然后尾靜脈采血，用血糖儀檢測注射前0 min）和注射后30，60，90，120 min 的血糖值。測試結束后，恢復供食。

1.4.4 肝臟氧化應激水平 小鼠處死后，迅速解剖取肝臟，盡量吸掉肝臟表面的血液，取小部分加4 ℃生理鹽水高速勻漿制成10%勻漿液，3 000 r/min 離心20 min 取上清液，-80 ℃下保存，用以測定肝勻漿中的SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平。按試劑盒說明書操作。

1.4.5 組織病理學切片 取小鼠的肝臟和附睪脂肪于4%的中性甲醛固定液中，經(jīng)過乙醇梯度脫水，再進行浸蠟包埋制成石蠟切片，然后經(jīng)蘇木精-伊紅染色（H&E 染色）后，采用光學顯微鏡觀察肝臟及脂肪的病理情況。

1.4.6 細胞分泌因子及炎癥因子 采用Elisa 法檢測小鼠血清瘦素（LEP）、脂聯(lián)素（ADP）、脂多糖（LPS）、白細胞介素IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNFα）和單核細胞趨化因子（MCP-1）的水平。按試劑盒說明書操作。

1.4.7 腸道菌群 12 周試驗結束后，每組隨機取3 只小鼠的結腸糞便，通過提取糞便中腸道微生物的DNA 進行PCR 擴增，用Illumina PE250 進行高通量測序，鑒定其腸道微生物的類別及豐度。

2 結果與分析

2.1 抹竹對實驗小鼠體重和臟器的影響

各組小鼠的體重變化如圖1所示。試驗開始時（第0 周），各組體重無顯著差異。第12 周時，高脂組（HFD）小鼠體重明顯增加，顯著高于基礎飼料組（Bas-C）；抹竹和抹茶的添加均可一定程度上改善高脂膳食誘導的小鼠體重過度增長。4 個試驗組中，以2.5%苦竹-抹竹組（2.5% BP1）的小鼠體重增長最為緩慢，第12 周時平均體重較HFD組下降了10.9%（P＜0.001）。值得注意的是，當其添加量增加一倍時（5.0% BP1 組），控制體重的效果反而不明顯。2.5%抹茶（2.5% Matcha）對小鼠體重的控制效果僅次于同等劑量的苦竹-抹竹，小鼠體重較HFD 組下降了7.5%（P＜0.001）。2.5%冷箭竹-抹竹組（2.5% BP2）的減重效果介于同等劑量的苦竹-抹竹和抹茶之間。

圖1 實驗小鼠的平均體重增長曲線Fig.1 The average weight growth curve of experimental mice

小鼠體重的增加反映在機體內(nèi)部即為組織和臟器質量的增加。機體的能量以甘油三酯的形式儲存在白色脂肪組織中，而白色脂肪主要存在于機體的皮下、器官（附睪、腎周等）周圍和腸系膜處[12]。各組小鼠器官和組織的質量差異結果如圖2所示。圖2a 和圖2b 為小鼠肝臟和腎臟的質量對比，其中HFD 組小鼠肝、腎質量都明顯高于Bas-C 組；與HFD 組相比，僅有2.5% BP1 組和2.5%Matcha 組小鼠的肝臟和腎臟質量顯著降低，表明2.5%苦竹-抹竹和抹茶對小鼠肝腎質量的控制效果較好；添加了抹竹與抹茶的各試驗組小鼠的脾臟質量均顯著低于高脂組，其中2.5%抹茶組與高脂組相比有極顯著差異（P＜0.001），如圖2c 所示?？梢姡ú柙诳刂颇I臟和脾臟質量增長方面的效果最佳。

腎周脂肪和附睪脂肪是小鼠體內(nèi)質量最大，且與肥胖密切相關的兩個脂肪組織。對于腎周脂肪而言，2.5% BP1 組顯著低于高脂組 （P＜0.01），而其余3 個試驗組均無顯著性差異；對于附睪脂肪，2.5% BP1 和2.5% BP2 均表現(xiàn)出減少附睪脂肪積累的作用，且前者效果更好，質量減少了18%。見圖2d、圖2e。

