響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁工藝

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院,山西太谷 030801)

靈芝[Ganodermalucidum(Ley.ex.Fr)Karst.]屬于無褶菌目,靈芝科,靈芝屬,別名靈芝草、仙草等,是一種食藥兼用的大型真菌,且在我國分布廣泛[1-2]。近年來,靈芝中的活性物質(zhì),如靈芝多糖、總?cè)频染軌虮挥行Х蛛x出來[3-5]。這些生物活性物質(zhì)主要富集在靈芝孢子中[6],具有抗腫瘤[7-8]、增強(qiáng)免疫[9-10]、改善睡眠[11]、抗抑郁[12]、消炎止血[13]、抗癌[14]等功效。

靈芝孢子壁是由支柱連接的雙層結(jié)構(gòu)[15],十分堅(jiān)韌且耐酸耐堿,致使孢子內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)不能很好的溶出。當(dāng)靈芝孢子粉進(jìn)入人體后很難被胃液消化,從而阻礙了人體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。目前,靈芝孢子粉大多采用生物酶解法、化學(xué)法、物理法、機(jī)械法以及綜合法的破壁工藝,其中生物酶解法和化學(xué)法處理過程較為耗時(shí)、破壁率較低,且破壁后不容易將加入的酶以及化學(xué)物質(zhì)去除;物理法和機(jī)械法投資成本高,破壁后碎片太多[16]。

高壓脈沖電場(High Vltage Pulsed Electrical Field)技術(shù)是一種非熱力殺菌技術(shù)[17],它利用細(xì)胞膜電穿孔原理,短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成破壞,致使細(xì)胞破壁[18]。Mohsen[19]綜述了高壓電場在食品工業(yè)中的應(yīng)用,包括食品干燥、冷藏、冷凍、解凍、延長食品貨架期和提取生物化合物等。我國高壓脈沖電場更多地應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的輔助提取[20-22]以及藻類的破壁[23]。高壓脈沖電場破壁技術(shù)具有無污染,耗時(shí)短,產(chǎn)生的熱能少等優(yōu)點(diǎn),且也不會(huì)產(chǎn)生過多碎片。為優(yōu)化靈芝孢子粉破壁工藝,本試驗(yàn)以靈芝孢子粉為試驗(yàn)對(duì)象,以電場強(qiáng)度、脈沖個(gè)數(shù)和脈沖寬度為試驗(yàn)因子進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),為破壁靈芝孢子粉的生產(chǎn)和高壓脈沖電場技術(shù)的新領(lǐng)域應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

未破壁靈芝孢子粉 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供；硫酸鋅、無水乙醇、乙酸乙酯、高氯酸 均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、熊果酸 均為標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限公司;香草醛 分析純，北京索萊寶科技有限公司。

ECM830型高壓脈沖電場發(fā)生器 美國BTX儀器公司;CMM-15E型透反射金相顯微鏡 上海長方光學(xué)儀器有限公司;DHG-9023A型熱風(fēng)干燥箱 無錫三鑫精工電氣設(shè)備有限公司;超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟超聲清洗機(jī)有限公司;BTX 610電極杯(物料添加區(qū)寬度規(guī)格為1 mm) 香港友誠生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝孢子粉試樣處理及破壁率測定

1.2.1.1 靈芝孢子粉破壁工藝 工藝流程:靈芝孢子粉→配液→高壓脈沖電場破壁→60 ℃干燥→待測。

取500 μL 0.05 g/mL靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)懸浮液定容于50 mL,混勻后取適量移入電極杯,設(shè)定相應(yīng)的電場強(qiáng)度、脈沖個(gè)數(shù)和脈沖寬度,置于高壓脈沖電場發(fā)生器中進(jìn)行破壁試驗(yàn),得到破壁靈芝孢子粉樣液。破壁過程中,懸浮液溫度有升高現(xiàn)象,經(jīng)測定最高溫度不超過40 ℃。

1.2.1.2 靈芝孢子粉破壁率標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別稱取靈芝孢子粉0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 g,使用0.07 g/mL硫酸鋅定容于50 mL容量瓶,各取10 μL于400倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。測定得靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=989.31839x+0.7085,R2=0.9989。式中:y代表每個(gè)計(jì)數(shù)單位的孢子數(shù)(個(gè));x代表未破壁靈芝孢子粉稱樣量(g)。

1.2.1.3 靈芝孢子粉破壁率測定 參照倪偉鋒等人[24]改進(jìn)的破壁率測定方法進(jìn)行測定。經(jīng)高壓脈沖電場處理后的靈芝孢子粉樣液60 ℃烘箱中烘干,于1.5 mL離心管4 ℃避光冷藏。稱取0.10 g使用0.07 g/mL硫酸鋅定容于50 mL容量瓶,取10 μL于血球計(jì)數(shù)板上,400倍顯微鏡下觀察并記錄完整孢子數(shù)。其中,完整孢子為未破壁孢子,除完整孢子外其余均視為已破壁孢子。破壁率按下式計(jì)算。

