蠟樣芽孢桿菌LJ01中亞硝酸鹽還原酶的基因克隆和生物信息學(xué)分析

胡金雙,黃燕燕,陳思敏,鄺嘉華,趙 珊,彭 鑫,劉冬梅

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

亞硝酸鹽(nitrites,NIT)作為一種含氮化合物,是氮循環(huán)中一種重要的反應(yīng)物和產(chǎn)物,在自然界中廣泛存在,同時(shí)也是人體中硝酸鹽循環(huán)中重要的一環(huán)。通過(guò)膳食攝入的亞硝酸鹽會(huì)在人體內(nèi)發(fā)生N-亞硝化作用,生成具有致癌性的N-亞硝基化合物,因此將食品中的亞硝酸鹽控制在安全限量?jī)?nèi)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。有研究證實(shí)通過(guò)反硝化作用降解亞硝酸鹽是當(dāng)前解決這一問(wèn)題的有效方法[1]。反硝化是通過(guò)硝酸鹽還原酶(nitrate reductase)、亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase,NiR)、一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase)和一氧化二氮還原酶(nitrous oxide reductase)等的作用將亞硝酸鹽降解。異化過(guò)程所需的亞硝酸鹽還原酶能夠?qū)IT還原成NO,是反硝化過(guò)程最重要的一步[2]。

表1 生物信息學(xué)分析工具及網(wǎng)址Table 1 Tools and web servers for analysis of bioinformatics

目前已被證實(shí)具有降解NIT能力的微生物包括蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusLJ01[3]、植物乳桿菌LactobacillusplantarumDMDL 9010[4]、干酪乳桿菌LactobacilluscaseiLCR 6013[5]、戊糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌[6]、鼠李糖乳桿菌[7]、乳酸糞鏈球菌、啤酒片球菌、腸膜明串球菌、短乳桿菌等[8],但其NiR含量普遍較低。并且,經(jīng)天然產(chǎn)物純化得到NiR的工序繁雜,不可避免地造成蛋白質(zhì)損失,使回收率降低。大多數(shù)研究者都無(wú)法直接從破碎天然菌體后的粗酶液中提取大量的天然NiR,如Nurizzo等[9]、Vigara等[10]、Inatomi等[11]和Preuss等[12]分別從Haloarculamarismortui、Monoraphidiumbraunii、Haloferaxdenitrificans和Rhodopseudomonaspalustris1a1粗酶液中純化得到了很少量的NiR。因此,采用基因工程手段對(duì)蛋白酶基因進(jìn)行改良和克隆表達(dá),開(kāi)發(fā)高產(chǎn)量、高純度、高活力的蛋白酶資源成為研究的熱點(diǎn)[13]。

大腸桿菌是第一個(gè)用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的宿主菌,它具有成本較低、繁殖速度快、操作和培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單及其分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn),因此大腸桿菌已發(fā)展成為基因工程研究中應(yīng)用最為廣泛和研究最為深入的表達(dá)系統(tǒng),幾乎所有已成功克隆的蛋白酶基因都在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)產(chǎn)物[14-15]。Volkov等[16]克隆了酵母細(xì)胞色素過(guò)氧化物酶的基因,并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了高提取率的重組酶,在1 L的大腸桿菌培養(yǎng)物獲得了30～60 mg的重組產(chǎn)物,純度高達(dá)96%～99%。Wang等[17]利用基因工程技術(shù)克隆了植物乳桿菌DMDL9010中編碼NiR的基因,并研究了重組NiR的性質(zhì)。