圖2 12 周試驗結束時小鼠部分器官和組織的質量Fig.2 Weight of some organs and tissues in mice on the end of test

2.2 抹竹對實驗小鼠血脂單脂質水平的影響

12 周飼喂結束時取小鼠血清，測試血生化指標，包括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLc）、游離脂肪酸（FFA），結果統(tǒng)計于表2。

高脂飲食導致小鼠體脂累積增多的同時，會引起血液中TG、TC 和LDL-c 及FFA 水平的升高，并會一定程度地降低HDL-c 水平。由表2可知，2.5%的抹茶降TG 效果最佳，膳食干預3 個月后TG 水平接近正常飼料組，抹竹降TG 的效果則不明顯；但降TC 效果最顯著的是2.5%苦竹-抹竹，其次是2.5%抹茶；在2.5%的添加劑量下，苦竹-抹竹、冷箭竹-抹竹和抹茶均能明顯降低小鼠的LDL-c 水平，但當苦竹-抹竹的添加量提高到5.0%時其作用反而弱化；從HDL-c 的數(shù)據(jù)看，4 個試驗組均表現(xiàn)出顯著的提升作用，且以抹茶為佳。

由于糖脂代謝失衡，肥胖小鼠體內(nèi)的游離脂肪酸（FFA）含量會顯著增加。表2數(shù)據(jù)顯示，各試驗組均有效控制了FFA 水平的增加，其中抑制效果最好的是2.5%的抹茶，其次同等劑量的抹竹，苦竹-抹竹的高劑量（5.0%）反而相對表現(xiàn)最弱。

綜合上述各項指標，在4 個試驗組中，2.5%的苦竹-抹竹和同等劑量的抹茶降血脂效果比較理想。

表2 試驗結束時抹竹對實驗小鼠血脂水平的影響 （mmol/L，±s，n=10）Table 2 Effect of Matzhu on the blood lipid level of experimental mice on the end test （mmol/L，±s，n=10）

表2 試驗結束時抹竹對實驗小鼠血脂水平的影響 （mmol/L，±s，n=10）Table 2 Effect of Matzhu on the blood lipid level of experimental mice on the end test （mmol/L，±s，n=10）

注：*a，b，c，d 標示組間不同差異。

組別指標 1 2 3 4 5 6 Bas-C HFD 2.5% BP1 5.0% BP1 2.5% BP2 2.5% Matcha TG 1.11±0.17 a 1.30±0.16 b 1.25±0.16 b 1.35±0.16 b 1.32±0.17 b 1.17±0.1 a TC 3.05±0.16 a 4.23±0.17 b 3.65±0.23 c 4.08±0.19 bd 4.06±0.20 bd 4.03±0.15 d LDL-c 0.31±0.04 a 0.44±0.03 b 0.36±0.04 c 0.40±0.03 bc 0.39±0.06 c 0.39±0.04 c HDL-c 2.86±0.13 a 2.57±0.13 b 2.82±0.13 a 2.90±0.11 a 2.95±0.13 a 3.05±0.14 c FFA 2.11±0.16 a 2.36±0.19 b 1.97±0.23 a 2.01±0.16 a 1.97±0.11 a 1.63±0.13 c?

2.3 抹竹對實驗小鼠胰島素抵抗的改善

12 周試驗結束時小鼠的空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS）測試結果如表3所示。高脂飲食會導致小鼠的FBG 和FINS 升高，HOME-IR 即為胰島素抵抗指數(shù)，其值越大，說明胰島素敏感性越低，胰島素抵抗癥狀越明顯[13]。胰島素抵抗常伴隨著高脂膳食誘導的肥胖發(fā)生[14]，同時其也是代謝綜合癥的典型癥狀之一，主要表現(xiàn)為正常劑量的胰島素無法產(chǎn)生其應有的生物學功效，胰島素的下游靶器官無法正常響應。從而使得肌肉細胞中的葡萄糖吸收減少，肝臟的葡萄糖輸出增加，共同導致機體中血糖濃度的升高等一系列問題[15]。表3中結果顯示，2.5%苦竹抹竹和2.5%冷箭竹抹竹均降低了小鼠空腹血糖水平和空腹胰島素水平，表明二者能較好地改善高脂膳食引起的胰島素抵抗。而5.0% BP1 與2.5% Matcha 組則無顯著的改善作用。

