蝦夷扇貝抗氧化酶SOD和CAT與活品貯藏穩(wěn)定性的關(guān)聯(lián)

周晏琳,劉 洋,李亞烜,閆麗新,田元勇,劉俊榮

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023)

貝類是我國(guó)主要海水養(yǎng)殖品種,根據(jù)中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒,2017年我國(guó)養(yǎng)殖貝類產(chǎn)量1437萬(wàn)余噸,其中,扇貝產(chǎn)量占200萬(wàn)噸[1]。貝類活品流通過程中風(fēng)味品質(zhì)會(huì)持續(xù)下降,嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。冷卻干藏是活品貝類流通的重要方式之一。近年來(lái),針對(duì)貝類捕后品質(zhì)變化機(jī)制的研究陸續(xù)見報(bào)道。團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔在其采捕后至加工凈化前是其風(fēng)味品質(zhì)的易逝期,急性脅迫會(huì)導(dǎo)致蛤仔風(fēng)味急驟下降。

蝦夷扇貝是我國(guó)北方最重要的經(jīng)濟(jì)品種,目前針對(duì)捕后的活品蝦夷扇貝主要研究?jī)?nèi)容包括生化代謝、風(fēng)味變化、菌群結(jié)構(gòu)、免疫因子等[2-4],近年來(lái),國(guó)內(nèi)外關(guān)于貝類抗氧化酶的研究主要圍繞海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)、貝類生長(zhǎng)過程中養(yǎng)殖環(huán)境脅迫及抗氧化體系探索等方面[5-6]展開,而對(duì)于采捕后易逝期內(nèi)抗氧化酶與活品貯藏穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)的研究較少。如鄭堯等人對(duì)捕后活品蝦夷扇貝的流通調(diào)研發(fā)現(xiàn),離水的扇貝從捕撈到凈化的流程為捕撈船、運(yùn)輸船、港口、緩沖池、凈化池,此階段為其易逝期,免疫因子出現(xiàn)應(yīng)答。在此期間,活體頻繁暴露會(huì)造成缺氧等脅迫,此外還有其他脅迫因素的影響如溫度、壓力、機(jī)械振動(dòng)等[2]。

在捕后運(yùn)輸過程中,扇貝受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧自由基等物質(zhì)對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生損傷(包括脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等方面)[7],其體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)迅速作出應(yīng)答,發(fā)生歧化反應(yīng)將其分解成過氧化氫,過氧化氫進(jìn)而會(huì)在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)及過氧化氫酶(CAT)等的作用下分解為水和氧氣,從而消除氧自由基等對(duì)機(jī)體的影響。前期針對(duì)干露對(duì)活品蝦夷扇貝閉殼肌SOD酶活性影響的研究表明,溫度和氧氣對(duì)捕后活品蝦夷扇貝的?；钣休^大影響,同時(shí)閉殼肌中的SOD產(chǎn)生應(yīng)答[8]。

為探究流通過程中活品蝦夷扇貝抗氧化酶活性與其貯藏穩(wěn)定性的關(guān)聯(lián),以蝦夷扇貝為研究對(duì)象,探究其貯藏過程中不同軟體組織的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性、失重率、pH、糖原含量、ATP及其關(guān)聯(lián)化合物含量的變化,以此判斷活品蝦夷扇貝的抗氧化酶活性變化是否能作為扇貝活品品質(zhì)變化的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活品蝦夷扇貝 于2018年4月10日購(gòu)自獐子島集團(tuán)股份有限公司,為當(dāng)日采捕的底播養(yǎng)殖蝦夷扇貝,重量為(122.95±22.88) g/只,殼高(10.68±0.29) cm,殼長(zhǎng)(10.65±0.32) cm,殼寬(2.31±0.18) cm;氫氧化鉀 (優(yōu)級(jí)純)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;Tris、無(wú)水乙醇、氯化鉀、葡萄糖、碘乙酸鈉、蒽酮、HCl、濃硫酸等試劑 皆為分析純。

800 s勻漿機(jī) 美國(guó)WARING公司;HG-200均質(zhì)機(jī) 日本HSIANGTAI公司;高速離心機(jī) 德國(guó)HERMLE Labortechnik GmbH公司;UV-1800PC紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;PHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品冷卻干藏:扇貝到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后分為3組(每組10扇貝)并于4 ℃下干藏3 d,用海水浸濕的布覆蓋(每24 h更換一次)。