X(%)=(N1-N2)/N1×100

式中:X-靈芝孢子粉的破壁率(%);N1-從標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的與待測樣品相同質(zhì)量的完整孢子個(gè)數(shù);N2-計(jì)數(shù)得到的破壁孢子粉樣品中完整孢子的個(gè)數(shù)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 影響靈芝孢子粉破壁率的主要因素有:電場強(qiáng)度、脈沖個(gè)數(shù)、脈沖寬度,分別考察它們對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.2.1 電場強(qiáng)度對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響 固定脈沖個(gè)數(shù)30000個(gè),脈沖寬度50 μs,考察電場強(qiáng)度(10、15、20、25、30 kV/cm)對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.2.2 脈沖個(gè)數(shù)對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響 固定電場強(qiáng)度20 kV/cm,脈沖寬度50 μs,考察脈沖個(gè)數(shù)(10000、20000、30000、40000、50000個(gè))對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.2.3 脈沖寬度對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響 固定電場強(qiáng)度20 kV/cm,脈沖個(gè)數(shù)30000個(gè),考察脈沖寬度(10、30、50、70、90 μs)對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以靈芝孢子粉破壁率為響應(yīng)值,以電場強(qiáng)度(A)、脈沖個(gè)數(shù)(B)以及脈沖寬度(C)為試驗(yàn)因子,共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因子水平編碼表見表1。

表1 靈芝孢子粉高壓脈沖電場響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平編碼表Table 1 The code table of factors and levels for high-voltage pulsed electric field response surface test of ganoderma spores powder

1.2.4 靈芝孢子粉活性物質(zhì)溶出量測定

1.2.4.1 靈芝孢子粉粗多糖溶出量的測定 多糖溶出量按照NY/T1676-2008苯酚-硫酸法[25]進(jìn)行測定。

以0.1 mg/mL葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品,以葡萄質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得葡萄糖質(zhì)量與吸光值的回歸方程為:y=0.0106x+0.0008,R2=0.9980。稱取破壁靈芝孢子粉0.25 g,經(jīng)超聲提取后離心,殘?jiān)慈肟潭仍嚬?沸水浴2 h,待冷卻至室溫后,過濾后合并洗滌液,加水定容至刻度。測定時(shí)取1 mL待測液,加入蒸餾水、苯酚、濃硫酸,30 ℃水浴保溫20 min,于490 nm處比色,測定其吸光值。樣品中的粗多糖溶出量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示,結(jié)果按式(1)計(jì)算。

式(1)

式中:m1-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中含葡萄糖量(μg);V1-樣品定容體積(mL);V2-比色測定時(shí)所移取樣品測定液的體積(mL);m2-樣品質(zhì)量(g);0.9-葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.2.4.2 靈芝孢子粉總?cè)迫艹隽康臏y定 總?cè)迫艹隽繀⒄贞惞谥莸萚26]的方法進(jìn)行測定。

0.1 mg/mL熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,以熊果酸質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得熊果酸質(zhì)量與吸光值的回歸方程為:y=0.0053x+0.0038,R2=0.9982。稱取破壁靈芝孢子粉0.50 g,乙酸乙酯溶解,經(jīng)超聲提取后過濾,續(xù)濾液用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶。測定時(shí)取1 mL待測液,于100 ℃水浴蒸干,加入香草醛-冰乙酸溶液、高氯酸,65 ℃水浴保溫45 min,轉(zhuǎn)入冰浴后加入冰乙酸,15 min后于548 nm處比色,測定其吸光值。樣品中的總?cè)迫艹隽恳再|(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示,結(jié)果按式(2)計(jì)算。

式(2)

式中:m1-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中含熊果酸量(μg);V1-樣品定容體積(mL);V2-比色測定時(shí)所移取樣品測定液的體積(mL);m2-樣品質(zhì)量(g)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 每組單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值,采用EXCEL 2003進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,采用Design-Expert 10.0.7進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析,采用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 電場強(qiáng)度對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響 由圖1可知,在靈芝孢子粉破壁過程中,隨著電場強(qiáng)度的增加,破壁率呈現(xiàn)上升趨勢。這可能是電場強(qiáng)度的增加產(chǎn)生的能量越大,對(duì)靈芝孢子粉細(xì)胞壁的破壞作用越大,使破壁率大有提高[27]。但當(dāng)電場強(qiáng)度過大時(shí),對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用越大,但也可使部分糖苷鍵發(fā)生斷裂,使細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)發(fā)生降解[28]。另外,考慮到能耗的損失問題,在響應(yīng)面試驗(yàn)中避免采用過高的電場強(qiáng)度,以20～30 kV/cm為宜。

