清血八味片對高脂血癥金黃地鼠血脂的影響及其機(jī)制

孫夢佳，杜海濤，蘇麗紅，董梅月，于鵬飛，蔣海強(qiáng)

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.青島優(yōu)撫醫(yī)院，山東 青島 266000；3.內(nèi)蒙古蒙奇藥業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011700；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

高脂血癥 (hyperlipidemia,HLP) 是一種脂質(zhì)代謝異常性疾病,表現(xiàn)為血漿中一種或幾種脂質(zhì)紊亂,包括血漿膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平升高或 (和) 高密度脂蛋白膽固醇水平過低[1]。高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的主要發(fā)病因素。近年來,隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,生活習(xí)慣和飲食習(xí)慣的改變等多種因素的影響,我國的高脂血癥患者數(shù)量急劇增加[2-3]。臨床治療上采用西藥的療效比較顯著,目前常用于臨床降血脂的西藥有:他汀類、貝特類、膽酸螯合劑、煙酸類等[4]。這些降血脂藥物雖然可以有效、快速地降低血脂,但是長期服用降血脂藥物副作用較多，比如腹脹、腹瀉、肌無力、肌肉溶解等不良反應(yīng)[5]。因此,本研究意在從傳統(tǒng)制劑清血八味片中發(fā)現(xiàn)其降血脂作用，尋求一種安全、有效、不良反應(yīng)小的降血脂的方法。

蒙醫(yī)藥是我國醫(yī)藥學(xué)重要的組成一部分，其研究越來越受到大家的關(guān)注。清血八味片(蒙名:琪孫黑木拉-8)是常用的蒙醫(yī)藥復(fù)方制劑,源自《甘露四部》,該處方是由寒水石、紫草、土木香、人工牛黃、梔子、瞿麥、石膏、甘草8味中藥材組成,具有清訌血藥效作用，可用于治療血可熱頭痛，口渴目赤，中暑等疾病[6]。八味藥材配伍得當(dāng),牛黃活血，紫草、梔子、石膏、寒水石等涼血，土木香行氣，瞿麥利水，甘草調(diào)和主要，奏活血涼血、通絡(luò)解毒之功,可暢通心腦血管,排泄代謝廢物、毒素等,從而恢復(fù)血液循環(huán)系統(tǒng)平衡[7]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飼料喂養(yǎng)金黃地鼠制作高血脂動(dòng)物模型，以清血八味片不同劑量進(jìn)行干預(yù)，從而從動(dòng)物模型層面探討該藥的降血脂藥效。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性金黃地鼠72只，體重(110±5)g，購自北京維通利華有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)20160011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(魯)2017-0022,人工光循環(huán)12 h/12 h,溫度為(24±2.0)℃,濕度為55%±5%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程遵循山東中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南,并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑 清血八味片(500 mg/片，內(nèi)蒙古蒙奇藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20170706)；阿托伐他汀鈣片(立普妥，20 mg/片，輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：X07611)；總膽固醇檢測試劑盒(批號(hào)：2018051601)、甘油三酯檢測試劑盒(批號(hào)：2018081001)、高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(批號(hào)：2018072701)、低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(批號(hào)：2018080602)，以上試劑盒均由寧波瑞源生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 卓越310全自動(dòng)生化分析儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；CP225D電子分析天平(德國Sartorius公司)；高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4 高脂模型飼料 參照保健食品輔助降血脂動(dòng)物試驗(yàn)混合型高血脂造模方法[8]， 在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉,適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等。除了粗脂肪外,模型飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣∶磷均達(dá)到維持飼料的國家標(biāo)準(zhǔn)。高脂模型飼料和維持飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(批號(hào)：19043211)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物的分組 金黃地鼠72只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,分為正常組(12只)和高脂模型組(60只)。造模后根據(jù)TC水平將高脂造模組60只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照藥組、清血八味片低劑量組、清血八味片中劑量組、清血八味片高劑量組，每組12只。

