不同聚合度板栗殼原花青素的體外抗氧化活性、抑菌活性及其組成分析

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(1.武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院,湖北武漢 430205;2.武漢工程大學化工與制藥學院,湖北武漢 430205)

板栗(CastanetsMollissimaBlume)為殼斗科栗屬堅果類植物[1],在中國有幾千年的栽培歷史,且種植分布已達26個省。板栗作為我國傳統(tǒng)的農副產品,年產量高達數百萬噸,占世界板栗總產量的3/4[2]。據資料顯示[3],板栗中富含蛋白質、多種維生素和礦物質營養(yǎng)元素。在板栗工業(yè)化生產的過程中會產生大量的板栗殼,總量約8.9～13.5萬噸/年,板栗殼中富含具有抗氧化活性的多酚類物質,包括原花青素和鞣花單寧。作為副產物的板栗殼仍主要以燃燒、廢棄等方式處理,既不利于環(huán)保,又不利于其經濟價值和藥用價值的充分利用。因此,研究板栗殼原花青素的生物活性,將其高值化利用具有重要的現實意義。

原花青素主要是由兒茶素或者其衍生物等黃烷醇單體以C-C鍵連接而成的多酚化合物[4]。多項研究表明板栗殼原花青素具有抗氧化、抗自由基、抗腫瘤以及抑菌殺菌等生理活性[5-6],但這些生理活性的強弱與原花青素的聚合度密切相關[7]。Du等[8]發(fā)現,原花青素單體上羥基個數會影響抗氧化活性,當聚合度的某些連接方式占據了羥基周圍的空間會降低抗氧化活性。Torres等[9]發(fā)現原花青素對氧自由基的清除能力在聚合度小于5時差別不明顯,但卻顯著高于六聚體。Wu等[10]研究發(fā)現蓮蓬原花青素不同低聚體的抗氧化活性有顯著差異,其抗氧化機制為通過形成加合物而清除羰基自由基。目前,對板栗殼原花青素的研究主要集中在提取工藝、抗氧化、穩(wěn)定性研究等方面,但對于板栗殼原花青素聚合度與功效關系的研究還很缺乏。

本研究采用不同極性溶劑萃取法得到不同聚合度的板栗殼原花青素[11],研究板栗殼原花青素聚合度與抗氧化性和抑菌活性之間的關系,采用高效液相色譜和高分辨質譜對其活性最高的級分進行組分分析,為進一步開發(fā)利用板栗殼資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生板栗 采自山東省祁蒙山;沒食子酸、兒茶素類化合物(沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯)、維生素C等 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;過硫酸鉀、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氟乙酸、ABTS、DPPH自由基(2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基)等 國藥集團公司;金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25904)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 43895)、沙門氏菌(SalmonellaATCC 13076) 由本實驗室提供,LB培養(yǎng)基(牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂) 國藥基團公司。

UV-1800紫外可見光分光光度計 上海美諾達儀器有限公司;Tensor 27 FT-IR光譜儀(Bruker)、Agilent 1290高效液相儀 美國安捷倫科技公司;Thermo LTQ-Orbitrap XL高分辨質譜 美國賽默飛世爾科技公司;HD-A層析圖譜采集分析儀、HD-3紫外檢測儀、HL-2S恒流泵、BSZ-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗殼原花青素粗提物的制備 采用本實驗室優(yōu)化得到的最佳提取工藝提取板栗殼中的原花青素[11],將板栗殼粉碎后按照1∶15 g/mL的料液比,采用70%乙醇水溶液在65 ℃條件下提取90 min后得板栗殼原花青素粗提取液,對其進行真空抽濾,并在40 ℃下真空濃縮,得到粗提液,再經冷凍干燥得到紅棕色的板栗殼粗提物,編號為F1,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 板栗殼原花青素的純化和分級 參考Saucier等[12]的方法稍作修改,由于AB-8大孔樹脂具有弱極性,對極性較低的低聚原花青素吸附效果較好,故采用AB-8大孔樹脂純化F1,將處理好的AB-8大孔樹脂濕法裝柱并平衡靜置12 h后,將板栗殼原花青素粗提液以1.0 mL/min的流速上柱,吸附裝柱,吸附平衡后,用高極性的蒸餾水洗去水溶性雜質和極性較高且聚合度高的原花青素,用50%乙醇以1.0 mL/min的流速洗脫樣品,收集洗脫液,45 ℃真空濃縮,濃縮液與原樣品體積比約為1∶3,冷凍干燥得紅棕色的原花青素初級純化樣品,編號為F2。將F2配制為濃度為8～10 mg/mL的水溶液,用等體積石油醚萃取,收集水層,加入等體積二氯甲烷,靜置后收集水層,再加入等體積乙酸乙酯,靜置分層后得水層和乙酸乙酯層,收集乙酸乙酯層樣品和水層樣品,45 ℃真空濃縮,冷凍干燥,得到乙酸乙酯層淺紅色原花青素粉末,編號為F3,水層深紅棕色原花青素粉末,編號為F4,備用。

