0.1%納米銀溶液作為根管封藥對(duì)犬慢性根尖周炎愈合的影響

姚麗萍 原小慧 劉杰 王曉榮 盧志山

根管消毒是根管治療術(shù)的重要步驟，通過根管消毒起到進(jìn)一步殺滅根管機(jī)械預(yù)備后根管內(nèi)殘余細(xì)菌。藥物消毒是最常用的根管消毒方法，氫氧化鈣是目前最主要的根管內(nèi)消毒藥物[1]。有研究表明，由于氫氧化鈣滲入牙本質(zhì)小管深度有限，導(dǎo)致其不能持續(xù)有效的殺菌[2]、對(duì)糞腸球菌和白色念珠菌的抑菌效果較差，對(duì)生物膜的效果也存在爭議[3]，而且，氫氧化鈣糊劑封藥后難以徹底清除，影響根管充填封閉的嚴(yán)密性[4]。有必要進(jìn)一步探尋安全、高效的根管消毒藥物以抑制根管預(yù)備后根管系統(tǒng)中殘余細(xì)菌并殺滅已經(jīng)形成生物膜的細(xì)菌。

納米銀微粒具備超強(qiáng)的抗菌能力，可以殺死包括金黃色葡萄球菌、肺炎桿菌、大腸桿菌等在內(nèi)的多種細(xì)菌以及真菌、支原體、衣原體等致病微生物材料和方法[5]，與傳統(tǒng)抗生素相比極少產(chǎn)生耐藥性是一很大的優(yōu)勢[6]。研究表明，納米銀對(duì)離體牙牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜有較強(qiáng)的滲透能力和殺菌作用，其殺菌作用隨處理時(shí)間的延長而增強(qiáng)，是一種新型有效的根管消毒藥物[7]。納米銀制劑在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，在口腔潰瘍[8]、種植體表面涂層[9]、樹脂材料[10]等方面的研究正逐步深入，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Beagle犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型，探討0.1%納米銀溶液作為根管封藥對(duì)根尖周病變愈合情況、及根尖周組織炎癥刺激性的影響，以期為探尋新型有效的根管消毒藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 只12 個(gè)月齡，體重在10～12 kg的成年Beagle犬(儀征安立卯生物科技有限公司),無齲齒及牙周病；納米銀(粒徑60～120 nm，上海麥克林試劑)；CBCT(合肥美亞光電技術(shù)有限公司)；便攜式電動(dòng)牙鉆機(jī)、ProTaper鎳鈦根管、直徑1 mm球鉆(Dentsply公司，美國)；速眠新II(敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司)；次氯酸鈉(天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)；氫氧化鈣(天津中鼎生物醫(yī)學(xué)科技有限公司)；總RNA提取試劑盒(B511321，上海生工)；SYBRGreen PCR試劑盒(AQ131)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AE311，北京全式金)。

1.2 比格犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)證。按照每公斤0.08～0.10 ml的劑量，對(duì)Beagle犬進(jìn)行肌肉注射速眠新II，待犬均完全麻醉后將四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，采取仰臥位，用75%的乙醇于右側(cè)上下頜區(qū)域進(jìn)行內(nèi)外消毒，然后在上頜第二、第三前磨牙，下頜第二、第三、第四前磨牙頰舌側(cè)注射5%利多卡因5 ml，進(jìn)行局部浸潤麻醉。按照Silva等[11]的方法構(gòu)建犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型。將上述共30 顆前磨牙開髓，給予拔髓，開放于口腔中7 d，使細(xì)菌感染根管。 7 d后，按照上述方法全麻下，使用Fuji玻璃離子封閉開髓口。在45 d左右完成模型建立。

拍攝CBCT(89 kV， 10 mA， 掃描時(shí)間15 s)，將掃描后圖像數(shù)據(jù)(DICOM格式)導(dǎo)入計(jì)算機(jī)配置為Dell Precision T7600臺(tái)式工作站(中央處理器E5-2643，內(nèi)存32 G DDR3，Win7旗艦版64位操作系統(tǒng))，軟件Mimics 21(Materialise，Leuven，比利時(shí))進(jìn)行牙齒及根尖周透射影的三維重建，并測量根尖周透射影的體積。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將上述建立的30 顆Beagle犬慢性根尖周炎前磨牙，隨機(jī)分為3 組，每組10 顆牙齒，分別為0.1%納米銀溶液組、氫氧化鈣組、空白對(duì)照組。

1.4 根管預(yù)備及根管封藥

將Beagle犬全麻，去除暫封物，依據(jù)CBCT中牙尖到根尖止點(diǎn)距離減去1 mm作為工作長度，采用冠向下法，使用ProTaper旋轉(zhuǎn)鎳鈦銼進(jìn)行根管預(yù)備至F1。1%次氯酸鈉沖洗，無菌紙尖干燥根管。按照下列的方法進(jìn)行根管封藥：① 0.1%納米銀溶液組：將0.1 g納米銀粉放入100 ml去離子水中，超聲震蕩20 min，制成0.1%納米銀懸濁液。使用1 ml、 規(guī)格27 號(hào)針頭無菌注射器將納米銀溶液注入根管內(nèi)，使用15#K銼上下提拉20 次，去除氣泡，再次注入溶液，直到注滿為止； ②氫氧化鈣組：將齒科用氫氧化鈣粉末與溶液調(diào)制成糊狀，用螺旋輸送器導(dǎo)滿根管； ③空白對(duì)照組：干燥根管后，根管內(nèi)未封藥物，直接充填。