圖3顯示了試驗結束（第12 周）時小鼠胰島素敏感性的變化。在胰島素耐量試驗（ITT）中，由于受高脂膳食的影響，HFD 組小鼠的胰島素敏感性降低，當注射胰島素后，胰島素不能迅速起作用促進血液中葡萄糖的分解利用。而經(jīng)抹竹和抹茶干預后，小鼠的胰島素敏感均得到改善，在各試驗組中，以2.5%苦竹-抹竹的效果最佳。在糖耐量試驗（GTT）中，向小鼠注射葡萄糖溶液后，血液中的葡萄糖水平會暫時性升高，隨著胰島素等因子的作用，葡萄糖被慢慢分解利用，從而恢復到初始水平。而高脂小鼠由于產(chǎn)生了胰島素抵抗，所以無法像正常小鼠一樣快速分解利用葡萄糖，故血糖含量會陡增、并且下降速度緩慢，2.5%苦竹-抹竹組顯著改善了這一癥狀（P＜0.001），其余試驗組的效果不顯著。

表3 抹竹對實驗小鼠空腹血糖和空腹胰島素的影響 （±s，n=10）Table 3 Effect of Matzhu on FBG and FINS in experimental mice （±s，n=10）

表3 抹竹對實驗小鼠空腹血糖和空腹胰島素的影響 （±s，n=10）Table 3 Effect of Matzhu on FBG and FINS in experimental mice （±s，n=10）

注：*a，b，c 標示組間不同差異。

?組別 FBG/mmol·L-1 FINS/mU·L-1 HOME-IR Bas-C 3.81 ± 0.56 a 5.28 ± 0.72 a 0.94 ± 0.19 a HFD 6.89 ± 0.70 b 6.48 ± 0.76 b 1.99 ± 0.39 b 2.5% BP1 5.88 ± 0.90 c 5.31 ± 0.62 a 1.39 ± 0.30 c 5.0% BP1 6.08 ± 0.83 bc 6.21 ± 0.74 b 1.68 ± 0.35 bc 2.5% BP2 5.84 ± 0.87 c 5.44 ± 0.67 a 1.41 ± 0.30 c 2.5% Matcha 6.93 ± 0.96 b 6.01 ± 0.66 ab 1.87 ± 0.42 b

圖3 實驗小鼠第12 周時胰島素敏感性的變化Fig.3 Insulin sensitivity changes in experimental mice at twelfth weeks

2.4 抹竹對實驗小鼠肝臟氧化應激的影響

抹竹和抹茶12 周的膳食干預對小鼠肝臟氧化應激的影響如表4所示。

肝臟中SOD 和GSH-Px 是體內(nèi)主要的抗氧化酶，有較強的清除自由基的能力。表4數(shù)據(jù)顯示，HFD 組、5.0%BP1 組以及2.5% Matcha 組小鼠的SOD 水平明顯高于正常組，而2.5%的BP1 和BP2 兩組的SOD 活力與正常組相當；表明在2.5%這個劑量下苦竹抹竹和冷箭竹抹竹均能發(fā)揮較好的抗氧化功效，能幫助機體有效清除過多的自由基。在GSH-Px 水平上，2.5%的BP1 和BP2 兩組介于正常組和高脂組之間，而5.0% BP1 和2.5%M 組則顯著高于高脂組。MDA 為脂肪的氧化產(chǎn)物，可用于評價機體的氧化損傷程度[16]，其含量越高表明機體的氧化損傷越嚴重。從降低脂質過氧化物產(chǎn)物的水平看，抹竹的效果普遍優(yōu)于抹茶，且以苦竹為佳。