圖1 電場強(qiáng)度對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響Fig.1 Effect of electric field intensity on the rate of wall breaking

2.1.2 脈沖個(gè)數(shù)對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響 由圖2可知,隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加,靈芝孢子粉破壁先呈現(xiàn)上升趨勢;在脈沖個(gè)數(shù)達(dá)到40000個(gè)時(shí),破壁率達(dá)到最大為70.2%±1.64%。隨后,破壁率隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加,呈現(xiàn)下降趨勢。增大脈沖個(gè)數(shù),則脈沖作用時(shí)間延長,即脈沖效應(yīng)累積,在脈沖個(gè)數(shù)達(dá)到40000個(gè)時(shí),脈沖效應(yīng)在靈芝孢子壁上累積達(dá)到最大,進(jìn)而使破壁率達(dá)到最大。馮彩霞[29]在使用顯微鏡觀察破壁靈芝孢子粉時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)脈沖個(gè)數(shù)過大時(shí),靈芝孢子粉粘結(jié)成團(tuán),脈沖與單個(gè)靈芝孢子粉接觸面積變小,進(jìn)而導(dǎo)致破壁率降低。因此,在響應(yīng)面試驗(yàn)中脈沖個(gè)數(shù)宜采30000～50000個(gè)為宜。

圖2 脈沖個(gè)數(shù)對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響Fig.2 Effect of the number of pulses on the rate of wall breaking

2.1.3 脈沖寬度對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響 由圖3可知,隨著脈沖寬度的增加,靈芝孢子粉破壁率呈現(xiàn)快速上升趨勢;脈沖寬度增加至50 μs時(shí),靈芝孢子粉破壁率的增加逐漸趨于穩(wěn)定;當(dāng)脈沖寬度達(dá)到70 μs時(shí),破壁率達(dá)到最大值,為68.7%±1.02%。周連寧等[23]進(jìn)行了不同高壓脈沖電場條件對(duì)小球藻破壁的影響研究,其結(jié)果表明,隨著脈沖寬度的增大,小球藻的破壁率也呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。脈沖寬度即單個(gè)脈沖作用于靈芝孢子粉細(xì)胞壁的時(shí)間,增加脈沖寬度,直接增加了單個(gè)脈沖對(duì)靈芝孢子粉細(xì)胞壁的破壞力,脈沖效應(yīng)逐漸積累,最后達(dá)到了較高的破壁效果。因此,在響應(yīng)面試驗(yàn)中脈沖寬度采用50～90 μs為宜。

圖3 脈沖寬度對(duì)靈芝孢子粉破壁率的影響Fig.3 Effect of pulse width on the rate of wall breaking

2.2 靈芝孢子粉破壁工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表3 方差分析與顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance and significance test

表2 靈芝孢子粉破壁工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results of wall breaking technology for ganoderma spores powder

2.2.2 模型建立與方差分析 對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3),得到靈芝孢子粉破壁率回歸方程:Y=64.06+6.14A+2.64B+4.03C+1.72AB+5.05AC-1.9BC-8.97A2-7.17B2-6.04C2。

通過比較P值可判斷回歸模型中各因素影響的顯著程度。模型中因素AB、BC為不顯著項(xiàng)(P>0.05),其余均為極顯著項(xiàng)(P≤0.01)。各因素對(duì)靈芝孢子破壁效果從大到小依次為:電場強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖個(gè)數(shù)。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 圖4～圖6可直觀地反映電場強(qiáng)度、脈沖個(gè)數(shù)和脈沖寬度三試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值破壁率的影響。在試驗(yàn)范圍內(nèi),響應(yīng)值破壁率先不同程度地增大,當(dāng)響應(yīng)值增大到最大值后,響應(yīng)值破壁率又呈現(xiàn)不同程度地下降趨勢。因此,在試驗(yàn)因子水平范圍內(nèi),存在靈芝孢子粉高壓脈沖電場的最大破壁率。

由圖4響應(yīng)曲面可知,靈芝孢子粉破壁率隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加而增加,趨于平緩后略有下降;靈芝孢子粉破壁率隨著電場強(qiáng)度的增加快速增加至最大值,而后略有下降。由圖5響應(yīng)曲面可知,在較低的脈沖寬度范圍內(nèi),靈芝孢子粉破壁率隨著脈沖寬度的增加而迅速增加,之后隨著脈沖寬度的繼續(xù)增大,破壁率增加趨勢變得平緩,但最高值與最低值之間變化幅度較大;靈芝孢子粉破壁率隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加呈現(xiàn)先增加后略有下降的趨勢,但下降趨勢較為平緩。