1.2.3 板栗殼原花青素純度和聚合度的測定 采用傳統(tǒng)香草醛法測定純度,改良香草醛法測定平均聚合度[13-14]。

1.2.3.1 原花青素質量濃度標準曲線 以甲醇為溶劑,配制1.0 mg/mL的兒茶素標準溶液,移取標準溶液分別稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mg/mL的標準溶液,采用硫酸-香草醛比色法[13],將標準溶液、濃度為30 g/L的香草醛-甲醇溶液和體積分數為30%的硫酸-甲醇溶液按照1∶5∶5的比例混合,于30 ℃避光反應15 min后測定500 nm處的吸光度值。繪制標準曲線,得到回歸方程:y=1.10648x+0.01277,R2=0.9994(x表示原花青素濃度mg/mL,y表示吸光度值)。

1.2.3.2 板栗殼原花青素純度的測定 將樣品F1～F4配制成一定濃度的樣品溶液,移取1 mL樣品溶液,采用硫酸-香草醛比色法,將測得吸光度值代入原花青素質量濃度回歸方程。

板栗殼原花青素的純度(%)=(C0·V0/m)×100

式中:C0為原花青素質量濃度,mg/mL;V0為樣品定容體積,mL;m為樣品質量,mg。

1.2.3.3 原花青素物質的量濃度標準曲線 以冰乙酸為溶劑,配制濃度為0.05 mg/mL的兒茶素標準溶液,移取標準溶液分別稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25及0.30 mg/mL的標準溶液,采用硫酸-香草醛比色法[13],得到原花青素摩爾濃度與吸光度的標準回歸方程:y=2.2267c-0.0112,R2=0.9996(c表示原花青素的摩爾濃度μmol/mL,y表示吸光度)。

1.2.3.4 板栗殼原花青素平均聚合度的測定 移取1 mL F1～F4的樣品溶液,采用硫酸-香草醛比色法[13],將吸光度值分別代入1.2.3.1和1.2.3.3回歸方程中得到原花青素質量濃度和摩爾濃度。

原花青素的平均聚合度=(C0·V0)/(290×C1·V0)

式中:C1為原花青素質量濃度,mg/mL;V0為樣品定容體積,mL;C2為原花青素摩爾濃度,μmol/mL。

1.2.4 板栗殼原花青素抗氧化活性分析

1.2.4.1 ABTS自由基清除率測定 參考Elmastas等[15]的方法,稍作修改。將7.4×10-3mol/L ABTS與2.6×10-6mol/L過硫酸鉀按體積比1∶1混合,避光放置12～16 h,溶液由藍色變?yōu)榫G色,用95%乙醇或無水乙醇稀釋混合液,使混合液在734 nm處的吸光值在0.7±0.02范圍內;再將混合液分別與濃度為5、15、25、35、45、55、65 μg/mL的F1-F4按體積比10∶1混合放入試管中,VC作為陽性對照,室溫下反應7～10 min,在734 nm處測吸光度值,A1為沒有加入樣品的吸光度值,AS為加入樣品的吸光度值。

ABTS自由基清除率(%)=(A1-AS)/AS×100

1.2.4.2 羥基自由基清除率測定 參考文獻[16-17],稱量13.5 mg的1,10-鄰菲羅琳和16.35 mg的七水硫酸亞鐵于100 mL容量瓶中,再加入0.05 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液至刻度線,混合均勻,標記為A溶液。用50%乙醇水溶液稀釋F1～F4和VC濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL,VC作為陽性對照。再加入1.76 mL的A溶液、0.2 mL的不同濃度樣品和40 μL的3% H2O2溶液,在37 ℃水浴鍋中反應60 min,在510 nm處測吸光度值。AS表示加入樣品的吸光度值,A0表示沒有加入樣品的吸光度值,A1表示沒有加入樣品和H2O2的吸光度值。