氧化應激是機體受到各種有害因素刺激后，體內(nèi)的活性氧自由基（ROS）大量產(chǎn)生。ROS 是導致胰島素抵抗的重要原因，長期的高脂高糖飲食會導致機體產(chǎn)生大量ROS[17]。有研究表明，為了抵抗大量產(chǎn)生的ROS，機體的抗氧化酶也會相應地代償性增加，以抗衡自由基對機體的損傷[18]。但隨著氧化應激程度的不斷升高，抗氧化酶的活力代償性的增加已無法阻止自由基損傷，這會最終導致酶活力降低，機體氧化損傷加劇。從表4的數(shù)據(jù)綜合來看，高脂飲食使得小鼠機體的氧化應激程度增大，而抹竹的膳食干預能有效地降低機體的氧化應激反應，尤以2.5%苦竹-抹竹的干預效果為佳。

表4 抹竹對實驗小鼠肝臟氧化應激指標的影響 （±s，n=10）Table 4 Effect of Matzhu on oxidative stress index in liver of experimental mice （±s，n=10）

表4 抹竹對實驗小鼠肝臟氧化應激指標的影響 （±s，n=10）Table 4 Effect of Matzhu on oxidative stress index in liver of experimental mice （±s，n=10）

注：*a，b，c，d 標示組間不同差異。

?組別 SOD/U·mg-1 蛋白 GSH-Px/U·mg-1 蛋白 MDA/nmol·mg-1 蛋白Bas-C 78.88±3.99 a 318.85±19.83 a 0.34±0.02 a HFD 84.32±2.37 b 387.25±13.84 b 0.38±0.03 b 2.5% BP1 77.53±5.38 a 377.22±13.54 b 0.32±0.03 a 5.0% BP1 84.06±4.53 b 415.33±16.95 c 0.31±0.04 a 2.5% BP2 78.91±5.65 a 379.79±16.52 b 0.34±0.04 a 2.5% Matcha 92.38±5.22 c 462.94±17.18 d 0.35±0.03 ab

2.5 抹竹對實驗小鼠細胞因子水平的影響

抹竹對高脂膳食誘導的代謝綜合征小鼠血液中脂代謝相關的細胞因子水平的影響見表5。

瘦素（LEP）是脂肪細胞分泌的一種循環(huán)激素，主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過抑制神經(jīng)肽Y 的合成以降低食欲，減少能量攝入，從而達到減肥降脂的功效[19]。瘦素對胰島素的調(diào)節(jié)是雙向的，一方面通過作用于胰島細胞上的受體抑制胰島素的分泌，另一方面又對一些胰島素調(diào)節(jié)的代謝有拮抗作用。因此，瘦素抵抗常伴隨著胰島素抵抗（IR）發(fā)生。有研究表明瘦素過高或過低都可能導致IR[20]。表5的數(shù)據(jù)顯示，高脂組小鼠的LEP 水平明顯高于正常組，說明高脂飲食使小鼠產(chǎn)生了瘦素抵抗。而2.5%的苦竹-抹竹表現(xiàn)出降低LEP 水平的最佳效果，其次是2.5%的抹茶，然后是2.5%的冷箭竹-抹竹，高劑量（5.0%）苦竹-抹竹的效果反而不顯著。

脂聯(lián)素（ADP）與肥胖和糖脂代謝密切相關，有研究表明肥胖人群中ADP 的水平顯著降低，認為脂聯(lián)素含量與肥胖呈負相關[21]。葛茜等[22]的動物試驗也得到類似的結論，肥胖小鼠體內(nèi)的血清脂聯(lián)素水平明顯下降。從表5的數(shù)據(jù)可知，高脂組小鼠的ADP 含量顯著低于正常組，添加了抹竹和抹茶的4 個試驗組均顯著升高了小鼠血清ADP 的水平，其中尤以2.5%的苦竹-抹竹和抹茶的效果最佳，干預后小鼠的ADP 值接近正常組小鼠。

