外源GABA對(duì)雙孢蘑菇細(xì)胞壁代謝及木質(zhì)化進(jìn)程的影響

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(1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西桂林 541004;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南長(zhǎng)沙 410125)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)又名白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇等,不僅肉質(zhì)鮮美,而且富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等,具有很好的降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌、消炎護(hù)肝等多種保健價(jià)值[1-2]。然而雙孢蘑菇在采后仍然進(jìn)行著旺盛的呼吸、蒸騰、營養(yǎng)物質(zhì)代謝等生理作用,因此菌體易發(fā)生失水萎蔫、褐變、破膜開傘等品質(zhì)劣變現(xiàn)象,造成雙孢蘑菇貯藏周期短,常溫下僅可貯藏2～3 d[3]。質(zhì)地是衡量雙孢蘑菇商品價(jià)值的關(guān)鍵指標(biāo)之一,剛采收的雙孢蘑菇堅(jiān)實(shí)而有彈性,但在貯藏過程中硬度逐漸降低,質(zhì)地嚴(yán)重劣變[3]。研究表明食用菌硬度下降與細(xì)胞壁的加速代謝密切相關(guān)[4]。細(xì)胞壁是細(xì)胞的支撐物,可以維持細(xì)胞的形狀,為細(xì)胞抵御外界滲透壓、機(jī)械力提供了保護(hù),與組織的軟化和衰老密切相關(guān)[4]。與植物細(xì)胞壁不同,食用菌細(xì)胞壁主要成分為葡聚糖、幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì),還有少量的木質(zhì)素和纖維素[5-7]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞壁主要成分逐漸被降解,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞,同時(shí),在水解酶類的作用下,細(xì)胞壁逐漸被降解,加速了組織軟化與衰老[5-8]。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種四碳非蛋白氨基酸,廣泛存在于生物體內(nèi),目前已被批準(zhǔn)在食品中使用[9]。目前,關(guān)于GABA在果蔬采后品質(zhì)變化上的應(yīng)用研究還處于起步階段。近年來的研究發(fā)現(xiàn),外源GABA處理能夠減輕CO2對(duì)番茄等果實(shí)的傷害[10]、誘導(dǎo)梨果實(shí)產(chǎn)生抗病性[11]、提高桃、香蕉等果實(shí)的抗冷性[12-13]、促進(jìn)香蕉果實(shí)采后成熟[14]。李靜等[15]發(fā)現(xiàn)GABA能夠延緩雙孢蘑菇硬度的下降,較好的保持其色澤和減少水分的蒸發(fā)。這些研究結(jié)果為將外源GABA應(yīng)用于雙孢蘑菇改善采后貯藏品質(zhì),如調(diào)節(jié)細(xì)胞壁代謝和減輕木質(zhì)化提供了理論基礎(chǔ)。

本文旨在研究5 mmol/L GABA處理對(duì)雙孢蘑菇幾丁質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素含量以及細(xì)胞壁代謝、木質(zhì)素合成的相關(guān)酶活性的影響,明確GABA對(duì)雙孢蘑菇細(xì)胞壁代謝及木質(zhì)化進(jìn)程的作用,為深入研究GABA調(diào)控雙孢蘑菇的作用機(jī)理提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢蘑菇 采摘于全州新軍生態(tài)菌家庭農(nóng)場(chǎng)有限公司,于采摘當(dāng)天轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,并于(5±1) ℃下預(yù)冷6 h,然后選取大小和成熟度均勻、顏色潔白、無開傘、無病蟲害和機(jī)械損傷的雙孢蘑菇進(jìn)行實(shí)驗(yàn);γ-氨基丁酸(GABA,99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、纖維素等 均為國產(chǎn)分析純。

WS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;3K30冷凍離心機(jī) 德國Sartorious公司;TU-1950紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15],常溫(23±1) ℃條件下,將雙孢蘑菇分別在清水和5 mmol/L的GABA溶液下浸泡5 min,取出,待雙孢蘑菇表面的水分晾干后,裝袋冷藏(4 ℃),每18個(gè)雙孢蘑菇為一組,每個(gè)處理重復(fù)3次。分別于0、3、6、9、12 d取樣,用液氮凍干粉碎后于-20 ℃冰箱貯藏備用。

