微生物降解土壤中多環(huán)芳烴的研究進(jìn)展

呂鑫 孫延瑜 閔軍 胡曉珂 馬蓮菊

摘要??多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）在土壤中分布廣泛且存留時(shí)間長。利用理化手段去除PAHs不僅價(jià)格昂貴，還會對土壤、沉積物以及地下水層等自然環(huán)境造成二次污染。生物修復(fù)主要是利用微生物代謝多樣性降解有害污染物，被認(rèn)為是最具有前景的修復(fù)技術(shù)。目前已分離鑒定出多種微生物具有降解PAHs的能力。為了更好地應(yīng)用微生物修復(fù)土壤及環(huán)境中的PAHs污染，需要更加深入了解降解過程中微生物代謝途徑的生理生化以及分子遺傳機(jī)制。綜述了土壤中多環(huán)芳烴的微生物降解，在前人研究的基礎(chǔ)上，闡述了不同降解途徑對不同分子量多環(huán)芳烴的生物代謝轉(zhuǎn)化機(jī)理，為提高土壤中降解菌的生物修復(fù)能力提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞??多環(huán)芳烴;微生物降解;土壤

中圖分類號??X 172文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

文章編號??0517-6611（2020）04-0001-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Review on the Microbial Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Soil

L Xin1，2，3，SUN Yan-yu2，3，MIN Jun2，3 et al??（1.Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034;2.Key Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Utilization，Yantai Institute of Coastal Zone Research，Chinese Academy of Sciences，Yantai，Shandong 264003; 3.Qing-dao Marine Science and Technology Pilot National Laboratory，Marine Biology and Biotechnology Functional Laboratory，Qingdao，Shandong 266237）

Abstract??Polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） are widely distributed in soil and remain for a long time.The use of physical and chemical means to remove PAHs is not only expensive，but also causes secondary pollution to the natural environment such as soil，sediment and groundwater.Bioremediation is mainly the use of microbial metabolic diversity to degrade harmful pollutants，which is considered to be the most promising repair technology.

At present，many microorganisms have been isolated and identified to have the ability to degrade PAHs.In order to better apply microbial remediation of soil and environmental PAHs pollution，it is necessary to further understand the physiological-biochemical and molecular genetic mechanisms of microbial metabolic pathways during degradation.This paper reviewed the microbial degradation of PAHs in soil，elaborated the transformation of mechanisms under different degradation of biological and metabolic pathways for different molecular weight PAHs，which provided a theoretical basis for enhancing the bioremediation ability of degrading bacteria in soil.

Key words??Polycyclic aromatic hydrocarbons;Microbial degradation;Soil

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指具有2個(gè)以上苯環(huán)的一類有機(jī)化合物，PAHs有著分布范圍廣、污染種類多的特點(diǎn)。隨著工業(yè)化發(fā)展進(jìn)程不斷加快，石油污染和泄漏在開采、加工、運(yùn)輸過程中頻繁發(fā)生，并在土壤中長期積累且很難被消除，對生態(tài)環(huán)境以及人類健康造成嚴(yán)重威脅。我國的農(nóng)田土壤污染也十分嚴(yán)重，周潔等[1]對北京市郊農(nóng)田土壤進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，16種PAHs全部檢出的檢出率為74.4%，結(jié)果表明京郊農(nóng)田土壤已經(jīng)受到PAHs污染，具有潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前，生物修復(fù)是治理PAHs污染的重要方法之一，微生物可利用其作為碳源進(jìn)行降解，將其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的無機(jī)物質(zhì)[2]。

國內(nèi)外研究者對優(yōu)化生物修復(fù)效果做出了諸多探索，王悅明等[3]采用微生物制劑對不同類型石油污染的土壤進(jìn)行了原位修復(fù)小試和中試，并在修復(fù)后的污染地塊種植小麥，結(jié)果表明混合菌群對農(nóng)田土壤中的石油具有良好的降解能力。李曉樓等[4]綜合分析了土著微生物修復(fù)石油污染的影響因素，表明按6∶1的比例添加氮源和磷源處理效果最好。Lin等[5]利用棉花纖維對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)果顯示固定化對原油降解具有促進(jìn)作用。Mrozik等[6]綜述了在生物修復(fù)過程中常見的固定化載體材料。然而在修復(fù)石油污染土壤過程中，PAHs的降解一直以來都是一大難題。筆者擬對土壤中PAHs的微生物降解進(jìn)行綜述，以期為微生物修復(fù)PAHs污染的土壤提供理論基礎(chǔ)。

