雙層平板直接定性定量法檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌

(寧波市食品檢驗檢測研究院,寧波 315048)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,生長在含鹽0.5%～8%的環(huán)境中[1-2],兼性厭氧,形態(tài)多為桿狀或彎曲狀,能夠在人畜間傳播,廣泛分布于海水、海產(chǎn)品及鹽漬食品中。該菌可引起食物中毒,導致腸胃炎等疾病,尤以日本、東南亞、美國及我國臺灣地區(qū)居多,也是我國沿海地區(qū)食物中毒最常見的致病菌之一[3]。近年來,由副溶血性弧菌引發(fā)的食物中毒事件占細菌性食物中毒的比例呈逐年上升趨勢[4],對人類的健康造成了很大的威脅。因此,對水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測及監(jiān)控顯得尤為重要。

隨著現(xiàn)代食品安全風險評估發(fā)展,食品微生物快速檢測技術由定性檢測逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄐ院投繖z測,微生物快速準確定量檢測已經(jīng)成為未來發(fā)展的大趨勢[5]。目前現(xiàn)行的有效標準GB 29921-2013《食品中致病菌限量》規(guī)定水產(chǎn)制品(熟制水產(chǎn)品、即食生制水產(chǎn)品和即食藻類制品)中副溶血性弧菌采樣方案及限量為n=5,c=1,m=100 MPN/g,M=1000 MPN/g,檢驗方法為GB 29921-2013[6]標準中的定量檢測最大可能數(shù)(Most probable number,MPN)計數(shù)法?，F(xiàn)有國家標準GB 4789.7-2013[7]中副溶血性弧菌定性檢驗選用硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽(Thiosulfate citrate bile salts,TCBS)瓊脂或弧菌顯色瓊脂?？紤]到副溶血性弧菌菌落本底顏色與TCBS底色很接近,易導致漏檢,檢測靈敏度低[8]。相較于TCBS平板,副溶血性弧菌在弧菌顯色平板上菌落呈紫紅色,非目標菌不生長或顯現(xiàn)其它顏色,因此弧菌顯色平板具有較高的靈敏度和特異性[9]。近年來普遍采用生物技術如實時熒光定量PCR技術、多重PCR技術和免疫磁珠法等應用于環(huán)境及食品樣品中副溶血性弧菌數(shù)量的定量檢測[10-11],但是檢測對象是核酸片段,在檢測活菌同時也檢測了死亡細菌基因片段[11],因此不能如實反映樣品中活菌污染狀況,對于海產(chǎn)品而言,無法評價其受副溶血性弧菌污染的程度。

針對副溶血性弧菌檢測存在的問題,本研究采用雙層平板法對副溶血性弧菌直接定性定量,上層為溫和培養(yǎng)基對副溶血性弧菌起到壯大作用,下層為選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌生長并突顯目標菌生長形態(tài)特征,從而對副溶血性弧菌計數(shù)并確認。本研究確定雙層平板法既可定量計數(shù)副溶血性弧菌,也可定性顯示細菌特征,從而建立一種方便快捷、穩(wěn)定性強的副溶血性弧菌定性定量方法。此方法對熱處理、冷藏處理和冷凍處理的人工染菌樣品也具備良好的檢測效果,為食品安全風險評估提供技術支持,以期實現(xiàn)對副溶血性弧菌的監(jiān)控,減少副溶血性弧菌帶來的食品安全問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ATCC 17802副溶血性弧菌標準儲備菌株 美國菌種保藏中心,-70 ℃保存于本實驗室;水產(chǎn)干制品魚片、腌制即食水產(chǎn)品泥螺 寧波市胖子海味有限公司;水產(chǎn)調(diào)味品海鮮粉 寧波今今調(diào)味食品有限公司;弧菌顯色培養(yǎng)基 法國科瑪嘉CHROMagar公司;3%氯化鈉堿性蛋白胨水(Alkaline peptone water,APW)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽(Thiosulfate citrate bile salts,TCBS)瓊脂、氯化鈉營養(yǎng)瓊脂(NaCl NA)、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂(3% NaCl TSA)、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂(3% NaCl TSI)、無鹽胰胨水、6% NaCl胨水、8% NaCl胨水和10% NaCl胨水 北京陸橋技術股份有限責任公司;革蘭氏陰性菌鑒定板條 美國BD公司;Vibrio快速檢測試劑盒 美國杜邦公司。