羥基自由基清除率(%)=[(AS-A0)/(A1-A0)]×100

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除率測定 參考文獻[17]稍作修改。于100 mL容量瓶中加入0.11 mg維生素B2、149 mg蛋氨酸和8.17 mg氯化硝基四唑氮藍,用0.05 mol/L pH7.8的磷酸鹽緩沖溶液定容混勻,標記為B溶液。將混合B溶液分別與濃度為25、50、150、250、500、750 μg/mL的F1～F4及VC按體積比3∶1混合,VC作為陽性對照。常溫下光照15 min,在560 nm處測吸光度值。A0表示沒有加入樣品的吸光度值;AS表示加入樣品的吸光度值。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(A0-AS)/A0×100

1.2.4.4 總還原能力測定 參考Siddhuraju和Zhu[16-17]等的方法。將1%鐵氰化鉀和0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液分別與濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/mL的F1～F4按體積比1∶1∶1混合,VC作為陽性對照,于50 ℃水浴鍋反應20 min,再加入等體積的10%三氟乙酸,產生沉淀,離心取上清液;將上清液、水以及0.1%氯化鐵按體積比5∶4∶1混合,在700 nm處測吸光度值。

1.2.5 板栗殼原花青素的抑菌活性測定

1.2.5.1 抑菌圈試驗 以F1為測試樣品,采用抑菌圈試驗初步分析其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌的抑菌效果。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌分別接種至無菌生理鹽水中,制成菌種濃度為106～107的懸菌液。吸取懸菌液100 μL加入LB培養(yǎng)基中,涂布均勻。將F1分別用無菌水稀釋成3個濃度,分別為5、10、20 mg/mL。用無菌水作為空白對照,吸取樣品溶液滴于已滅菌的圓形濾紙片上(直徑為6 mm),分別固定在平板上,每個樣品三個平行,在37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h,記錄抑菌圈直徑,取其平均值。

1.2.5.2 最小抑菌濃度(MIC)試驗 取濃度為5 mg/mL的F1～F4溶液,采用二倍稀釋法依次得到五個不同濃度梯度的樣品溶液,吸取1 mL的樣品溶液與4 mL懸菌液于10 mL試管中,放于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h后取出觀察,肉眼可見溶液澄清即溶液完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC[18]。

1.2.6 板栗殼原花青素的組成分析 以甲醇溶液為溶劑,將本實驗中抗氧化活性和抑菌活性最高的級分配制成濃度為1.0 mg/mL的溶液,對其進行高效液相色譜和質譜分析。高效液相色譜條件:色譜柱DIONEX C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:甲醇(B)-體積分數為0.05%三氟乙酸(A),梯度洗脫:0～12 min,A:87%～75%,B:13%～20%;12～23 min,A:75%～20%,B:25%～80%;23～26 min,A:87%,B:13%。流速:0.5 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL。

MS分析條件:色譜柱為Lichrosphers C18柱(4.6 mm×250 mm,5 pm);質譜進樣分流比為1∶1;負離子模式;離子化方式:ESI-;掃描范圍:m/z 50～2000;干燥氣溫度350 ℃;干燥氣流速:15 L/min;噴霧壓力:40 psi;毛細管電壓:3500 V。

1.3 數據分析

采用Origin 8.6作圖,數據采用Excel 2010,SPSS Statistics 25(IBM,Armonk,NY,USA)進行相關性分析,采用Tukey’s HSD法進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 板栗殼原花青素不同級分的純度和平均聚合度

表1 板栗殼原花青素各級分的純度和平均聚合度Table 1 Thepurity and average polymerization degree of procyanidins from chestnut shell

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

采用1.2.2中方法,用不同極性溶劑對板栗殼原花青素粗提物進行分級,各級分的平均聚合度具有顯著差異,具體結果如表1所示。板栗殼PC粗提物的組分復雜,其純度最低(48.0%),而聚合度最高(9.42±0.41),而乙酸乙酯的極性比水和乙醇更小,其萃取物的聚合度最小(3.32±0.34),這一結果與彭芳剛等[14]研究一致。

2.2 板栗殼原花青素抗氧化活性研究

2.2.1 ABTS自由基清除率測定 在氧化劑的作用下,ABTS會被氧化成綠色的ABTS,在自由基存在時ABTS+的產生會被抑制,從而清除自由基[19]。由圖1可知,板栗殼提取物均表現出較強的抗氧化能力,且抗氧化活性均顯著高于VC(P<0.05),當濃度為5 μg/mL時,樣品F1～F4與VC的清除率均低于50%,在樣品濃度達到65 μg/mL時,樣品F3清除率達到97.9%,而VC清除率在30%以下,與Seo等[20]的研究結果相同。樣品F1、F2、F3、F4和VC清除ABTS自由基的IC50值分別為19.83、17.00、11.24、17.79和58.62 μg/mL,清除率VC