1??PAHs的種類及特性

石油中最容易被微生物降解的是飽和烴類化合物，其次是低分子量的芳香烴類化合物，高分子量的芳香烴類化合物、瀝青質(zhì)和膠質(zhì)不僅對微生物有一定的毒性，而且最難被降解[7]。Wang等[8]將海洋沉積物與原油共同孵育，利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）和克隆文庫的方法對比菌群群落變化，結(jié)果顯示加入石油前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化。Douglas等[9]詳細(xì)描述了在有氧條件下石油各組分的降解過程，試驗(yàn)表明揮發(fā)性烴如苯、甲苯等在2 d內(nèi)完全降解，半揮發(fā)性烴如萘、艸屈等PAHs在14 d后可降解完全，石油中的重質(zhì)組分如瀝青質(zhì)、膠質(zhì)等在140 d后依然沒有完全降解。美國國家環(huán)境保護(hù)局已于1979年將16種未帶分支的PAHs列入優(yōu)先控制的有毒有機(jī)污染物名單[10]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示[11]，其基本理化信息如表1所示，生物可降解性如表2所示[11]。

微生物降解可根據(jù)氧氣參與程度分為厭氧降解、低氧降解、好氧降解。厭氧降解的速率較慢，但產(chǎn)生的中間產(chǎn)物較好氧產(chǎn)物相比更加簡單、毒性更小，并且分解更完全[12-14]。

目前，低氧降解PAHs的研究相對較少，但有研究表明在低氧條件下，PAHs的降解速率比在完全厭氧條件下高[15-16]。PAHs的好氧降解研究相對較多，好氧細(xì)菌降解PAHs主要是通過產(chǎn)生雙加氧酶作用于苯環(huán)，在芳環(huán)上加入2個(gè)氧原子，然后再經(jīng)過氧化形成順式二氫二羥基結(jié)構(gòu)，隨后繼續(xù)脫氫形成單純二羥基化的中間體，而后被進(jìn)一步代謝為鄰苯二甲酸等其他中間產(chǎn)物，最終可降解為H2O和CO2[17]，PAHs在好氧條件下的優(yōu)勢降解菌及功能基因等見表3。

2??PAHs的降解

2.1??低相對分子質(zhì)量PAHs??目前，對于低相對分子質(zhì)量PAHs的研究已較為透徹，其分子結(jié)構(gòu)簡單，水溶性高，能夠被許多微生物礦化降解。

2.1.1??萘的降解。萘具有2個(gè)苯環(huán)，結(jié)構(gòu)簡單，有較低的水溶性和較高的固液分配系數(shù)，這使得它能夠抵抗微生物的利用且促進(jìn)其在土壤中濃度的增加[18]。

研究表明多種細(xì)菌和真菌能夠通過不同的機(jī)制降解萘，能利用 PAHs為碳源和能源的微生物普遍存在于已污染的水體、土壤、底泥等中，如假單胞菌 （Pseudomonas sp.）、桿菌（Bacillus sp.）、分枝桿菌屬（Mycobacterium sp.）等[19]。這些菌中均有萘降解基因如nahAc、nahF、nahV、 nahU、nahH、catA和nahY等。

萘的降解首先通過萘雙加氧酶攻擊芳環(huán)形成順式二氫萘，隨后通過脫氫酶的作用形成1，2-二羥基萘，再經(jīng)過一系列催化反應(yīng)形成水楊酸。水楊酸會脫羧形成鄰苯二酚或羥基化形成龍膽酸，進(jìn)而開環(huán)降解[20]。