1.2.2 GABA處理對(duì)幾丁質(zhì)代謝的影響

1.2.2.2 幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定 幾丁質(zhì)酶的提取和總酶活性的測(cè)定均參照曹建康等[17]的方法進(jìn)行。酶液的提取:取2.0 g雙孢蘑菇粉末樣品,加7.0 mL冷的提取緩沖液(含1 mmol/L EDTA和5 mmol/Lβ-巰基乙醇的0.1 mol/L、pH5.2乙酸-乙酸鈉),在低溫冷浴下研磨均勻,將研磨好的樣品離心30 min(4 ℃,12000×g),上清液移入透析袋中,放入蒸餾水中,于4 ℃透析12 h,將透析過的溶液再次離心15 min(4 ℃,10000×g),收集上清液,加入5倍冷的丙酮,于-20 ℃放置4 h,離心20 min(4 ℃,12000×g),棄去上清液,用預(yù)冷的丙酮漂洗兩次,干燥沉淀物,加乙酸-乙酸鈉(50 mmol/L、pH5.2)溶解,離心20 min(4 ℃,10000×g),上清液即為酶提取液。

酶活力的測(cè)定:0.5 mL乙酸-乙酸鈉(50 mmol/L、pH5.2)、0.5 mL幾丁質(zhì)溶液(10 g/L)、0.5 mL酶提取液,37 ℃水浴60 min,加0.1 mL蝸牛酶(30 g/L),37 ℃水浴60 min。加0.2 mL四硼酸鉀溶液(0.6 mol/L)、高溫滅活,加2 mL稀釋的對(duì)二甲氨基苯甲醛,水浴20 min(37 ℃),于585 nm處測(cè)吸光值。對(duì)照樣吸光度的測(cè)定與上基本相同,僅在加酶提取液時(shí)先滅活。根據(jù)N-乙酰葡萄糖胺法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力以每克樣品每秒鐘催化產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖的量來表示。

1.2.3 GABA處理對(duì)纖維素代謝的影響

1.2.3.1 纖維素含量的測(cè)定 參照商賀陽等[18]的方法并稍作修改。取烘干恒重的雙孢蘑菇100 mg,加70 mL H2SO4(60%),放置20 min,加30 mL H2SO4(60%),對(duì)溶液稀釋10倍,取2.0 mL稀釋液,加0.5 mL蒽酮(2%),再加5.0 mL濃H2SO4,測(cè)定620 nm處吸光值。取100 μg/mL纖維素標(biāo)準(zhǔn)液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL,按上述步驟測(cè)吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)方程計(jì)算纖維素含量。

1.2.3.2 纖維素酶活力的測(cè)定 纖維素酶的提取和酶活力的測(cè)定參照孫涵等[19]的方法進(jìn)行。取2.0 g雙孢蘑菇粉末,加10 mL 95%乙醇,在冷的條件下研磨均勻,冰浴10 min,離心(4 ℃,12000×g,20 min),沉淀物中加5 mL 80%乙醇,冰浴10 min,重復(fù)離心保留沉淀物,再加5 mL提取緩沖液(含1.8 mol/L的NaCl的50 mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸鈉),冰浴提取20 min,離心,上清液即為酶提取液;取0.9 mL羥甲基纖維素鈉(10 g/L)、0.3 mL酶提取液,37 ℃水浴60 min,然后加0.9 mL 3,5-二硝基水楊酸,高溫滅酶活,于540 nm處測(cè)吸光值,對(duì)照組的不同在于加的是滅活的酶提取液。3,5-二硝基水楊酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,酶活力以每克樣品每小時(shí)催化產(chǎn)生的葡萄糖的量來表示。

1.2.4 GABA處理對(duì)雙孢蘑菇木質(zhì)素代謝的影響

1.2.4.1 木質(zhì)素含量測(cè)定 參照Bruce等[20]的方法測(cè)定木質(zhì)素含量。取5.0 g雙孢蘑菇粉末,加5 mL 95%的乙醇研磨均勻,3000×g離心7 min。用95%乙醇多次洗滌沉淀物,再用乙醇-正已烷(1∶2，V/V)多次洗滌沉淀物,烘干干燥,溶解于0.5 mL 25%的溴乙酰中,70 ℃水浴0.5 h,加0.9 mL 2 mol/L NaOH、5 mL冰乙酸和0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺,離心(1000×g,7 min),于280 nm處測(cè)吸光值。取1 mg/mL的木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,按前上述步驟測(cè)吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算木質(zhì)素含量。

1.2.4.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的測(cè)定 苯丙氨酸解氨酶的提取和酶活力的測(cè)定參照李靜等[15]的方法進(jìn)行。

(2) Trypsinogen-1: Trypsin is a member of the serine protease family composed of three trypsinogen genes(trypsinogen 1, 2 and 4) with a potential role in cancer invasion[44,45]. These family members are sharing same nucleotide structures above 90% with each other.