脂多糖（LPS）主要由腸道中的革蘭氏陰性菌裂解產(chǎn)生，有研究表明脂多糖與肥胖小鼠體內(nèi)炎癥因子的表達上調(diào)密切相關[23]。表5數(shù)據(jù)顯示，高脂組小鼠的脂多糖含量顯著高于正常組，高脂飼料中強化抹竹和抹茶均能顯著降低肥胖小鼠血清中的脂多糖水平，且2.5%苦竹抹竹的效應極顯著（P＜0.001），LPS 值相較高脂組下降了27.8%。表明抹竹與抹茶的膳食干預能有效改善高脂飲食引起的細胞因子的分泌紊亂。

表5 抹竹對實驗小鼠血液中脂代謝相關細胞因子表達的影響 （x±s，n=10 ）Table 5 Effect of Matzhu on expression of adipocytokines in experimental mice blood （x±s，n=10）

2.6 抹竹對實驗小鼠血清炎癥因子水平的影響

12 周試驗結束時，各組小鼠的血清炎癥因子水平如圖4所示。

許多研究證明，肥胖與2 型糖尿病及炎癥關系密切，還有研究表明肥胖是由于機體長期處于低炎癥浸潤狀態(tài)，即慢性炎癥[24]。MCP-1 是一種趨化因子，肥胖者體內(nèi)增大的脂肪組織會釋放大量的MCP-1，從而誘導大量吞噬細胞進入脂肪組織[25]，并釋放出大量炎癥因子。其中IL-6 和TNFα 是與肥胖密切相關的兩種促炎因子，當二者水平上升時，表示機體炎癥浸潤程度增大。有研究者在肥胖和胰島素抵抗的人體以及動物模型中均觀察到了顯著升高的TNF-α 水平，且當體重下降時TNF-α 水平也呈下降趨勢[26]，表明TNF-α 水平與肥胖和胰島素抵抗呈明顯正相關。

由圖4可見，高脂組小鼠的IL-6、TNF-α 和MCP-1 含量較正常組顯著上升，說明高脂組的肥胖小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了炎癥。添加了抹竹和抹茶的高脂組小鼠，其IL-6 和TNF-α 含量均顯著降低，表明不同劑量的抹竹和抹茶均能顯著抑制肥胖導致的促炎因子（IL-6、TNF-α）的分泌。2.5%的苦竹-抹竹、冷箭竹-抹竹和抹茶均能顯著降低MCP-1的含量，而高劑量（5.0%）的苦竹-抹竹反而效果不顯著。表明用適當劑量的抹竹與抹茶進行膳食干預，能顯著改善肥胖小鼠體內(nèi)的炎癥浸潤現(xiàn)象。

圖4 抹竹對實驗小鼠血清炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of Matzhu on expression of serum inflammatory factors in experimental mice

2.7 實驗小鼠肝臟和脂肪的切片觀察結果

長期攝入高脂膳食會導致脂肪肝的形成，故HFD 組小鼠的肝臟質量明顯高于正常組。高脂膳食中強化2.5%的苦竹-抹竹和抹茶3 個月后，小鼠的肝臟質量較HFD 組顯著下降（見圖2a）。將第12 周時采集的各試驗組小鼠的肝臟進行H&E 染色切片觀察，結果如圖5所示。

圖5 實驗小鼠的肝臟H&E 染色切片（400×）Fig.5 H&E staining sections of liver in experimental mice （400×）

與正常組（圖5a）小鼠相比，HFD 組（圖5b）小鼠的肝臟中明顯可見許多大小不一的白色脂滴，表明高脂飲食使得肝臟的脂代謝出現(xiàn)障礙，攝入的大量脂肪無法順利被分解而在肝臟中逐漸沉積。添加了抹竹的高脂膳食組（圖5c、圖5d、圖5e）和添加抹茶的高脂膳食組（圖5f）小鼠的肝臟脂滴數(shù)量均明顯少于高脂模型組，且不見體積較大的白色脂滴。其中2.5%BP1（圖5c）和2.5% Matcha組（圖5f）的肝臟中幾乎沒出現(xiàn)不規(guī)則的白色脂滴，表明肝細胞基本未發(fā)生脂肪變性。而2.5%BP2 （圖5d）和2.5% Matcha 組（圖5e）的肝臟細胞間隙還偶爾可見體積較小的白色脂滴。上述結果提示，抹竹和抹茶均有利于改善高脂飼料誘導的肝臟脂肪堆積，降低脂肪肝的風險，尤以2.5%苦竹-抹竹和抹茶的效果為佳。