采樣及處理:分別于第0、1、及3 d進(jìn)行采樣,取10個(gè)活貝,迅速開殼,將各個(gè)軟體組織分離(包括外套膜、性腺、橫紋肌、鰓、內(nèi)臟團(tuán))后勻漿(10000 r/min,30 s),用液氮速凍,于-40 ℃下貯藏用于后續(xù)研究扇貝各組織的抗氧化酶活、閉殼肌的pH、糖原含量等生化指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 扇貝失重率測(cè)定 分別稱量扇貝貯藏前后的質(zhì)量。失重率的計(jì)算方法如下:

1.3.2 閉殼肌生化指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 pH 取2.0 g肌肉勻漿加入10 mL 20 mmol/L碘乙酸鈉,迅速用玻璃棒充分?jǐn)嚢?靜置25 min后測(cè)定pH,每組設(shè)3個(gè)平行。

1.3.2.2 糖原含量 參考許益民[9]的方法,取2.0 g肌肉勻漿加入4 mL 30% KOH溶液,沸水浴消化20 min。冷卻后加入20 mL無(wú)水乙醇,離心(3000×g,15 min)后取沉淀,用蒽酮比色法測(cè)定糖原含量,每組設(shè)3個(gè)平行。

1.3.2.3 ATP及其關(guān)聯(lián)物(ATP、ADP、AMP、AdR)含量 提取方法:參考Hu等[10]的方法,取1.0 g肌肉勻漿,加入10 mL 5% PCA溶液,用2 mol/L KOH調(diào)pH至2.0～3.5后定容至20 mL,離心(3000×g,5 min)取上清后用0.45 μm濾膜過濾,取4 mL濾液加1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.5),于-40 ℃下貯藏以待后續(xù)分析,每組3個(gè)平行。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取ATP、ADP、AMP和AdR標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,加入少量超純水超聲溶解,再將6種標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合定容至100 mL,即為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液,并依次稀釋為100、50、25、10、5、1、0.5、0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合液。色譜分析:采用高效液相色譜法分析。色譜柱為大連依利特公司(SinoChrom ODS-BP 5 μm,4.6 mm×250 mm);檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器(DAD);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;溫度:35 ℃;流動(dòng)相流速:0.7 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。流動(dòng)相A:0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH6.5),流動(dòng)相B:流動(dòng)相A:甲醇溶液(8∶2)。

1.3.3 粗酶提取與活性測(cè)定

1.3.3.1 粗酶提取 分別取外套膜、性腺、橫紋肌、鰓、內(nèi)臟團(tuán)勻漿各2.0 g,加入5倍體積的0.1 mol/L NaCl 20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)。迅速在10000 r/min下均質(zhì)3次,每次均質(zhì)30 s,間隔30 s后離心10 min(10000×g,4 ℃),取上清夜即為粗酶提取液,整個(gè)操作過程在低溫下進(jìn)行。粗酶蛋白含量用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.3.3.3 CAT酶活測(cè)定 參考Vinagre等方法測(cè)定CAT酶活力[12]。CAT能將H2O2分解成H2O和O2,通過在240 nm下動(dòng)力學(xué)測(cè)定H2O2的吸光度的變化測(cè)得CAT酶活,每組設(shè)3個(gè)平行。CAT酶活定義:組織蛋白每分鐘分解1 mg H2O2的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理,用單因素分析法進(jìn)行方差分析,用Duncan法進(jìn)行組間多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝活品干藏貯藏穩(wěn)定性

2.1.1 干藏過程中失重率的變化 如圖1所示,活品蝦夷扇貝在貯藏過程中失重率明顯升高,在第3 d高達(dá)7%左右。本研究中發(fā)現(xiàn),與原料扇貝相比,干藏扇貝可以觀察到其右殼(底殼)有明顯的液體析出積累現(xiàn)象,同時(shí)伴隨著外套膜收縮即所謂“縮邊”現(xiàn)象;推測(cè)是因?yàn)楦刹剡^程與扇貝的生存環(huán)境完全不同,造成缺水、缺氧等脅迫導(dǎo)致貝體體腔液中水分析出,隨后逐漸蒸發(fā)而流失,扇貝以外套膜收縮的形式啟動(dòng)了防御應(yīng)答機(jī)制。貯藏過程中的失重對(duì)活品經(jīng)濟(jì)價(jià)值有一定的影響。