1.2.4.3 肉桂醇脫氫酶(CAD)活力的測(cè)定 肉桂醇脫氫酶的提取和酶活力的測(cè)定參照姜天甲[21]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA處理對(duì)雙孢蘑菇幾丁質(zhì)代謝的影響

幾丁質(zhì)是由N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖,是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要成分,其與纖維素共同構(gòu)成細(xì)胞壁骨架[5-7]。幾丁質(zhì)含量一定程度上反映了細(xì)胞壁的完整度,Zivanovic等[7]曾報(bào)道幾丁質(zhì)含量的增加與雙孢蘑菇的韌性呈正相關(guān)(r=0.95)。孫涵等[19]研究表明,氣調(diào)處理雙孢蘑菇能減緩其幾丁質(zhì)的降解,維持細(xì)胞壁一定的完整性。幾丁質(zhì)酶是一種能降解真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的酶,可作用于幾丁質(zhì)多聚體中的β-1,4-糖苷鍵,使之水解形成N-乙酰葡糖糖胺單體。幾丁質(zhì)酶過于活躍則會(huì)使幾丁質(zhì)含量迅速降解,嚴(yán)重?fù)p壞細(xì)胞壁,加快品質(zhì)的劣變[5-7,16-17]。

圖1和圖2分別表示雙孢蘑菇貯藏過程中幾丁質(zhì)含量和幾丁質(zhì)酶活力的變化,從圖1中可知,隨著雙孢蘑菇貯藏時(shí)間的推移幾丁質(zhì)含量逐漸下降,但GABA處理過的雙孢蘑菇的幾丁質(zhì)含量下降速度小于對(duì)照組的下降速度,且處理組的幾丁質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),這說明GABA處理能夠抑制幾丁質(zhì)的分解。從圖2中可以看出,在雙孢蘑菇的貯藏期間,幾丁質(zhì)酶活力呈上升的趨勢(shì)。處理組和對(duì)照組的變化趨勢(shì)基本一致,但是處理組的幾丁質(zhì)酶活力一直低于對(duì)照組,而且兩者之間的差異顯著性隨著貯藏時(shí)間逐漸增強(qiáng),這說明GABA處理能抑制幾丁質(zhì)酶的活力。結(jié)合圖1幾丁質(zhì)含量的變化趨勢(shì),說明GABA(5 mmol/L)處理能夠通過抑制幾丁質(zhì)酶的活力來降低幾丁質(zhì)的降解速率。

圖1 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)幾丁質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of GABA treatmenton chitin content of A. bisporus

圖2 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響Fig.2 Effects of GABA treatmenton chitinase activity of A. bisporus

2.2 GABA處理對(duì)雙孢蘑菇纖維素代謝的影響

纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分,與木質(zhì)素、果膠、半纖維素等共同構(gòu)成細(xì)胞壁,它能維持細(xì)胞的形態(tài),在一定程度上起到保護(hù)細(xì)胞不被破壞[8,19,21]。過高的纖維素含量會(huì)使果蔬木質(zhì)化嚴(yán)重,韌性增強(qiáng),適中的纖維素含量不僅能提高食用的口感,而且能夠增強(qiáng)食物的貯藏品質(zhì)[21-22]。陳素芹[23]研究發(fā)現(xiàn),雙孢蘑菇在15 ℃貯藏4 d后才開始發(fā)生自溶,此時(shí)纖維素含量不斷上升,最高含量達(dá)到鮮重的1.5%以上,隨著自溶的加速,纖維素含量又呈下降趨勢(shì),纖維素含量的下降是蘑菇自溶的原因之一。圖3表示雙孢蘑菇貯藏過程中纖維素含量的變化,從圖中可以看出,貯藏前3 d雙孢蘑菇的纖維素含量略有下降,之后又迅速升高,可能與雙孢蘑菇還未發(fā)生明顯的自溶有關(guān)。貯藏前6 d處理組和對(duì)照組之間并無顯著差異,貯藏后期處理組纖維素含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),這說明在貯藏后期GABA處理能顯著(P<0.05)抑制雙孢蘑菇纖維素的降解。