2.2 高脂血癥動(dòng)物模型制備 正常對照組飼喂維持飼料，高脂模型組飼喂高脂模型飼料。每日補(bǔ)充飲水及飼料,保持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活環(huán)境干燥、清潔、通風(fēng)。連續(xù)喂養(yǎng)2周,眼眶靜脈取血,分離血清,置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?測定血清中Tch、TG、LDL-C水平。

2.3 動(dòng)物的分組給藥 經(jīng)過查閱相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物文獻(xiàn)[9]，根據(jù)臨床劑量折算，確定金黃地鼠給藥劑量為阿托伐他汀鈣片2.31 mg·(kg·d)-1，清血八味片低劑量為175 mg·(kg·d)-1,中劑量為350 mg·(kg·d)-1，高劑量為525 mg·(kg·d)-1。藥物以0.9%氯化鈉溶液超聲溶解,各組均灌胃給藥。正常組和模型組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液。

2.4 樣本采集及指標(biāo)檢測 造模成功后,進(jìn)行高脂血癥治療實(shí)驗(yàn),同時(shí)分別給藥,同時(shí)給予高脂飼料。給藥2周后于眼眶靜脈取血監(jiān)測Tch、TG、HDL-C、LDL-C水平,判斷模型的保持與否并對藥效學(xué)進(jìn)行推斷；第四周腹腔靜脈采血，3 000 rpm離心15 min，取血清測定血脂的Tch、TG、HDL-C、LDL-C水平，觀測清血八味片干預(yù)的藥效作用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 高脂血癥模型造模結(jié)果 正常組與高脂模型組隨機(jī)選取動(dòng)物，造模2周后眼眶靜脈取血進(jìn)行全自動(dòng)生化分析，檢測結(jié)果如表1，與正常對照組比較,高脂模型組的Tch、TG、LDL-C均顯著升高(P<0.05)，表示高脂血癥造模已成功。

3.2 清血八味片干預(yù)2周后血脂指標(biāo)測定 清血八味片干預(yù)2周后，與正常組相比，模型組Tch、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。與模型組相比，陽性藥組的TG水平下降(P<0.05)；低劑量組的Tch、TG水平均出現(xiàn)下降的趨勢， HDL-C水平升高(P<0.05)；中劑量組的Tch、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高；高劑量組的Tch、TG水平均出現(xiàn)下降的趨勢， HDL-C水平升高(P<0.05)，具體結(jié)果見表1。

3.3 清血八味片干預(yù)4周后血脂指標(biāo)測定 如表2所示，干預(yù)四周后，與正常組相比，模型組Tch、TG、LDL水平升高，HDL-C水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，陽性藥組，TG水平下降，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；低劑量組Tch、TG、LDL-C水平下降，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；中劑量組Tch、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組Tch、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 清血八味片干預(yù)兩周后血脂水平結(jié)果

注：與正常組比較，◇P<0.05；與模型組比較，※P<0.05

表2 清血八味片干預(yù)四周后血脂水平結(jié)果

注：與正常組比較，◇P<0.05；與模型組比較，※P<0.05

3.4 清血八味片對各組大鼠肝臟質(zhì)量及其肝臟指數(shù)的影響 給藥結(jié)束時(shí),與正常組相比，模型組金黃地鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù) (肝重/體質(zhì)量) 顯著升高；與模型組相比，陽性藥組的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)顯著下降；清血八味片中、高劑量組金黃地鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)顯著降低；低劑量組的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)出現(xiàn)下降趨勢，但無顯著性差異，見表3。