本課題組的前期研究[3]發(fā)現(xiàn),蠟樣芽孢桿菌B.cereusLJ01的粗酶液經(jīng)陰離子交換層析(DEAE Sepharose Fast Flow)和分子篩層析(Sephadex G-150)純化后,NiR的提取率僅為2.37%。為了更好地研究B.cereusLJ01中NiR的酶學(xué)性質(zhì),提高NiR的提取率,本研究對(duì)B.cereusLJ01中NiR基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并利用克隆表達(dá)技術(shù),將B.cereusLJ01中NiR序列分別插入到載體質(zhì)粒pET-28a(+)和pET-32a(+)上,將獲得的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-nir和pET-32a(+)-nir分別轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株EscherichiacoliBL21(DE3)中,實(shí)現(xiàn)NiR基因的異源表達(dá),并在不同誘導(dǎo)溫度下比較兩種重組菌的NiR表達(dá)水平,選擇NiR表達(dá)量高的做為基因工程菌菌株,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌LJ01(BacilluscereusLJ01) 本課題組從豆瓣醬中篩選得到,已于2014年6月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,簡(jiǎn)稱CGMCC,保藏號(hào)CGMCC NO.9360;擴(kuò)增菌株EscherichiacoliTop 10、克隆菌株EscherichiacoliBL21(DE3)及質(zhì)粒載體pET-28a(+)和pET-32a(+) 本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶及PCR、克隆相關(guān)試劑和試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa);Bradford染料、柱式細(xì)菌DNAout試劑盒 北京天恩澤基因科技有限公司;LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)、卡那霉素(Kanamycin,Kan)等試劑 廣州市卯林試劑有限公司和健陽(yáng)生物科技有限公司。

PCR擴(kuò)增儀 MJ Research公司;DYY-6C型核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;蛋白電泳儀 Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng) SynGene公司;超高壓細(xì)胞破碎儀 廣州聚能納米生物科技股份有限公司;高速冷凍離心機(jī) Beckman Coulter公司;QL-208多用途旋轉(zhuǎn)搖床 海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠;Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中B.cereusLJ01中NiR編碼基因序列(登錄號(hào)為MG839504[18])。設(shè)計(jì)NiR擴(kuò)增的上下游引物:上游引物5′-CCAGCTAGCATGAGTTATGAAAAAGTATG-3′;下游引物5′-TGGCTCGAGAGACGCTATTACTTC-3′,由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成引物。

1.2.2 NiR基因的生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)在線分析軟件對(duì)NiR編碼的蛋白信息進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析,見(jiàn)表1。

圖1 B. cereus LJ01中NiR的蛋白序列Fig.1 The protein sequence of NiR from B. cereus LJ01

1.2.3 基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21(DE3)和pET-32a(+)-nir-BL21(DE3)的構(gòu)建 以B.cereusLJ01全基因組DNA為模板進(jìn)行NiR的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,68 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后,進(jìn)行純化和回收。將純化回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行NdeI和XhoI雙酶切,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-32a(+)進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切。16 ℃連接3 h以上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTopl0,單菌落PCR驗(yàn)證成功后送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序成功的質(zhì)粒pET-28a(+)-nir和pET-32a(+)-nir各自轉(zhuǎn)入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,分別涂布在含有25 μg/mL Kan和100 μg/mL Amp的固體LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。

1.2.4 不同誘導(dǎo)條件及不同質(zhì)粒對(duì)NiR表達(dá)的影響 將基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21的單菌落分別接種到20 mL含25 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后,得到種子液。按2%(V/V)的接種量分別接種到400 mL含25 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp LB培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG(終濃度為0.1 mmol/L)。pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,分別在16 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)22 h,25 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)16 h,37 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)4 h。

培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體在6000 r/min下離心15 min,收集菌體沉淀,用無(wú)菌水洗滌兩次。向菌體沉淀中加入40 mL Ni-Buffer A溶液(溶液組成為20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl和7 mmol/Lβ-巰基乙醇)重懸。用超高壓細(xì)胞破碎儀在4 ℃、150 MPa下破碎菌體細(xì)胞4次。裂解液于4 ℃、12000 r/min離心50 min,用0.22 μm的濾膜過(guò)濾上清液,獲得粗酶液。進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化[19-20]后,用25、50、75、250、500 mmol/L的咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫,對(duì)各洗脫組分進(jìn)行SDS-丙烯酰胺凝膠電泳,以誘導(dǎo)前樣品、裂解液上清、沉淀做對(duì)照。

1.2.5 NiR編碼基因?qū)λ拗骷?xì)胞生長(zhǎng)的影響 將活化后的B.cereusLJ01、E.coliBL21(DE3)、pET-28a(+)-nir-BL21菌液加入96孔板中,用Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定不同時(shí)間的OD600值,溫度為37 ℃,時(shí)長(zhǎng)為24 h,每隔1 h測(cè)定,繪制三種細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線,比較分析外源基因?qū)τ诩闹骶鶨.coliBL21(DE3)生長(zhǎng)的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)三次,用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NiR基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