圖3 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)纖維素含量的影響Fig.3 Effect of GABA treatmenton cellulose content of A. bisporu

纖維素酶能使纖維素水解生成葡萄糖單體,其主要存在于成熟果實(shí)中[8]。研究表明,菇體自溶的原因之一是纖維素酶水解細(xì)胞壁組成物質(zhì)纖維素,使細(xì)胞壁降解,菇體的自溶與纖維素酶活性呈正相關(guān),與纖維素呈負(fù)相關(guān),抑制纖維素酶活可有效的防止菇體自溶[23]。圖4表示雙孢蘑菇貯藏過程中纖維素酶活力的變化,從圖4中可以看出,雙孢蘑菇中的纖維素酶活力先上升再下降的趨勢(shì),在第6 d時(shí)出現(xiàn)最大值。在6～12 d時(shí),處理組的纖維素酶活顯著低于照組(P<0.05)。纖維素酶活力的變化可能與細(xì)胞自溶現(xiàn)象有關(guān),細(xì)胞的自溶伴隨著細(xì)胞壁的降解,細(xì)胞壁含有大量的纖維素,需要大量的纖維素酶,酶活力呈上升趨勢(shì),但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),大量的細(xì)胞自溶使得纖維素酶合成受阻,而且隨著時(shí)間的推移酶的效力在下降,這使得纖維素酶活先升高后降低[23]。結(jié)合圖3可知GABA處理能抑制纖維素酶的活性,進(jìn)而抑制纖維素的分解。

圖4 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)纖維素酶活力的影響Fig.4 Effect of GABA treatmenton cellulase activity of A. bisporus

2.3 GABA處理對(duì)雙孢蘑菇木質(zhì)素代謝的影響

2.3.1 GABA處理對(duì)雙孢蘑菇木質(zhì)素含量的影響 木質(zhì)素是植物木質(zhì)化的產(chǎn)物,是構(gòu)成細(xì)胞壁次生結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì),它在木質(zhì)組織有硬化細(xì)胞壁,增強(qiáng)細(xì)胞抗壓的能力[20,22]。在果蔬中,木質(zhì)素在膳食纖維中的作用十分重要,適中的含量能提高果蔬的品質(zhì)[24]。雙孢蘑菇在貯藏過程中,也易發(fā)生木質(zhì)化現(xiàn)象,使得口感變差,有研究表明,通過保鮮技術(shù)處理雙孢蘑菇可抑制雙孢蘑菇木質(zhì)化進(jìn)程[8,19,23]。李靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)外源GABA處理能夠使雙孢蘑菇在貯藏過程中保持良好的硬度,由此推測(cè)GABA處理能影響雙孢蘑菇木質(zhì)素的積累,從而影響雙孢蘑菇的木質(zhì)化。圖5表示雙孢蘑菇貯藏過程中木質(zhì)素含量的變化,從圖中可以看出,在雙孢蘑菇貯藏初期(0～6 d),木質(zhì)素含量基本不變,對(duì)照組和處理組間的木質(zhì)素含量并無差異,貯藏6 d后木質(zhì)素含量迅速上升,但是9 d后處理組的木質(zhì)素含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),這說明在貯藏后期GABA處理能夠有效抑制木質(zhì)素的合成。

圖5 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)木質(zhì)素含量的影響Fig.5 Effect of GABA treatmenton lignin content of A. bisporus

2.3.2 GABA處理對(duì)雙孢蘑菇PAL、CAD活性的影響 木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶有PAL、CAD等。PAL是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶,能催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸或香豆醛生成醇。圖6表示雙孢蘑菇貯藏過程中PAL酶活力的變化,從圖6可知,對(duì)照組和處理組的雙孢蘑菇PAL酶活力均呈下降趨勢(shì)。在3 d前兩個(gè)處理之間的酶活力無顯著差異,在3～6 d中,對(duì)照組PAL酶活力迅速下降,6 d后緩慢下降,而處理組則一直呈緩慢下降趨勢(shì),且活性顯著高(P<0.05)于對(duì)照組,這說明GABA處理有利于保持雙孢蘑菇PAL的活力。結(jié)合圖5,GABA處理能夠通過提高PAL的活性而降低木質(zhì)素的積累。