BAGMIXER 400均質(zhì)器 美國Interscience公司;IF 750恒溫培養(yǎng)箱 德國Memmert公司;1378二級生物安全柜、902超低溫冰箱 美國Thermo Fisher公司;Phoenix M50全自動微生物鑒定系統(tǒng) 美國BD公司;BAX System Q7病原微生物快速檢測系統(tǒng) 美國杜邦公司;渦旋振蕩器 德國IKA公司;全自動革蘭氏染色儀 上海皓信生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩種雙層平板培養(yǎng)基的制備 參照文獻[12-13]制備雙層平板方法,NaCl TSA雙層平板的制備方法為:傾注10 mL弧菌顯色液體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,待其冷卻凝固后作為下層培養(yǎng)基,再傾注5 mL 3% NaCl TSA液體培養(yǎng)基,待其冷卻凝固后作為上層培養(yǎng)基,即制成3% NaCl TSA雙層平板。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

同樣方法制備NaCl NA雙層平板培養(yǎng)基,上層傾注5 mL NaCl NA液體培養(yǎng)基,待其冷卻凝固后作為上層培養(yǎng)基,即制成NaCl NA雙層平板。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的培養(yǎng)與鑒定 副溶血性弧菌懸液的具體制作方法參考GB 4789.28-2013[14]制備副溶血性弧菌菌懸液,將ATCC 17802副溶血性弧菌標準儲備菌株接種到APW中(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h獲得副溶血性弧菌工作菌懸液。

參照GB 4789.7-2013[7]染色鏡檢、TCBS和弧菌顯色平板菌落特征觀察、生化檢測鑒定標準菌株。革蘭氏染色鏡檢:先用結(jié)晶紫進行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇脫色,最后用番紅復染。TCBS和弧菌顯色平板采用劃線分離,(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察形態(tài)。初步生化鑒定:氧化酶試驗:挑取純培養(yǎng)的單個菌落進行氧化酶試驗;3% NaCl TSI試驗:挑取純培養(yǎng)的單個菌落轉(zhuǎn)種3% NaCl TSI斜面并穿刺底層,(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果;嗜鹽性試驗:挑取純培養(yǎng)的單個菌落,分別接種0%、6%、8%、10%不同氯化鈉濃度的胰胨水,(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察液體混濁情況。確定生化鑒定:用全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定。

1.2.3 副溶血性弧菌直接定量檢測平板的篩選 副溶血性弧菌平板計數(shù)參照GB 4789.2-2016[15]略作修改:將副溶血性弧菌懸液在3% NaCl水中10倍連續(xù)梯度稀釋,選取稀釋度10-4和10-5,每個稀釋度分別吸取0.3、0.3和0.4 mL懸液分別接種于NaCl NA平板、NaCl NA雙層平板、3% NaCl TSA雙層平板、弧菌顯色平板和TCBS平板,然后置于副溶血性弧菌適宜生長溫度(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h,菌落計數(shù)和確認,并參照GB 4789.10-2016《第二法 金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法》[16]法進行平板計數(shù),根據(jù)2-ΔΔCt方法計算直接定量菌懸液濃度[17]。