用DNAMAN軟件將B.cereusLJ01中NiR基因序列翻譯成蛋白質(zhì)序列,如圖1所示。使用NCBI的ProtParam工具對(duì)NiR進(jìn)行分析,得知蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)為540個(gè),分子量為60383.88,理論等電點(diǎn)pI為5.47,原子組成為C2728H4245N717O803S14,原子總數(shù)為8507,消光系數(shù)為66155,不穩(wěn)定指數(shù)為32.19,脂肪族氨基酸指數(shù)為90.50,序列的N末端是甲硫氨酸,估計(jì)在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h,酵母細(xì)胞的體外半衰期大于20 h,哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞的體外半衰期為30 h。

在NPS網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)序列分析網(wǎng)站中輸入B.cereusLJ01中NiR序列,使用SOPM方法對(duì)該NiR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果如表2所示。可以推測(cè)B.cereusLJ01的NiR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中最主要的組成類型為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲,延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白中。

表2 B. cereus LJ01中NiR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成類型Table 2 The types of secondary structure ofNiR protein from B. cereus LJ01

使用TMHMM在線分析軟件對(duì)其跨膜螺旋和信號(hào)肽進(jìn)行分析,結(jié)果表明NiR不具有明顯的信號(hào)肽或跨膜結(jié)構(gòu),N端不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。使用在線分析軟件ExPASy的ProtScale程序預(yù)測(cè)其疏水性,結(jié)果表明該蛋白質(zhì)中所有氨基酸的平均親水性分值大小為-0.229,為親水性蛋白。

在SWISS-MODEL蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)服務(wù)系統(tǒng)上輸入B.cereusLJ01中NiR序列,選擇Model 1,其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示。預(yù)測(cè)該蛋白可能屬于“依賴于鐵氧化還原蛋白”的亞硝酸鹽還原酶NiRA。從圖2可知B.cereusLJ01的NiR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很可能主要是由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成,這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果一致。

圖2 B. cereus LJ01的NiR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Three dimensional structures prediction ofNiR from B. cereus LJ01

2.2 重組表達(dá)載體的菌落PCR鑒定結(jié)果

分別選取pET-28a(+)-nir-E.coliTop 10和pET-32a(+)-nir-E.coliTop 10的8個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。其中pET-28a(+)-nir-E.coliTop 10得到大小約為1800 bp的單一條帶(含230 bp克隆位點(diǎn)),pET-32a(+)-nir-E.coliTop 10得到大小約為2300 bp的單一條帶(含700 bp克隆位點(diǎn)),與測(cè)序結(jié)果得到的NiR序列長(zhǎng)度相吻合,說(shuō)明NiR基因已成功插入到表達(dá)載體中,見(jiàn)圖3。

圖4 pET-28a(+)-nir-BL21在不同誘導(dǎo)溫度下目的蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Protein expression levels of pET-28a(+)-nir-BL21 under the three induction temperatures注:M:蛋白Marker;bi:誘導(dǎo)前的菌體裂解液;s:裂解液離心后的上清液;p:裂解液離心后的沉淀;Ft:流穿組分;A:上樣后用Ni-Buffer A溶液清洗時(shí)的洗脫組分;25、50、75、250、500:用25、50、75、250、500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫柱子時(shí)的洗脫組分;圖5同。

圖5 pET-32a(+)-nir-BL21在不同誘導(dǎo)溫度下目的蛋白的表達(dá)情況Fig.5 Protein expression levels of pET-32a(+)-nir-BL21 under the three induction temperatures

圖3 兩種不同表達(dá)載體的菌落PCR鑒定Fig.3 The colony PCR identification oftwo kinds of transformant注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker;1～8：pET-32a(+)-nir-E. coli Top 10的單菌落;9～16：pET-28a(+)-nir-E. coli Top 10的單菌落。