圖1 板栗殼PC對ABTS自由基的清除活性Fig.1 ABTS radical scavenging activity ofthe procyanidins from chestnut shell

2.2.2 羥基自由基清除率測定 不同聚合度板栗殼原花青素對羥基自由基清除率如圖2所示,實驗結果顯示,板栗殼原花青素和VC清除羥基自由基能力隨樣品濃度的增加而變大,當樣品濃度為5 mg/mL時,清除率基本趨于穩(wěn)定。樣品F1、F2、F3、F4及VC清除羥基自由基IC50值分別為1.62、2.15、1.18、1.49和1.80 mg/mL,清除率為F2

圖2 板栗殼PC對羥基自由基的清除活性Fig.2 Hydroxy radical scavenging activity ofthe procyanidins from chestnut shell

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 不同聚合度板栗殼原花青素對超氧陰離子自由基清除率如圖3所示,原花青素和VC清除超氧陰離子自由基能力隨樣品濃度的增加而增加,當濃度達到500 μg/mL時,清除率均趨于穩(wěn)定;樣品F1、F2、F3、F4及VC清除超氧陰離子IC50值分別為109.83、100.40、93.98、103.90和135.39 μg/mL,清除率為VC

圖3 板栗殼PC對超氧陰離子自由基的清除活性Fig.3 Superoxide radical scavenging activity ofthe procyanidins from chestnut shell

2.2.4 總還原力測定 板栗殼原花青素的總還原力結果見圖4,F1～F4及VC的總還原力測定結果為F1

表2 F1對細菌的抑菌圈結果(mm)Table 2 Diameters of inhibition zones of F1(mm)

圖4 板栗殼PC的總還原力Fig.4 Total reduction ability of theprocyanidins from chestnut shell

2.3 板栗殼原花青素抑菌活性和最小抑菌濃度(MIC)

抑菌圈試驗初篩結果顯示,F1對三種試驗菌的抑制作用大小為金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>大腸桿菌(表2),一定濃度的F1能有效抑制金黃色葡萄球菌,且隨濃度升高其抑制效果增強(圖5),但是,其對沙門氏菌和大腸桿菌抑制作用不明顯。進一步研究F1-F4對金黃色葡萄球菌的MIC,結果如表3所示。由表3可以看出,聚合度最低的F3對金黃色葡萄球菌抑制效果最佳,其MIC為0.31 mg/mL,而F2和F4對金黃色葡萄球菌的抑制效果次之,MIC均為0.63 mg/mL,F1對金黃色葡萄球菌的抑制率最弱,MIC為1.25 mg/mL,這一結果表明,原花青素的抑菌濃度與原花青素純度和聚合度有關,原花青素純度越高、聚合度越低,抑菌效果越好。

圖5 F1對金黃色葡萄球菌抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of F1 on Staphylococcus aureus

表3 F1-F4對金黃色葡萄球菌的MICTable 3 MIC of F1-F4 on Staphylococcus aureus

2.4 板栗殼原花青素級分F3組成分析

六種標準品混合溶液的HPLC出峰圖見如圖6。圖6中的峰1～6分別代表沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯及表兒茶素沒食子酸酯這6種標準品?？寡趸耙志钚宰罡呒壏諪3的HPLC測定結果如圖7,組分分析見表4。通過與標準品共的保留時間對比,確定峰1(4.201 min)為沒食子酸,峰4(13.615 min)為兒茶素/表兒茶素,可能由于級分F3中含有大量聚合體,其在高效液相色譜中發(fā)生重疊,形成大峰而無法分離開,影響單體出峰[14]。由于板栗殼原花青素組分復雜,標準品數量有限,不能全面分析其組成情況,因此,下一步采用高分辨質譜進一步對F3組成進行分析。

圖6 不同標準品混合溶液的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of mixedsolution of different standard products注:峰:1:沒食子酸;2:沒食子兒茶素;3:表沒食子兒茶素沒食子酸酯;4:表兒茶素5:沒食子兒茶素沒食子酸酯;6:表兒茶素沒食子酸酯。

圖7 F3的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of F3注:峰:1:沒食子酸;4:表兒茶素。