圖1 干藏過程中活品蝦夷扇貝失重率的變化Fig.1 Mass loss rate of liveP.yessoensis during dry storage

2.1.2 干藏過程中閉殼肌pH的變化 貯藏過程扇貝閉殼肌pH的變化如圖2所示,原料初始pH為7左右,冷卻干藏貯藏1 d內(nèi),扇貝肌肉pH水平保持穩(wěn)定;干藏3 d后,pH降至6.7左右(P<0.05),表明1 d內(nèi)活體扇貝的品質(zhì)保持較高水平,3 d后略有下降。與脊椎動(dòng)物魚類不同,軟體動(dòng)物的無(wú)氧代謝酸性產(chǎn)物除了源于糖原酵解產(chǎn)生的乳酸之外,還有源于其高能磷酸化合物即磷酸精氨酸代謝產(chǎn)物即章魚堿[13]。上世紀(jì)70年代,Doris等對(duì)扇貝(Placopectenmagellanicus)閉殼肌冰藏條件下的無(wú)氧代謝進(jìn)行研究,觀察到能量代謝產(chǎn)物章魚堿的積累與閉殼肌pH下降有顯著關(guān)聯(lián)[14];對(duì)于貝類活品而言,貯藏條件決定了活體呼吸代謝方式,干藏條件下,活體進(jìn)行無(wú)氧呼吸,Kawabe等對(duì)干藏牡蠣進(jìn)行的研究,發(fā)現(xiàn)終極產(chǎn)物醋酸、丙酸或琥珀酸的積累同樣與牡蠣血淋巴的pH下降有關(guān)[15]。項(xiàng)目組劉慧慧等[16]的研究則發(fā)現(xiàn),10 d的冷卻干藏,菲律賓蛤仔未發(fā)現(xiàn)pH下降趨勢(shì),不排除是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間干藏過程氨氮積累對(duì)pH下降產(chǎn)生的補(bǔ)償作用。

圖2 干藏過程中活品蝦夷扇貝閉殼肌pH的變化Fig.2 Changes of pH of live P. yessoensisadductor muscle during dry storage注:標(biāo)有不同小寫字母者表示同一貯藏條件不同時(shí)間下有顯著性差異(P<0.05);圖3～圖6同。

圖3 干藏過程中活品蝦夷扇貝閉殼肌糖原含量的變化Fig.3 Changes of glycogen of liveP. yessoensis adductor muscle during dry storage

2.1.3 干藏過程中閉殼肌糖原含量的變化 干藏過程中扇貝閉殼肌糖原含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05),初始點(diǎn)閉殼肌的糖原含量在21.5 mg/g左右,在第3 d下降至19 mg/g左右,但整體依然維持在較高水平(圖3)表明在3 d內(nèi)的冷卻干藏扇貝可以通過分解糖原維持機(jī)體正常運(yùn)行,同時(shí),結(jié)合其它生化指標(biāo)的變化,在冷卻干藏1 d內(nèi)扇貝的貯藏穩(wěn)定性較好,至3 d后,貯藏穩(wěn)定性有所下降。糖原是雙殼貝類重要的儲(chǔ)能物質(zhì)和呈味物質(zhì),可以抵御冬季食物匱乏,能夠反映貝類的生長(zhǎng)狀態(tài)[17]。在無(wú)氧初期,能量供應(yīng)主要依賴糖酵解途徑,糖原降解產(chǎn)物為opines等物質(zhì)[18]。在干藏貯藏條件下,扇貝受到嚴(yán)重的缺氧和饑餓脅迫,使其最先分解糖原以維持機(jī)體正常運(yùn)行。Uzaki等對(duì)缺氧環(huán)境下菲律賓蛤仔代謝及糖原含量變化的研究發(fā)現(xiàn),與含氧量正常條件下的蛤仔相比,在氧氣不足的條件下,蛤仔中的糖原含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)[19]。Hummel等在對(duì)處于干藏條件下兩種不同貝類的糖原含量的研究發(fā)現(xiàn),在長(zhǎng)期干藏過程中,糖原含量同樣呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[17]。