2.3 NiR在不同溫度和不同質(zhì)粒下的表達(dá)結(jié)果分析

pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21在不同溫度下NiR表達(dá)情況如圖4、圖5所示。兩基因工程菌在16、25、37 ℃[21-23]誘導(dǎo)下,裂解液沉淀中均含有大量目的蛋白,說(shuō)明重組NiR主要以難溶于緩沖液的包涵體形式表達(dá)。當(dāng)外源基因在原核細(xì)胞(特別是E.coli)中表達(dá)時(shí),由于表達(dá)速率較快,容易形成不溶性蛋白質(zhì)顆粒,即包涵體。包涵體可改變大腸桿菌的光散射性質(zhì),使其在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)表現(xiàn)為不定形、卵圓形或圓形等[24]。

由圖4和圖5可以看出洗脫液中咪唑濃度為25、50、75和250 mmol/L時(shí),洗脫組分中均含有重組NiR蛋白(箭頭所指處),且在250 mmol/L咪唑的洗脫組分中含量最高,75 mmol/L咪唑的洗脫組分次之,500 mmol/L咪唑的洗脫組分幾乎不含重組NiR蛋白。

比較分析兩重組菌在三個(gè)不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)情況。由圖4和圖5可知,NiR蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度的升高而減少,誘導(dǎo)溫度為16 ℃時(shí)重組NiR表達(dá)量最高。降低誘導(dǎo)溫度不僅可以降低蛋白質(zhì)的表達(dá)速度,而且也可以降低無(wú)活性聚集體的形成速率和疏水性相互作用,有利于蛋白質(zhì)的折疊和可溶性表達(dá)[25]。

同一誘導(dǎo)條件下,重組子pET-28a(+)-nir-BL21裂解液的上清中目的蛋白含量更多,說(shuō)明與pET-32a(+)相比,pET-28a(+)質(zhì)粒載體更有利于重組NiR蛋白的可溶性表達(dá),有利于后續(xù)的分離純化操作,因此選用pET-28a(+)-nir-BL21作為基因工程菌供后繼研究。

2.4 NiR的編碼基因?qū)λ拗骷?xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果分析

E.coliBL21(DE3)和pET-28a(+)-nir-BL21的生長(zhǎng)曲線如圖6所示,兩菌株在第24 h時(shí)的OD600值比較如圖7所示。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,pET-28a(+)-nir-BL21的生長(zhǎng)速率稍快于E.coliBL21(DE3),兩者同時(shí)在第5 h到達(dá)穩(wěn)定期。最終E.coliBL21(DE3)的OD600值穩(wěn)定于0.33左右,pET-28a(+)-nir-BL21的OD600值穩(wěn)定于0.37左右,具有顯著差異(P<0.05)?？傮w來(lái)說(shuō),pET-28a(+)-nir-BL21的生長(zhǎng)活力高于E.coliBL21(DE3),推測(cè)向宿主菌E.coliBL21(DE3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒載體pET-28a(+)-nir后,可能對(duì)其生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。

圖6 E. coli BL21(DE3)和pET-28a(+)-nir-BL21的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of E. coli BL21(DE3)and pET-28a(+)-nir-BL21

圖7 E. coli BL21(DE3)和pET-28a(+)-nir-BL21在24 h時(shí)的OD600值Fig.7 OD600 values of E. coli BL21(DE3)and pET-28a(+)-nir-BL21 at the 24 h

3 結(jié)論

本文對(duì)B.cereusLJ01中NiR基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并利用克隆表達(dá)技術(shù)構(gòu)建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,通過(guò)比較不同誘導(dǎo)條件下兩種重組子的NiR表達(dá)水平,確定了pET-28a(+)-nir-BL21為開(kāi)展后繼工作的基因工程菌株,誘導(dǎo)條件為16 ℃、180 r/min下震蕩培養(yǎng)22 h。對(duì)蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusLJ01的NiR基因進(jìn)行克隆和異源表達(dá),為進(jìn)一步了解該NiR的理化性質(zhì)及用于食品中NIT的控制提供基礎(chǔ)支撐,同時(shí)為B.cereusLJ01中NiR的構(gòu)效與NIT降解能力的內(nèi)在關(guān)聯(lián)等深入研究奠定基礎(chǔ)。