每顆牙齒根管封藥后使用Fuji玻璃離子墊底，3M Z350樹脂封閉開髓孔。

1.5 拍攝術(shù)后CBCT

根管封藥4 周后，全麻后拍攝CBCT，使用軟件Mimics 21進(jìn)行牙齒及根尖周透射影的三維重建，測量根尖周牙槽骨破壞體積。

1.6 Real-time PCR檢測IL-6的表達(dá)

拍攝完成CBCT后將動(dòng)物處死,拔除實(shí)驗(yàn)牙后用挖匙刮取牙槽窩內(nèi)的根尖周組織,利用總RNA提取試劑盒提取根尖周組織中的總RNA，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA，反應(yīng)在Real-time PCR檢測儀(羅氏LC96)上進(jìn)行，內(nèi)參基因磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及IL-6引物序列見表1。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，62 ℃退火35 s，共40 個(gè)循環(huán)，溶解曲線97 ℃10 s， 65 ℃ 60 s， 97 ℃1 s。PCR擴(kuò)增后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)分析結(jié)果，根據(jù)陰性對(duì)照調(diào)整閾值和基線以確定各個(gè)標(biāo)本的Ct值，并根據(jù)熔解曲線確定該Ct值是否有效。將結(jié)果導(dǎo)出，采用2-ΔΔCT法分析目的基因在對(duì)照組和各測定組之間的表達(dá)差異，計(jì)算公式如下： ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參， 再求得對(duì)照組ΔCt的平均值，記為ΔCt對(duì)照平均，用各組的ΔCt分別減去ΔCt對(duì)照平均， 求得ΔΔCt值，即ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對(duì)照平均， 再計(jì)算各組2-ΔΔCT值，即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 GAPDH及IL-6引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Beagle犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型的構(gòu)建

將Beagle犬前磨牙開放7 d后封閉開髓孔，經(jīng)過45 d后，拍攝CBCT，獲得DICOM格式的圖像數(shù)據(jù)。利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齒及根尖周組織破壞情況的三維影像(圖1)，可見犬前磨牙均出現(xiàn)根尖周組織破壞，成功構(gòu)建Beagle犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型。

圖1 Beagle犬慢性根尖周炎模型三維重建圖

2.2 根管封藥4周后各組根尖周組織破壞區(qū)的重建及其比較

根管封藥 4周后，再次拍攝CBCT，利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齒及根尖周組織破壞情況的三維影像(圖2)。

圖2 根管預(yù)備并封藥前后對(duì)比根尖周組織破壞三維重建圖

根管封藥4 周后，再次拍攝CBCT，利用Mimics重建CBCT影像，形成牙齒及根尖周組織破壞情況的三維影像。利用Mimics軟件測量各牙齒根尖周破壞的體積(表2)。結(jié)果顯示：根管預(yù)備后，各組封入不同根管封藥，其根尖周破壞的體積都較術(shù)前縮??；0.1%納米銀溶液組根管封藥后根尖周陰影的體積與術(shù)前相比，具有顯著性差異(P<0.01)，氫氧化鈣組根管封藥后與術(shù)前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對(duì)照組術(shù)前與術(shù)后相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 根尖周破壞體積術(shù)前術(shù)后的比較

Tab 2 Comparison of the lesion volume before and after intracanal medicament (n=20, mm3)

表2 根尖周破壞體積術(shù)前術(shù)后的比較

組 別術(shù)前術(shù)后t值P值0.1%納米銀11.80±5.00 6.11±2.57 4.5280.000氫氧化鈣11.20±4.09 8.55±4.06 2.0560.047空白組10.68±3.72 7.78±2.34 2.9490.050

2.3 Beagle犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型根尖周IL-6 mRNA的表達(dá)

0.1%納米銀溶液組、氫氧化鈣組、空白對(duì)照組根尖周組織中IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.009(0.005,0.08)、0.324(0.06,0.794)、0.011(0.004, 0.054)(表3)，不同組間IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 根尖周組織IL-6 mRNA表達(dá)量的比較 (n=10)

3 討 論

盡管根管治療術(shù)是目前治療牙髓病和根尖周病最有效的方法，但由于根管系統(tǒng)的解剖復(fù)雜性，機(jī)械預(yù)備和化學(xué)預(yù)備無法達(dá)到所有側(cè)副根管和細(xì)小彎曲根管等部位，影響了根管治療的成功率。研究表明，細(xì)菌能以生物膜的形式生存于低氧張力和低營養(yǎng)環(huán)境中并附著在根管峽部和牙本質(zhì)小管內(nèi)以及其他結(jié)構(gòu)表面[12]。為提高根管治療的成功率，應(yīng)殺滅這些生物膜細(xì)菌，目前最常用的根管消毒藥物為氫氧化鈣。然而，也有學(xué)者研究認(rèn)為其抑菌深度和抑菌效果較差[3]。因此，尋找安全、高效的根管消毒藥物是牙髓病學(xué)者們提高根管治療成功率的重要途徑。