圖6為各組小鼠附睪脂肪組織的H&E 染色切片。從中可見，正常組（a 圖）的脂肪細胞體積較小，視野中的脂肪細胞數(shù)量較多，而HFD 組（b 圖）小鼠由于長期攝食高脂飼料，脂肪細胞的體積顯著大于正常組。膳食中添加了抹竹和抹茶后，各組小鼠附睪脂肪細胞體積均表現(xiàn)出明顯減小的趨勢，其中以2.5%的苦竹-抹竹效果最為顯著。

圖6 實驗小鼠的脂肪組織H&E 染色切片 （200×）Fig.6 H&E staining sections of adipose tissue in experimental mice （200×）

2.8 對實驗小鼠的腸道菌群的影響

選取正常組、HFD 組和2.5%的苦竹-抹竹、冷箭竹-抹竹和抹茶這5 組實驗小鼠的結腸糞便，運用高通量測序技術，分析測定其腸道菌群的結構，統(tǒng)計結果如圖7所示。

通過高通量測序得到不同組別實驗小鼠腸道微生物的OTUs，經(jīng)基因庫比對和物種注釋后發(fā)現(xiàn)，受試小鼠的OUTs 分屬以下9 個門：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍細菌（Cyanobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）及Saccharibacteria。其中，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）這5 個門為所有組別共有。

由圖7可知，5 組實驗小鼠的腸道微生物中，厚壁菌門和擬桿菌門占絕對的數(shù)量優(yōu)勢。美國華盛頓大學Jeffrey I.Gordon 教授等[27]的研究表明，肥胖小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度的比值（F/B 比值）比瘦者顯著增高。而當肥胖小鼠變瘦后，其F/B 值會降低[28]。將擬桿菌門和厚壁菌門的豐度值統(tǒng)計后作出各組實驗小鼠的F/B 相對豐度變化，結果如圖8。

HFD 組小鼠的F/B 比值明顯高于正常組，表明高脂膳食的確會引起小鼠腸道菌群的紊亂。2.5%苦竹-抹竹（BP1）組小鼠的F/B 值顯著低于高脂組，表明其對小鼠的腸道菌群結構有較好的調(diào)節(jié)作用，可修正高脂飲食帶來的不良影響；但2.5%冷箭竹-抹竹（BP2）和抹茶（M）組的F/B 值不降反增，甚至高于高脂組，這可能是由于測試選取的樣本數(shù)不夠，且不同小鼠間腸道菌群的結構差異較大導致。綜上結果表明，同等劑量的冷箭竹-抹竹和抹茶對小鼠腸道菌群的改善作用不明顯，且不同原料來源的抹竹其生物學效應存在顯著差異。

圖7 抹竹對實驗小鼠腸道菌群結構的影響Fig.7 Effect of Matzhu on intestinal microflora in experimental mice

圖8 抹竹對實驗小鼠厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值的影響Fig.8 Effect of Matzhu on the ratio of relative abundance of Firmicutes to Bacteroidetes in experimental mice

表6為各組實驗小鼠的腸道菌群的豐富性和多樣性的表征指標。常用于表示動物腸道菌群的群落豐富度和多樣性的指數(shù)有以下4 種：Shannon、Chao、Ace 和 Simpson。其 中 Shannon 和Simpson 主要用于評價微生物群落的均勻性和多樣性[29]。Shannon 指數(shù)的值越大，Simpson 指數(shù)的值越小，表明菌落結構的多樣性越低。Chao 和Ace指數(shù)常用于表征的微生物群落的豐富度，且二者的值與群落豐富度呈正相關。由表6結果可知，高脂飲食使小鼠腸道微生物的Chao 和Ace 指數(shù)明顯下降，表明菌群的豐富度顯著下降，經(jīng)過抹竹和抹茶的膳食干預后，腸道菌群的豐富度明顯上升，抹茶組菌群的豐度甚至超過了正常組。Shannon 指數(shù)上，高脂膳食并未有明顯影響，但苦竹-抹竹和抹茶干預組小鼠的該指數(shù)均較高脂組明顯增加，表明兩組小鼠的腸道菌群多樣性得到明顯提升。Simpson 指數(shù)的變化規(guī)律也證實了2.5%苦竹-抹竹能起到提高小鼠腸道微生物的多樣性作用。