表3 各組金黃地鼠肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較

注：與正常組比較，◇P<0.05；與模型組比較，※P<0.05

4 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)綜合以上4周后血脂結(jié)果可以看出清血八味片具有降低高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥金黃地鼠血脂的功效。給藥兩周后，高中低3個(gè)劑量組均出現(xiàn)Tch、TG、HDL-C、LDL-C的調(diào)控作用，給藥4周后，調(diào)控趨勢更為明顯。陽性對照藥側(cè)重調(diào)控TG，而清血八味片對總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均有調(diào)控作用，說明了中藥的整體調(diào)節(jié)作用。清血八味片治療高脂血癥金黃地鼠過程中，陽性藥組死亡1只，低劑量組死亡3只，中劑量組死亡2只，高劑量組死亡2只，根據(jù)原本每組12只的數(shù)據(jù)，說明4周的給藥過程中具有一定的副作用,建議開展長期毒性實(shí)驗(yàn)。

研究高血脂可以選擇的動(dòng)物模型有許多。靈長類動(dòng)物的脂代謝生理病理過程最接近人類，但其代價(jià)過高，來源有限。嚙齒類動(dòng)物大鼠小鼠對膽固醇有先天性耐受力，其造模過程比較長，且內(nèi)源性膽固醇合成量與人類的差異較大，并且膽固醇的血漿清除率明顯高于人類，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人體會(huì)有一定的限制。內(nèi)源性膽固醇人類合成量1～10 mg·kg-1，而大小鼠每天約合成150 mg·kg-1，超過人類的十倍。它們與人類膽固醇合成雖有較大差異，但是Wistar 大鼠對降脂藥的作用更為敏感，適合降脂血脂藥物的發(fā)現(xiàn)。兔子是食草性動(dòng)物，易拒絕動(dòng)物性脂肪飼料?；蛉毕菪詣?dòng)物使用成本更高，操作復(fù)雜且周期長。相對而言，金黃地鼠膽固醇肝外合成比例約為85%，在膽固醇和代謝方面，以及受體與非受體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的比例與人類類似，且該模型對食物中脂質(zhì)以及調(diào)節(jié)血脂功效成分的反應(yīng)更加接近人類，因此血脂研究選用金黃地鼠具有必要性。

清血八味片是以蒙醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)研制而成，方中紫草、梔子和瞿麥為清血主藥,紫草味甘、咸、寒,歸心,肝經(jīng),功能清熱涼血,活血,解毒透疹,在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均有記載[10]。紫草的主要活性成分紫草素及其衍生物具有抑制血小板聚集等作用[11]。梔子中的西紅花苷及其代謝物藏紅花酸明顯具有抑制胰脂酶的活性,進(jìn)而抑制脂肪和膽固醇的吸收,從而發(fā)揮降血脂功效[12]。牛黃成分之一的?；撬峥梢种菩氖壹〖?xì)胞鈣內(nèi)流,減輕細(xì)胞鈣超載,能對抗腎上腺素、地高辛和洋地黃誘發(fā)的心律失常[13]。同時(shí),抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和內(nèi)膜增厚,抗高血壓和抗動(dòng)脈粥樣硬化,降低血脂,抑制血小板凝集與血栓形成,保護(hù)心肌,抗心力衰竭[14]。石膏的主要成分為CaSO4·2H2O,還含有Fe、Cu、Mg、Al、Ti、Sr等多種微量元素,內(nèi)服經(jīng)胃酸作用,一部分變?yōu)榭扇苄遭}鹽,至腸吸收后可增加血鈣離子濃度,進(jìn)一步抑制神經(jīng)應(yīng)激反應(yīng)、減輕血管通透性,故可以發(fā)揮清熱瀉火、除煩止渴等功效[15]。寒水石的主要成分為CaSO4·2H2O,經(jīng)涼制后失去結(jié)晶水，寒水石具有清熱瀉火、除煩止渴的功效,經(jīng)涼制后可治療血熱病并有活血化瘀的作用[16]?，F(xiàn)代藥理研究表明,甘草中含有甘草酸,甘草酸肌內(nèi)注射對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥家兔有明顯的降脂作用,可使血漿Tch和TG含量明顯下降,減輕動(dòng)脈粥樣硬化的程度[7]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)清血八味片明顯的降血脂作用，尤其是降低Tch、TG、LDL-C，升高HDL-C，應(yīng)是清血八味片治療訌血癥機(jī)理的一部分。