1.2.4 副溶血性弧菌直接定量檢測平板的應用

1.2.4.1 試驗樣品本底檢測 參照GB 4789.7-2013[7],分別稱取魚片、泥螺和海鮮粉樣品25 g與225 mL APW充分均質(zhì)混合,制成1∶10的樣品勻液增菌培養(yǎng),樣品勻液于(36±1) ℃培養(yǎng)8～18 h。然后采用BAX System Q7[18]快速檢測系統(tǒng)分別對增菌培養(yǎng)后的試驗樣品本底值進行檢測,同時以副溶血性弧菌懸液和無菌3% NaCl水分別作為陽性對照和陰性對照,并制作結(jié)果曲線。

表1 副溶血性弧菌確定生化鑒定結(jié)果Table 1 Definitive biochemical result of Vibrio parahaemolyticus

注：+:陽性;-:陰性;V:可變。

1.2.4.2 人工染菌樣品的制備及平板計數(shù) 將等量的2.0×106CFU/mL副溶血性弧菌懸液接種于已粉碎的魚片、泥螺和海鮮粉樣品,制為人工染菌樣品,并參照GB 4789.2-2016[15]方法并略作修改測定副溶血性弧菌濃度。分別取人工染菌樣品25 g,加入3% NaCl無菌水225 mL均質(zhì)混合,選取稀釋度10-4和10-5,每個稀釋度分別吸取0.3、0.3和0.4 mL樣品勻漿液接種NaCl NA平板和NaCl NA雙層平板,(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h后,計算每克人工染菌樣品中細菌菌落形成單位(Colony forming units,CFU)數(shù)量。

1.2.4.3 不同溫度處理樣品在副溶血性弧菌直接定量檢測平板的效果 依據(jù)1.2.4.2制備的人工染菌水產(chǎn)干制品魚片,參照黃靜敏等[5]方法,分別進行以下處理:50 ℃水浴熱處理樣品20 min,4 ℃冷藏處理樣品2 h,-18 ℃冷凍處理樣品24 h,分別檢測其中副溶血性弧菌CFU數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和分析采用OriginLab V8.0分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌標準菌株的鑒定

副溶血性弧菌菌落在TCBS平板上呈圓形、半透明、表面光滑、綠色菌落,輕觸有類似口香糖質(zhì)感,弧菌顯色培養(yǎng)基上呈淡紫色菌落,均符合副溶血性弧菌的典型特征[7]。初步生化鑒定結(jié)果表明,氧化酶試驗陽性,染色鏡檢為革蘭氏陰性菌,3% NaCl TSI瓊脂反應結(jié)果為底層變黃不變黑、無氣泡、斜面顏色不變、有動力,嗜鹽性試驗結(jié)果在無鹽胨水和10% NaCl胨水中不生長,在6% NaCl胨水和8% NaCl胨水中生長旺盛(圖1)。經(jīng)全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定為副溶血性弧菌(表1)。覃玉英等[19]通過研究鑒定的菌株具備在TCBS平板上呈現(xiàn)表面光滑、綠色的菌落,氧化酶試驗陽性,在6% NaCl胨水和8% NaCl胨水中生長旺盛,在無鹽胨水和10% NaCl胨水中不生長等特征,最終鑒定為副溶血性弧菌菌落,本研究結(jié)果與其相似。

圖1 副溶血性弧菌初步生化鑒定結(jié)果Fig.1 Preliminary biochemical result of Vibrio parahaemolyticus

2.2 直接定量檢測平板的篩選

如圖2所示,以NaCl NA平板為對照,NaCl NA雙層平板和3% NaCl TSA雙層平板上菌落數(shù)量無顯著性差異,并且平板上均顯示副溶血性弧菌典型的中等大小、淡紫色菌落,而弧菌顯色平板和TCBS平板上菌落數(shù)量顯著減少。單純使用弧菌顯色平板涂布菌落計數(shù)結(jié)果與對照NaCl NA平板方法計數(shù)結(jié)果偏差較大,而NaCl NA雙層平板上的菌落計數(shù)結(jié)果與對照NaCl NA平板方法無顯著性差異,與王媛等[12]研究結(jié)果一致,并且細菌代謝產(chǎn)物滲透到下層弧菌顯色培養(yǎng)基顯示特征性的紫紅色,既能方便快捷識別目標細菌,又具備計數(shù)菌落的作用。