3 討論

代謝綜合征（MS）是一種包含多項心血管疾病危險因素的復雜臨床癥候群，其中肥胖和胰島素抵抗是MS 的核心癥狀[30]。隨著肥胖和2 型糖尿病的流行，近年來MS 的發(fā)病率也在不斷攀升[31]，從而使社會的醫(yī)療健康負擔日益加重，如何根據(jù)“藥食同源”和“治未病”等中華養(yǎng)生理論，從膳食干預的角度出發(fā)，在天然產(chǎn)物和藥食兩用植物中尋找安全有效的功能性成分是一條必由之路。

表6 抹竹對實驗小鼠腸道菌群多樣性和豐富度的影響Table 6 Effect of Matzhu on richness and diversity of gut microbiota in experimental mice

本研究通過高脂膳食誘導小鼠產(chǎn)生代謝綜合癥的相關特征，并觀察不同品種和劑量的抹竹對小鼠MS 癥狀的改善情況及其與抹茶作用效果進行對比。試驗結果表明，膳食中添加抹竹和抹茶可一定程度改善高脂飲食導致的MS 癥狀，整體效果以2.5%苦竹-抹竹為佳。竹種方面，苦竹-抹竹的效果優(yōu)于冷箭竹-抹竹；劑量方面，抹竹改善MS的功效未呈現(xiàn)劑量依賴性增加，低劑量（2.5%）苦竹-抹竹的效果反而優(yōu)于高劑量（5.0%），這提示了將抹竹開發(fā)成膳食補充劑的經(jīng)濟優(yōu)勢。

竹葉中的黃酮、多糖等生物活性成分在降血糖和降血脂方面的功效和機制也多有研究報道。潘靜等[32]研究發(fā)現(xiàn)苦竹葉多糖能有效降低糖尿病模型小鼠的血糖水平，有效促進葡萄糖的利用，并能提高肝糖原儲存量。徐州醫(yī)科大學的研究人員發(fā)現(xiàn)竹葉提取物可通過激活AKT 信號通路和抑制氧化應激來有效改善鏈脲佐菌素造模的大鼠糖尿病癥狀[33]。王勇[34]綜述了植物黃酮類對糖尿病的研究和治療機制，發(fā)現(xiàn)黃酮主要通過抗氧化、抗炎癥來保護胰島β 細胞免受氧化應激損傷，同時黃酮還能抑制α 葡萄糖苷酶的活性，以起到降低空腹血糖水平的效果。沙棘總黃酮被證實可有效降低高脂血癥小鼠的TC、TG 等指標[35]。本研究的試驗結果也表明，2.5%的苦竹-抹竹能顯著降低小鼠的空腹血糖水平，改善其胰島素抵抗癥狀。其作用極有可能是通過其中的黃酮、酚酸類物質降低機體氧化應激反應來實現(xiàn)的。

炎癥與肥胖、胰島素抵抗、血脂代謝異常等MS 風險因素密切相關[36]。TNF-α 是胰島素抵抗病理中的一個關鍵因素，有研究認為TNF-α 可能通過抑制PPARγ 的mRNA 表達，使PPARγ 的水平下降，從而降低其抗炎、促凋亡的功效[37]。此外TNF-α 還能激活胰島中的巨噬細胞釋放更多的IL-1，通過增加一氧化氮合酶的表達起到抑制胰島素的作用[38]。MCP-1 在炎癥加重時會進一步導致巨噬細胞的聚集，從而使炎癥循環(huán)惡化。曾有研究顯示增加膳食纖維的攝入對炎癥的改善有一定效果[39]。本研究結果表明，一定劑量的抹竹和抹茶能顯著降低小鼠血清MCP-1、TNF-α 和IL-6 的水平，因此二者改善代謝綜合癥的良好效果可能與其抑制炎癥反應的不斷惡化密切相關。