2.1.4 干藏過程中閉殼肌ATP及其關(guān)聯(lián)物的變化 如圖4所示,冷卻干藏1 d內(nèi),扇貝肌肉ATP水平保持不變;干藏3 d后,ATP含量顯著降低(P<0.05),由3.8 μmol/g降至3.2 μmol/g左右,同時(shí)ADP顯著積累(P<0.05),目測(cè)扇貝生理狀態(tài)處于極度疲勞。期間,除少量AMP和AdR,其它ATP關(guān)聯(lián)降解產(chǎn)物均未檢出。ATP是為機(jī)體提供能量的重要物質(zhì),肌肉中的ATP含量能較好地反映扇貝的生理狀態(tài),通常認(rèn)為,ATP含量越高,扇貝的生理狀態(tài)越好[20]。經(jīng)過冷卻干藏過程中各種因素的脅迫后,ATP依然能維持在較高水平,且未檢出其它降解產(chǎn)物,進(jìn)一步說(shuō)明1 d內(nèi)扇貝的貯藏穩(wěn)定性良好。魚類的ATP代謝途徑為ATP—ADP—AMP—IMP—HxR—Hx,而貝類不產(chǎn)生IMP,直接生成AdR[21],Ketut等在對(duì)冰藏10 d期間海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的ATP及其關(guān)聯(lián)物含量等變化的研究發(fā)現(xiàn),只在牡蠣的肌肉和海膽的內(nèi)臟中檢測(cè)到了AdR[22]。劉慧慧等針對(duì)菲律賓蛤仔的干濕藏保活特性的研究發(fā)現(xiàn)不同處理組的ATP及其關(guān)聯(lián)物會(huì)隨著蛤仔生理狀態(tài)的改變而改變[23]。楊文鴿對(duì)縊蟶在冰藏過程中的生化變化研究發(fā)現(xiàn),ATP含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),ADP和AMP維持在較高水平,對(duì)縊蟶鮮味的保持具有重要意義[24]。根據(jù)本研究結(jié)果,捕后初期24 h內(nèi)的冷卻干露處置,活品仍保持很高的活力狀態(tài),這對(duì)活品貯藏穩(wěn)定性的探索極具積極意義。

圖4 干藏過程中活品蝦夷扇貝閉殼肌ATP及其關(guān)聯(lián)物的變化Fig.4 Changes of ATP and its related compounds oflive P. yessoensis adductor muscle during dry storage

2.2 蝦夷扇貝抗氧化酶及貯藏變化

2.2.1 蝦夷扇貝SOD及貯藏變化 基于各個(gè)軟體組織抗氧化酶分布特點(diǎn),探索蝦夷扇貝抗氧化系統(tǒng)與活品貯藏穩(wěn)定性的關(guān)聯(lián)。圖5為SOD分布及變化的分析結(jié)果,如圖5所示,對(duì)扇貝所有的軟體組織進(jìn)行檢測(cè),其中,雌雄扇貝的性腺分別進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)各個(gè)組織均檢測(cè)到SOD活性在3 d內(nèi)均出現(xiàn)顯著(P<0.05)變化,其中以鰓干藏第3 d的SOD酶活最高。同樣地,捕后初期1 d之內(nèi)的冷卻干露處置,扇貝部分組織如橫紋肌等的SOD活性處于穩(wěn)定狀態(tài),干藏3 d后,由于劇烈脅迫導(dǎo)致各組織應(yīng)激,各組織SOD活性出現(xiàn)增加。

圖5 干藏過程中活品蝦夷扇貝軟體組織SOD的變化Fig.5 Changes of SOD activity of liveP. yessoensis soft tissues during dry storage