由圖6響應(yīng)曲面可知,隨著脈沖寬度的增加,響應(yīng)值破壁率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢,但最高值與最低值之間變化幅度較小;靈芝孢子粉破壁率隨著電場強(qiáng)度的增加而逐步增加,當(dāng)電場強(qiáng)度進(jìn)一步增大時(shí),靈芝孢子粉破壁率出現(xiàn)下降趨勢。圖6等高線圖趨于橢圓形,表明電場強(qiáng)度與脈沖寬度的交互作用顯著。其可能的原因是:電場強(qiáng)度越大,脈沖沖擊到靈芝孢子壁的能量越大,進(jìn)而引起胞壁的通透性增大,更易被擊穿;脈沖個(gè)數(shù)是影響脈沖作用時(shí)間的主要因素,脈沖個(gè)數(shù)的增加表明脈沖作用總時(shí)間的延長。當(dāng)電場強(qiáng)度與脈沖個(gè)數(shù)二者的破壁效應(yīng)累加時(shí),即相當(dāng)于高壓脈沖作用于通透性較大的細(xì)胞壁上,脈沖效應(yīng)長時(shí)間累積后對(duì)孢壁造成破壞。因而,電場強(qiáng)度和脈沖個(gè)數(shù)的互作效應(yīng)對(duì)靈芝孢子粉的破壁效果較為顯著。

圖4 電場強(qiáng)度和脈沖個(gè)數(shù)對(duì)靈芝孢子粉破壁率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour line of the effect of electric field intensity and number of pulses on the rate of wall breaking

圖5 脈沖個(gè)數(shù)和脈沖寬度對(duì)靈芝孢子粉破壁率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour line of the influence of pulse number and pulse width on the rate of wall breaking

圖6 電場強(qiáng)度和脈沖寬度對(duì)靈芝孢子粉破壁率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour line of the effect of electric field intensity and pulse width on the rate of wall breaking

2.2.4 靈芝孢子粉破壁工藝的驗(yàn)證及對(duì)比試驗(yàn) 靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁條件為:電場強(qiáng)度27.52 kV/cm,脈沖寬度80.31 μs,脈沖個(gè)數(shù)41761.11個(gè),靈芝孢子粉破壁率為66.88%?？紤]到儀器參數(shù)設(shè)置及現(xiàn)實(shí)因素,取電場強(qiáng)度25 kV/cm、脈沖寬度80 μs,脈沖個(gè)數(shù)40000個(gè),在此條件下,重復(fù)3次試驗(yàn)得靈芝孢子粉破壁率平均值為66.74%±0.03%,與預(yù)測值相對(duì)誤差小于3%,回歸模型可靠。唐慶華等[30]使用低溫研磨粉碎技術(shù)進(jìn)行了峨眉山靈芝孢子破壁試驗(yàn),結(jié)果表明靈芝孢子粉破壁率僅為46%,而本試驗(yàn)所使用的高壓脈沖電場破壁技術(shù)將靈芝孢子粉破壁率提高了45%。

2.3 靈芝孢子粉活性物質(zhì)溶出量分析

靈芝多糖和三萜是靈芝的主要生物活性物質(zhì)[31-32],破壁前靈芝孢子粉粗多糖和總?cè)坪糠謩e為(0.88±0.02) g/100 g和(1.63±0.03) g/100 g,而經(jīng)高壓脈沖電場破壁后的靈芝孢子粉中,粗多糖和總?cè)迫艹隽糠謩e為(0.99±0.11) g/100 g和(1.79±0.03) g/100 g。試驗(yàn)結(jié)果表明:使用高壓脈沖電場破壁工藝對(duì)靈芝孢子粉破壁后,孢內(nèi)活性物質(zhì)溶出量均有所提高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用高壓脈沖電場對(duì)靈芝孢子粉進(jìn)行了單因素破壁試驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。其結(jié)果為:電場強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖個(gè)數(shù)對(duì)靈芝孢子粉破壁試驗(yàn)結(jié)果表明,它們對(duì)破壁率的影響順序?yàn)?電場強(qiáng)度>脈沖寬度>脈沖個(gè)數(shù)。在對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型綜合分析的基礎(chǔ)上,得到靈芝孢子粉高壓脈沖電場破壁的最佳工藝參數(shù):電場強(qiáng)度25 kV/cm,脈沖寬度80 μs,脈沖個(gè)數(shù)40000個(gè),靈芝孢子粉破壁率達(dá)到66.74%±0.03%。

高壓脈沖電場破壁破壁后的靈芝孢子粉中粗多糖和總?cè)迫艹隽糠謩e為(0.99±0.11) g/100 g和(1.79±0.03) g/100 g?？梢?該工藝既能提高靈芝孢子粉較高破壁率,也可避免因處理時(shí)間長對(duì)靈芝孢子粉內(nèi)部活性物質(zhì)(粗多糖以及總?cè)?的破壞,可為靈芝孢子粉破壁以及高壓脈沖電場的新領(lǐng)域應(yīng)用提供參考。