氫氧化鈣是目前最常用的根管內(nèi)消毒藥物，其具有很強(qiáng)的抗菌活性、能夠滅活殘留在根管壁上的細(xì)菌內(nèi)毒素、通過促進(jìn)堿性磷酸酶活性和礦化組織形成有利于根尖周組織的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了Beagle犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究根管內(nèi)封藥提供了動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)中，氫氧化鈣封藥組的根尖周陰影體積較術(shù)前縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這充分說明氫氧化鈣有促進(jìn)根尖周病變愈合的作用。感染根管經(jīng)過機(jī)械和化學(xué)預(yù)備后需要根管封藥以進(jìn)一步消除殘留細(xì)菌和毒素，而在根管充填前應(yīng)徹底清除這些封藥，否則會(huì)降低根管封閉劑向牙本質(zhì)小管滲透，影響其封閉效果，增加了根尖滲漏的風(fēng)險(xiǎn)。Laky等[4]研究了光子誘導(dǎo)光聲流技術(shù)(photon-induced photo- acoustic streaming，PIPS)去除根管內(nèi)氫氧化鈣的效果，結(jié)果表明PIPS對(duì)根管內(nèi)氫氧化鈣的清除效果非常明顯，較其它方法具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。但是由于PIPS技術(shù)需要專門的激光設(shè)備，因此限制了其臨床應(yīng)用。

為了進(jìn)一步尋找安全、高效的根管消毒封藥，在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討了0.1%納米銀溶液用于犬慢性根尖周炎動(dòng)物模型根管封藥的作用。納米銀具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)等特性，還具有超強(qiáng)的抑菌殺菌能力，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。研究表明，納米銀濃度越高，其抑菌效果越明顯，相對(duì)細(xì)胞毒性就越高[13]。Holla等[14]發(fā)現(xiàn)納米銀溶液對(duì)變形鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)為40 μg/ml；張富強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)濃度在25 g/L以下的納米銀粒子沒有細(xì)胞毒性。董立民等[16]發(fā)現(xiàn)對(duì)糞腸球菌的MIC為37.5～75 μmol/L，而對(duì)鏈球菌MIC為18.75～37.5 μmol/L。張富華等[17]發(fā)現(xiàn)0.1%的納米銀溶液抑菌效果高于2%的次氯酸鈉溶液，Samiei等[18]應(yīng)用納米銀凝膠用于抑制牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌，由于其流動(dòng)性受限制，納米銀凝膠的抑菌效果并不突出；劉奕等[19]發(fā)現(xiàn)載銀納米羥磷灰石抑制糞腸球菌的作用較好。雖然有很多的學(xué)者研究了納米銀的體內(nèi)殘留及累積問題，但目前還沒有學(xué)者對(duì)納米銀制劑載體在根管內(nèi)的可能殘留問題及影響根管充填嚴(yán)密性的研究，所以本實(shí)驗(yàn)采用了0.1%濃度(100 μmol/L)的納米銀溶液，結(jié)果表明，封藥后根尖周破壞體積明顯縮小(P<0.01)，促進(jìn)了根尖周病變的愈合。通過本研究證明，0.1%納米銀溶液進(jìn)行根管消毒封藥，不僅能夠達(dá)到根管內(nèi)消毒的作用，而且由于自身是液體，能夠容易去除，從而避免氫氧化鈣根管封藥后難以清除的缺點(diǎn)。

IL-6和TNF-α是引起根尖周骨質(zhì)破壞的重要炎癥因子，IL-6通常被推薦用來檢測慢性根尖周炎的炎癥程度[20]，而且楊文東等[21]的研究表明IL-6 mRNA的表達(dá)水平與病體積損關(guān)系不大。納米銀制劑的抑菌效果明顯，其生物毒性一直是制約其廣泛使用的關(guān)鍵因素。通過本研究證明0.1%納米銀溶液組根尖周組織中的IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與氫氧化鈣糊劑及空白對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明0.1%納米銀溶液對(duì)根尖周組織的炎癥刺激性不明顯?？傊?.1%納米銀溶液與氫氧化鈣相比，能有效促進(jìn)犬慢性根尖周炎根尖周組織的愈合，且對(duì)根尖周組織無明顯炎癥刺激作用。本實(shí)驗(yàn)的局限性在于僅探討了根管預(yù)備后0.1%納米銀溶液和氫氧化鈣封藥效果的比較，并不能代表整個(gè)根管治療過程。在后期的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該進(jìn)一步探尋納米銀應(yīng)用的最佳濃度、最佳粒徑，使其發(fā)揮最佳抑菌和殺菌效果，為在臨床中應(yīng)用于根管消毒封藥提供理論依據(jù)。