2.1.2??芴的降解。

芴及其衍生物是一類重要的具有剛性平面聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的化合物，具有較大的共軛體系，這種特殊的剛性稠環(huán)結(jié)構(gòu)使芴類化合物在光電材料、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[21]，目前已經(jīng)篩選出許多高效降解菌并推測其可能的代謝途徑[22-25]。能夠降解芴的菌屬主要包括地桿菌屬（Terrabacter sp.）、非脫羧勒克菌屬（Leclercia adecarboxylata sp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）、分枝桿菌屬。

芴的生物降解主要有2種途徑：一是有角度雙加氧途徑;二是側(cè)面雙加氧途徑。雙加氧酶被認(rèn)為是芴降解的關(guān)鍵酶，芴在雙加氧酶的作用下可以在不同位點(diǎn)加羥基，第一種途徑在1、2位點(diǎn)的雙加氧反應(yīng)下最終形成苯并二氫吡喃-3-酮;第二種途徑通過在芴的3、4號位加氧反應(yīng)最終以水楊酸鹽形式代謝;第三種途徑通過在C-9位上的單加氧反應(yīng)最終以鄰苯二甲酸鹽的形式代謝[26]。

2.1.3??菲的降解。菲是一種三環(huán)芳烴，具有一個(gè)“灣”區(qū)（bayregion）和一個(gè)“K”（kregion）區(qū)，這2種結(jié)構(gòu)與PAHs的致癌性有著非常密切的關(guān)系，憑借其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，菲已經(jīng)成為研究PAHs的模式化合物[27-31]。菲具有生物累積性、致癌、致畸等特性，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害[32-33]。菲可以被多種微生物降解和吸附，從石油、煤炭工廠附近污染的土壤、沉積物或水環(huán)境中均易分離出菲降解菌。

目前發(fā)現(xiàn)的能夠降解菲的菌屬有很多，主要包括假單胞菌、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）、葡萄球菌屬等[19]。

菲的降解途徑主要為2種：一是水楊酸途徑;二是鄰苯二甲酸代謝途徑。Lin等[34]篩選出的假單胞菌屬嗜鹽菌Pseudomonas sp.BZ-3，對菲具有高效降解能力，并且得知該菌通過水楊酸代謝途徑降解菲。首先，菲在雙加氧酶的作用下3、4位碳被羥基化生成順-3，4-二氫二羥基菲，隨后在一系列酶促反應(yīng)下轉(zhuǎn)化為1-羥基-2-萘甲酸[35]。之后的降解過程有2種，對于既能夠以菲為唯一碳源，又能夠以萘為唯一碳源的菌株，通過水楊酸途徑進(jìn)行降解，即在羥化酶作用下轉(zhuǎn)化為1，2-二羥萘，再通過與萘類似的途徑完成降解。不能以萘為唯一碳源的菲降解菌一般通過鄰苯二甲酸途徑進(jìn)行降解，即在一系列酶促反應(yīng)下轉(zhuǎn)化為原兒茶酸，隨后氧化開環(huán)進(jìn)入到TCA循環(huán)降解[19]。

2.1.4??蒽的降解。

蒽是PAHs中一種具有代表性的有毒污染物，結(jié)構(gòu)中有3個(gè)苯環(huán)，同時(shí)也是檢測PAHs污染的指示物[36]。目前對于蒽降解的研究，主要集中在篩選蒽高效降解菌[37-38]。另外，Hu等[39]利用固定化漆酶對蒽進(jìn)行降解，也得到了較好的試驗(yàn)結(jié)果。

能夠降解蒽的菌屬主要有假單胞菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）、鞘氨醇單胞菌屬、氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）等。

蒽首先在雙加氧酶的作用下轉(zhuǎn)化為順式二氫二醇，然后脫氫生成二羥基蒽，接著環(huán)氧化裂解，最后形成能夠進(jìn)入TCA循環(huán)的小分子物質(zhì)[19]。