高膳食纖維的飲食結構有助于成年人慢性病發(fā)病率的降低[40]，且能更有效地降低青少年兒童的MS 發(fā)病率[41]。Lattimer 等[42]研究者發(fā)現(xiàn)，膳食纖維通過減少宏量元素的消化和吸收并縮短致癌物在腸腔的接觸時間來降低二型糖尿病、心血管疾病和結腸癌的風險。許多研究指出膳食纖維調(diào)節(jié)機體的代謝活動主要是通過改變腸道菌群的結構，并經(jīng)由以下3 種方式實現(xiàn)：增強膽汁酸早期解離、產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸和調(diào)節(jié)炎癥因子[43-44]。抹竹中含有豐富的膳食纖維，本研究結果也充分表明，苦竹-抹竹的干預可有效調(diào)節(jié)MS 小鼠的腸道菌群結構，豐富其多樣性，且能降低其F/B 值。這提示除了竹子化學素的作用外，抹竹還可能通過其豐富的膳食纖維調(diào)節(jié)腸道菌群結構，增加了腸道中有益菌的比例，進而起到改善小鼠代謝綜合癥的作用。

我國素有竹子王國之稱，擁有十分豐富的竹資源，現(xiàn)有竹林面積約720 萬公頃，有500 多個竹子品種。筆者前期探究了5 種不同竹葉：慈竹（N.affinis （Rendle）Keng f.）、綿竹 （B.intermedia Hsueh et Yi）、硫玉竹（Yushania Keng f.）、苦竹（P.amarus （keng）Keng f.）和冷箭竹（B.fangiana Keng f.et Wen）制備得到的抹竹的生物活性成分、產(chǎn)品特性、工藝適性等差異，從中優(yōu)選了2 種，苦竹-抹竹和冷箭竹-抹竹作為本研究的試樣。本研究結果表明，相同劑量下苦竹-抹竹比冷箭竹-抹竹改善MS 的效果更好，提示了不同竹種來源的抹竹改善MS 的效果存在差異。抹竹生物學效應的表現(xiàn)是由其中生物活性成分的作用決定的，因此抹竹中黃酮、酚酸和三萜類等植物化學素含量較高的苦竹-抹竹自然比冷箭竹-抹竹具有更強的改善小鼠MS 的功效。這提示：將黃酮、酚酸等植物化學素含量較高的竹種開發(fā)成抹竹，作為膳食補充劑，將更有益于人們的健康。

竹林與茶園常常相伴而生，二者對生態(tài)環(huán)境的要求基本相同。抹茶的出現(xiàn)改變了人們原有的茶葉食用習慣，近年來其在食品加工業(yè)中的應用被不斷拓展，隨著人們健康意識的加強和消費能力的提高，這種趨勢必將帶動同類型產(chǎn)品的走紅。因此作為抹茶的“姐妹產(chǎn)品”，抹竹在食品工業(yè)中也有極大的應用前景。將抹竹應用于食品加工中可為食品帶來翠綠色澤和清香風味，同時賦予其改善代謝綜合癥的優(yōu)良功效。根據(jù)最新發(fā)布的國民健康數(shù)據(jù)，當前我國的慢性疾病發(fā)病率已高達20%，慢病死亡人數(shù)占死亡人口總數(shù)的83%，以代謝綜合征為代表的慢病癥候群的高發(fā)對國民健康造成巨大威脅，也給經(jīng)濟社會的良性發(fā)展帶來了嚴重挑戰(zhàn)。以“治未病”的觀點看，膳食干預無疑比藥物治療更具優(yōu)勢。將國寶大熊貓的食物開發(fā)成膳食補充劑或食品功能配料，可望在人類社會不斷高發(fā)的慢病防治中發(fā)揮獨特作用。