圖2 不同培養(yǎng)基上副溶血性弧菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Vibrio parahaemolyticus on plates

在檢測過程中,NaCl NA雙層平板上出現(xiàn)典型菌落約需18 h,而3% NaCl TSA雙層平板出現(xiàn)典型菌落約需20 h,兩者計數(shù)菌落均與對照NaCl NA平板計數(shù)方法無顯著性差異,但是副溶血性弧菌典型菌落在NaCl NA雙層平板出現(xiàn)時間更短,故選用NaCl NA雙層平板作為副溶血性弧菌直接定量計數(shù)優(yōu)勢平板。

圖3 不同平板上副溶血性弧菌計數(shù)測定結(jié)果Fig.3 Counting result of Vibrio parahaemolyticus on plates注:以NaCl NA平板上的菌落記為“1”,其他結(jié)果均以此為比較的相對量;*表示與對照NaCl NA平板相比差異顯著,P<0.05。

2.3 試驗樣品本底檢測結(jié)果

將水產(chǎn)干制品魚片、腌制即食水產(chǎn)品泥螺和水產(chǎn)調(diào)味品海鮮粉與APW均質(zhì)混合,增菌培養(yǎng)后,采用BAX System Q7檢測本底,檢測結(jié)果均顯示三種樣品不含副溶血性弧菌(圖4)。

2.4 直接定量檢測人工染菌樣品

采用NaCl NA雙層平板直接定量檢測人工染菌的水產(chǎn)干制品魚片、腌制即食水產(chǎn)品泥螺和水產(chǎn)調(diào)味品海鮮粉中副溶血性弧菌。由圖5可見,NaCl NA平板和NaCl NA雙層平板分別直接定量檢測人工染菌的三種樣品中細菌數(shù)量均無顯著性差異,說明NaCl NA雙層平板同NaCl NA平板均適用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的定量檢測,王媛等[12]也有類似的研究結(jié)果。

圖5 直接定量檢測人工染菌樣品結(jié)果Fig.5 Direct quantitative detection of artificial bacterial samples

2.5 雙層平板法直接定量檢測溫度影響樣品效果評價

研究表明,副溶血性弧菌處于溫度低于5 ℃時,其生長受到抑制甚至死亡[1,11,20]。為如實反映副溶血性弧菌在低溫條件下的污染情況,采用NaCl NA雙層平板直接定量檢測人工染菌水產(chǎn)干制品魚片中副溶血性弧菌。如圖6可見,與室溫人工染菌樣品的對照組相比,50 ℃熱處理20 min的樣品中副溶血性弧菌濃度無顯著性差異,但是4 ℃冷藏處理2 h和-18 ℃冷凍處理24 h的樣品中副溶血性弧菌濃度顯著減少,分別是對照組的68.9%和21.7%。研究報道副溶血性弧菌不同菌株分別在5 ℃和-18 ℃低溫貯藏條件下存活率均顯著下降[21],并且-18 ℃比4 ℃更有利于快速滅活海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌[22]。

本研究進一步證實了副溶血性弧菌處于溫度4和-18 ℃時,其生長會受到抑制,由此可見雙層平板法能夠反映樣品受污染情況,表明此方法靈敏性較好。

圖6 直接定量檢測溫度處理樣品的結(jié)果Fig.6 Direct quantitative detection oftemperature-treated samples注:*代表與室溫相比差異顯著,P<0.05。

3 結(jié)論

本研究顯示NaCl NA雙層平板法可以用于副溶血性弧菌的定性定量檢測,既能反映樣品受污染狀況,又能在平板上顯示菌落獨特的顏色,方便鑒定計數(shù),相比于分子檢測方法也不需要高昂的儀器設備和試劑耗材,由此可見,NaCl NA雙層平板法直接定量計數(shù)適合廣泛的應用。