2.1.5??苊烯的降解。

苊烯的降解菌屬包括根瘤菌屬（Rhizobium sp.）、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）等。Poonthrigpun等[40]分離到一株能以苊烯為唯一碳源和能源的菌株，首次推測出苊烯的降解途徑。Nayak等[41]也分離到苊烯的降解菌Stenotrophomonas sp.RMSK，并完善了苊烯的代謝通路。首先苊烯的1、2位碳被羥基化，生成1，2-二醇苊，隨后脫氫生成1，2-二羥基苊烯。進(jìn)一步脫氫生成二氫苊醌，二氫苊醌發(fā)生氧化生成1，8-萘二羧酸，隨后發(fā)生脫羧反應(yīng)生成α-萘甲酸。α-萘甲酸脫羧以及在羥基化酶的作用連續(xù)羥基化下轉(zhuǎn)化為1，2-二羥基萘，隨后經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為水楊酸，水楊酸在經(jīng)過脫羧和羥基化反應(yīng)后生成最終的芳香族代謝物鄰苯二酚，鄰苯二酚即可通過1，2-鄰苯二酚雙加氧酶的催化進(jìn)入TCA循環(huán)。

2.1.6??苊的降解。

苊的降解菌屬主要有產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、鞘氨醇單胞菌屬、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）等。Ghosal等[42]分離到一株能夠以苊為唯一碳源和能源的不動桿菌屬菌株Acinetobacter sp.strain AGAT-W，并表明苊降解過程中的關(guān)鍵酶是1-羥基苊脫氫酶、水楊醛脫氫酶以及1，2-鄰苯二酚雙加氧酶。首先在苊的1號碳位置上發(fā)生單加氧化作用轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基苊，隨后在脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為1-苊酮。1-苊酮發(fā)生羥基化反應(yīng)生成1-羥基-2酮苊，隨后在2號碳位置發(fā)生脫氫作用生成二氫苊醌。二氫苊醌被認(rèn)為是苊與苊烯降解代謝中重要的中間代謝產(chǎn)物。隨后二氫苊醌就可轉(zhuǎn)化為1，8-萘二羧酸、α-萘甲酸、水楊酸，水楊酸轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚便可以進(jìn)入TCA循環(huán)。

2.2??高相對分子質(zhì)量PAHs

4環(huán)以上的高相對分子質(zhì)量PAH分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、電子云密度高、水溶性差，通常需要采用共代謝（Co-metabolism）的方式進(jìn)行微生物降解。共代謝是指微生物利用一種容易降解的有機(jī)物質(zhì)作為支持其自身生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)降解另一種物質(zhì)，但微生物不能從后一種物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化中獲得能量、碳源或其他任何營養(yǎng)物質(zhì)[19]。

對于高分子質(zhì)量PAHs的研究已取得諸多成果。唐玉斌等[43]從焦化污泥中篩選出一株可在以艸屈

為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長的高效降解菌 Achromobacter xylosoxidans SQ-1，又考察了艸屈的初始濃度、加菌量、pH對SQ-1菌株降解效果的影響，確定了最佳降解條件。李慧等[44]分離純化了絲狀真菌宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii），并對苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、茚并[1，2，3-c，d]芘的降解效果進(jìn)行了探究，結(jié)果表明該菌對混合體系中5種PAHs的降解率與單一體系的PAHs降解率有一定差異。陳海英等[45]篩選馴化的混合菌群具有很強(qiáng)的PAHs降解能力，縮短了PAHs生物降解的半衰期，且PAHs起始降解速率較快，之后趨于平緩。Wang等[46]在長期受到PAHs污染的土壤和未受到污染的土壤中分別加入11種混合PAHs并采用雙液相生物反應(yīng)器（TLPB），結(jié)果表明，在2種土壤中采用雙液相生物反應(yīng)器都可有效縮短PAHs的半衰期。但目前對于苯并[b]熒蒽、苯并[g，h，i]芘、苯并[a，h]蒽的研究主要集中在其致癌性上，關(guān)于微生物降解機(jī)制的研究較少。