表4 F3的組分信息
Table 4 Composition information of F3

峰號保留時間(min)分子量名稱分子式14.201170沒食子酸C7H6O5413.615290兒茶素/表兒茶素C15H14O6

表5 F3中質荷比分析結果Table 5 The analysis results of F3

對F3進行高分辨質譜分析,結果見圖8,通過將F3的高效液相圖中保留時間與標準品保留時間對比和不同質荷比的分子離子峰與文獻[23-26]報道相比較,鑒定出板栗殼原花青素級分F3的組分,其中m/z 169.0085為沒食子酸,m/z 289.0650為兒茶素/表兒茶素及m/z 577.1201為原花青素B型二聚體,結果如表5。由于板栗殼提取物中成分復雜,并且原花青素通過黃烷醇聚合而成,原花青素的各聚合體之間的極性相近。因此,高分辨質譜只能很好分離出單體和二聚體。故板栗殼原花青素中含有沒食子酸、兒茶素/表兒茶素和原花青素B型二聚體。

圖8 F3的ESI質譜圖Fig.8 ESI-MS spectrum of F3注:峰:1:沒食子酸;2:兒茶素/表兒茶素;3:原花青素B型二聚體。

3 討論

本實驗結果顯示,板栗殼原花青素級分F3中含有沒食子酸、兒茶素/表兒茶素及原花青素B型二聚體等多酚類化合物,其結構中含有多個酚羥基,而酚羥基的數量是決定黃酮類化合物抗氧化活性的重要因素[27],可能是使板栗殼提取物具有較高抗氧化活性的原因。對于不同聚合度的原花青素來說,抗氧化性的差異是普遍存在的,造成抗氧化差異性的原因可能是:純化工藝除掉了一部分對自由基沒有抗氧化活性的有機物,使多酚類物質相對含量增加,從而導致其自由基清除率增加[28];原花青素的聚合度影響其分子量大小,由此造成的空間結構的變化是影響原花青素抗氧化活性的主要因素。Caillet等[29]研究證明,原花青素分子中苯環(huán)上羥基電子離域是起主要抗氧化活性作用的原因,高聚體原花青素分子間的空隙會越來越狹窄,導致高聚體原花青素像一個緊湊的“密封體”,不利于羥基電子離域,即抑制了羥基自由基發(fā)揮活性作用,從而降低了原花青素的抗氧化性。孫蕓等[30]研究葡萄籽原花青素不同聚合度與自由基清除能力關系中發(fā)現,在以水為溶劑的體系中,原花青素可能存在如蛋白質一樣的二級結構或三級結構,分子中各基團之間通過疏水鍵和氫鍵相互作用來維持結構穩(wěn)定,原花青素分子中一部分酚羥基形成分子內氫鍵,導致其與自由基反應的活性降低。另一部分酚羥基與水作用,發(fā)揮其抗氧化作用。故隨著原花青素的聚合度增加,分子中更多的酚羥基形成分子內氫鍵,使其清除自由基能力下降。高分辨液相質譜分析發(fā)現,板栗殼原花青素中含有兒茶素/表兒茶素。有研究表明[31-32],細菌細胞膜的磷脂雙分子層與兒茶素類化合物相結合,導致細菌細胞膜被破壞,胞內蛋白質和糖類物質發(fā)生滲漏,兒茶素分子中的酚羥基與二氫葉酸合成酶肽鍵上的氨基酸殘基結合,使細菌合成嘌呤和嘧啶的二氫葉酸還原酶失活,影響細菌核酸的合成,從而使細菌的生長繁殖被抑制。不同細菌對多酚的耐受力不同,曾亮等[33]研究發(fā)現,兒茶素類化合物對革蘭氏陽性菌的抑制率比革蘭氏陰性菌高,其細胞壁存在外膜結構對細胞膜起到一定的保護作用。這可能是板栗殼原花青素對金黃色葡萄球菌有抑制作用,而對沙門氏菌及大腸桿菌抑制作用不明顯的原因。

4 結論

本實驗以板栗殼為原料,通過不同極性溶劑萃取得到不同聚合度的板栗殼原花青素,抗氧化活性實驗結果顯示,不同聚合度的板栗殼原花青素均具有顯著的ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除活性及總還原能力,且抗氧化活性隨聚合度的增大而減小。聚合度最低的級分F3具有最高的抗氧化活性,同時,抑菌實驗結果顯示,板栗殼原花青素的抑菌活性也隨聚合度增加而減小。高分辨質譜分析結果顯示,板栗殼原花青素的乙酸乙酯萃取物層(F3)主要含有3種原花青素,分別為沒食子酸、兒茶素/表兒茶素和原花青素B型二聚體。本研究為將板栗殼原花青素開發(fā)成天然抗氧化劑和抑菌劑提供了一定參考依據。