2.2.2 蝦夷扇貝CAT及貯藏變化 圖6為扇貝各軟體組織CAT酶活的變化,同樣的,各組織均檢測(cè)到CAT活性,在捕后初期1 d內(nèi)冷卻干露處置,扇貝部分組織如橫紋肌等的CAT活性相差不大,處于穩(wěn)定狀態(tài)。干藏3 d后鰓的CAT酶活顯著(P<0.05)降低,可能是因?yàn)榻?jīng)SOD分解的H2O2一部分會(huì)被過氧化物酶分解從而影響其活性,也可能是因?yàn)榈劫A藏后期,一些未及時(shí)清除的自由基對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆的損傷使其酶活降低,除鰓外,其余各組織的酶活顯著升高(P<0.05)。

圖6 干藏過程中活品蝦夷扇貝軟體組織CAT的變化Fig.6 Changes of CAT activity oflive P. yessoensis soft tissues during dry storage

本研究結(jié)果表明,捕后早期的冷卻干露處置,活品品質(zhì)處于穩(wěn)定狀態(tài)。由于扇貝原料為當(dāng)日人工潛水采集,與大規(guī)模商業(yè)拖網(wǎng)相比,扇貝處于最佳捕后狀態(tài)。盡可能的降低各種脅迫因素的影響可提高扇貝的貯藏穩(wěn)定性。

扇貝為無(wú)脊椎動(dòng)物,其體內(nèi)僅具有血細(xì)胞介導(dǎo)的較為完善的非特異免疫系統(tǒng)[25],超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是其體內(nèi)抗氧化機(jī)制中重要的酶類抗氧化劑,當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境脅迫時(shí),SOD和CAT能迅速作出應(yīng)答,因此其酶活性的變化在一定程度上能反映扇貝免疫機(jī)能的變化[26]。目前抗氧化酶活與環(huán)境溫度、污染程度等脅迫因素的應(yīng)答已有研究,如Wang等對(duì)高溫等因素對(duì)櫛孔扇貝免疫應(yīng)答的研究發(fā)現(xiàn),29 ℃高溫脅迫下,扇貝血清中SOD出現(xiàn)應(yīng)答,在96 h內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)[27]。Pavlovic等對(duì)暗體綠鰭魚(Chelidonichthysobscurus)內(nèi)臟的抗氧化酶研究發(fā)現(xiàn),海洋環(huán)境污染嚴(yán)重的地區(qū),其內(nèi)臟的SOD和CAT活性水平低[28],趙艷芳等[29]的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)櫛孔扇貝和菲律賓蛤仔受到不同的鎘脅迫時(shí),內(nèi)臟的SOD和CAT活性均出現(xiàn)應(yīng)答,呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的規(guī)律,王凡等[30]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)櫛孔扇貝受到低濃度銅離子的脅迫時(shí),其內(nèi)臟團(tuán)的SOD和CAT酶活呈現(xiàn)“抑制—誘導(dǎo)—抑制”的規(guī)律,但整體仍表現(xiàn)出抑制的特性。這些研究均表明抗氧化酶與生物所受脅迫存在一定的關(guān)聯(lián)。在本研究中,SOD和CAT酶活變化均呈現(xiàn)了良好的關(guān)聯(lián)性,但鰓中的CAT酶活變化仍需進(jìn)一步結(jié)合其它過氧化物酶活性變化進(jìn)行分析。

3 結(jié)論

蝦夷扇貝各軟體組織均檢測(cè)到SOD和CAT活性。冷卻干藏3 d后,缺氧等脅迫引起蝦夷扇貝免疫系統(tǒng)的應(yīng)答,主要表現(xiàn)在各軟體組織SOD和CAT活性的顯著變化(P<0.05),其中以SOD應(yīng)答尤為明顯,同時(shí)伴隨著冷卻干藏期間閉殼肌各項(xiàng)生化指標(biāo)pH和糖原含量顯著(P<0.05)下降,ATP含量下降等。捕后初期1 d內(nèi)的冷卻干露,活品依然能夠保持初始活品活力狀態(tài),各項(xiàng)指標(biāo)SOD、CAT、ATP、pH和糖原等均能維持在穩(wěn)定水平。由此表明,捕后初期即易逝期是活品貝類品質(zhì)關(guān)鍵控制期,易逝期內(nèi)扇貝的處置與其恢復(fù)性的關(guān)系值得深入探索,或?qū)钇坟愵惼焚|(zhì)的控制極具科學(xué)意義。