2.2.1??苯并[a]芘的降解。

苯并[a]芘是一種具有5環(huán)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)致癌性PAHs污染物，其分子結(jié)構(gòu)內(nèi)苯環(huán)高度密集，辛醇-水分配系數(shù)高，較難被微生物降解[47]。能夠降解苯并[a]芘的菌屬主要包括拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia derx sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）、假單胞菌屬、土桿菌屬（Agrobacterium sp.）等。Hu等[48-49]利用固定化漆酶降解苯并[a]芘得到其代謝中間物包括1，6-苯并[a]芘醌、3，6-苯并[a]芘醌、6，12-苯并[a]芘醌。

在細(xì)菌降解苯并[a]芘時(shí)，首先是苯并[a]芘的2個(gè)碳原子通過雙加氧酶被羥基化產(chǎn)生二氧化合物中間體，隨后被氧化為順式-2-二氫二醇苯并[a]芘和二羥基化合物，接著再被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞蛋白質(zhì)，或者轉(zhuǎn)化為CO2和H2O [19]。

2.2.2??苯并[a]蒽的降解。

目前發(fā)現(xiàn)能夠降解苯并[a]蒽的菌屬有限，主要包括鞘氨醇單胞菌屬以及分枝桿菌屬。Kunihiro等[50]分離出一株能夠降解苯并[a]蒽的菌株Sphingobium sp.strain KK22，該菌株能夠在48 h內(nèi)降解50%濃度為2.5 mg/L的苯并[a]蒽。

從代謝的起始位點(diǎn)來比較，苯并[a]蒽的降解大致分為4種途徑。在這些途徑中，苯并[a]蒽的轉(zhuǎn)化分別起始于1，2-、3，4-、8，9-、10，11-位，經(jīng)過雙加氧作用分別形成順式-1，2-二氫二醇苯并[a]蒽，順式-3，4-二氫二醇苯并[a]蒽，順式-8，9-二氫二醇苯并[a]蒽，順式-10，11-二氫二醇苯并[a]蒽。這些二氫二醇式的苯并[a]蒽在一系列酶促反應(yīng)作用下最終形成水楊酸，完成對苯并[a]蒽的降解。

2.2.3??苯并[k]熒蒽的降解。

目前已知能夠降解苯并[k]熒蒽的菌屬主要包括假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、側(cè)耳菌屬（Pleurotus sp.）等。Maeda等[51]分離到高分子量PAHs降解菌Sphingobium sp.strain KK22，該菌可降解苯并[k]熒蒽、熒蒽以及苊烯這3種PAHs。

首先，苯并[k]熒蒽的轉(zhuǎn)化在8，9-位經(jīng)過雙加氧作用在鄰位開環(huán)形成順式-8，9-二氫二醇苯并[k]熒蒽，隨后在一系列酶促反應(yīng)作用下形成α-萘甲酸，最終完成對苯并[k]熒蒽的降解。

3??展望

利用微生物修復(fù)石油污染的土壤是目前最具有應(yīng)用前景的手段，而現(xiàn)有研究多集中于降解菌種的分離、降解能力的測定、提高某一菌種降解能力的條件以及對單一污染物的降解機(jī)制和代謝途徑。但菌種的篩選具有偶然性，且單一菌種的降解譜窄，往往只對某種特定的石油污染物具有較好的降解特性。此外，對微生物降解石油污染物的研究大多停留在其分子機(jī)制，局限于實(shí)驗(yàn)室模擬室外土壤環(huán)境，應(yīng)用于室外土壤原位修復(fù)的試驗(yàn)和研究不夠深入。未來值得深入研究的方向包括：①可利用具有高效降解能力的細(xì)菌、真菌、放線菌甚至藻類構(gòu)建高效降解菌群，高效降解PAHs污染土壤中的難降解組分;②研究高效降解菌的降解基因以及特殊酶類，利用基因工程手段取代傳統(tǒng)篩菌、分離過程;③深入研究高環(huán)PAHs以及瀝青質(zhì)、膠質(zhì)的降解機(jī)制，細(xì)化代謝途徑，實(shí)現(xiàn)對其降解過程的有效調(diào)控;④將構(gòu)建好的高效降解菌群投入到遭受PAHs污染的土壤中，探究原位修復(fù)的最適降解條件，以期修復(fù)我國被污染的土壤，改善耕作土壤條件。

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