圖6 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)PAL活力的影響Fig.6 Effect of GABA treatmenton PAL enzyme activity in A. bisporus

CAD能將肉桂醇轉(zhuǎn)化成前體物質(zhì)進(jìn)而合成木質(zhì)素[19,25]。圖7表示雙孢蘑菇貯藏過程中CAD酶活力的變化,對(duì)照組和處理組雙孢蘑菇CAD活力變化趨勢(shì)一致,在貯藏初期,雙孢蘑菇中的CAD活力變化不大,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),CAD活力迅速增大,9 d之后又有略微的下降,其中處理組的CAD酶活力始終低于對(duì)照組的活力,這說明GABA處理能抑制CAD的活力,進(jìn)而降低木質(zhì)素的積累,這一研究結(jié)果與孫涵等[19]的研究結(jié)果基本一致。

圖7 GABA處理雙孢蘑菇對(duì)CAD活力的影響Fig.7 Effect of GABA treatmenton CAD activity in A. bisporus

2.3.3 PAL、CAD活性與木質(zhì)素合成的相關(guān)性分析 表1表示雙孢蘑菇中的PAL、CAD活力與木質(zhì)素合成的關(guān)系,由表1可以看出,對(duì)照組和處理組的木質(zhì)素含量均與PAL活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),可能與PAL促進(jìn)了雙孢蘑菇多酚的積累有關(guān)[15]。CAD活力均與對(duì)照組和處理組木質(zhì)素的含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),這一研究結(jié)果與姜天甲[21]和孫涵等[19]的研究結(jié)果一致,說明GABA能夠通過提高PAL活力和抑制CAD活力來抑制木質(zhì)素的合成,保持雙孢蘑菇的品質(zhì)。

表1 雙孢蘑菇PAL、CAD活力與木質(zhì)素含量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation coefficients among PAL,CAD activity and lignin concents

注：*在P<0.05水平顯著相關(guān);**在P<0.01水平極顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

在貯藏過程中,雙孢蘑菇的幾丁質(zhì)含量逐漸下降,而幾丁質(zhì)酶的活力呈上升趨勢(shì)。GABA處理組雙孢蘑菇的幾丁質(zhì)含量高于對(duì)照組,而幾丁質(zhì)酶活力卻低于對(duì)照組,這說明GABA處理能抑制雙孢蘑菇幾丁質(zhì)酶活力,進(jìn)而抑制幾丁質(zhì)的降解,保持細(xì)胞膜的完整性。

雙孢蘑菇的纖維素含量在貯藏初期稍有降低,3 d后快速上升,而纖維素酶的活力先緩慢上升,6 d后急劇下降,纖維素含量與纖維素酶活力的變化并不同步。貯藏3 d后GABA處理的雙孢蘑菇纖維素酶活力低于對(duì)照組,而這一時(shí)期的纖維素含量卻高于對(duì)照組,這說明GABA處理能夠通過抑制纖維素酶的活力來促進(jìn)纖維素的積累,使細(xì)胞維持良好的抗壓力。

雙孢蘑菇的木質(zhì)素含量在貯藏初期變化不大,6 d后迅速上升,不斷積累。在貯藏過程中,PAL活力逐漸下降而CAD活力逐漸增大。相關(guān)性分析表明,木質(zhì)素含量與PAL活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),而與CAD活力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。GABA處理組木質(zhì)素含量低于對(duì)照組,PAL活力高于對(duì)照組,而CAD活力卻低于對(duì)照組,這說明GABA能夠通過提高PAL活力和抑制CAD活力來降低雙孢蘑菇木質(zhì)素的積累,進(jìn)而延緩其木質(zhì)化進(jìn)程。該研究明確了外源GABA對(duì)雙孢蘑菇細(xì)胞壁代謝和木質(zhì)化進(jìn)程的減緩作用,可為有效抑制雙孢蘑菇質(zhì)地劣變提供理論依據(jù)。