巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白單克隆抗體的制備及其功能鑒定

羅伏兵 ， 劉曉冬 ， 梁 琳 ， 劉賢勇 ， 徐發(fā)榮 ， 沈光年 ， 馬志軍 ， 索 勛 ， 湯新明

(1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 大興 102629 ； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100193 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

雞球蟲病是艾美耳球蟲感染引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的寄生蟲病，全球每年因球蟲病造成的損失高達(dá)30億美元[1]。以活卵囊為組分的球蟲病疫苗已有數(shù)十年的應(yīng)用歷史，但存在影響雞群生產(chǎn)性能的風(fēng)險(xiǎn)。開發(fā)安全高效的基因工程球蟲病疫苗是學(xué)界研究的熱點(diǎn)。頂膜抗原(Apical membrane antigen,AMA)是頂復(fù)門寄生蟲微線體分泌的I型跨膜蛋白，由胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)組成。AMA1蛋白在頂復(fù)門原蟲中高度保守，且在子孢子階段表達(dá)水平高[2]，可能參與蟲體入侵宿主細(xì)胞。巨型艾美耳球蟲AMA1(EmAMA1)被認(rèn)為是免疫原性較好的保護(hù)性抗原，具備開發(fā)成為亞單位疫苗的潛能[3]。因此，深入解析EmAMA1的生物學(xué)和免疫學(xué)功能具有重要意義。單克隆抗體具有高特異性、均一性以及方便生產(chǎn)的特點(diǎn)，是病原學(xué)或血清學(xué)檢測技術(shù)、感染與免疫機(jī)制等研究的主要工具之一。本試驗(yàn)旨在構(gòu)建一/多株抗EmAMA1的單克隆抗體，為EmAMA1基因功能和應(yīng)用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 巨型艾美耳球蟲北京株(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院保存)；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG；SBA Clonotyping System-HRP；BALB/c雌性小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 動物免疫 利用PCR從pSDEP2AAMA1S[4]擴(kuò)增EmAMA1序列后，連接至pEt28a載體，轉(zhuǎn)化至DE3菌株進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。獲得大腸桿菌重組表達(dá)的EmAMA1蛋白，純化后，按每只100 μg(加弗氏完全佐劑)頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫4只BALB/c雌性小鼠；間隔2周后，以相同操作進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量為每只小鼠30 μg蛋白(加弗氏不完全佐劑)，加強(qiáng)免疫3次。于最后1次免疫后第10天，眼眶取血，分離血清。用間接ELISA方法檢測小鼠血清中EmAMA1的抗體效價(jià)。

1.3 抗體檢測 以純化的EmAMA1(0.1 μg/孔)包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜；每孔加200 μL脫脂乳封閉液，37 ℃封閉2 h；每孔加入小鼠血清(不同稀釋度)或細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶20 000倍稀釋)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；加入TMB底物溶液，100 μL/孔，避光顯色5 min左右；每孔加入2 mol/L H2SO4，100 μL /孔，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定雙波長(OD450 nm，OD630 nm)，記錄保存數(shù)據(jù)。

1.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立 依據(jù)單克隆抗體的制備步驟進(jìn)行。簡言之，抗體滴度符合要求的小鼠(4號小鼠)，腹腔注射50 μg蛋白，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后3 d取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按比例混合，按照PEG法進(jìn)行細(xì)胞融合。融合完的細(xì)胞均勻倒入30個(gè)半固體培養(yǎng)基(含HAT)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行篩選培養(yǎng)。每個(gè)培養(yǎng)基分別挑93個(gè)克隆培養(yǎng)在鋪滿胸腺細(xì)胞的96孔板中，3 d后，按1.3所述方法篩檢分泌特異性抗體的陽性孔，得到陽性雜交瘤細(xì)胞株；用“AMA1” “His標(biāo)簽”包板，做第2次篩選；將2次篩選出來的陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，得到IgG類型陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.5 單克隆抗體的純化與鑒定 選擇其中的3株陽性雜交瘤細(xì)胞按體內(nèi)腹水法進(jìn)行大量制備，送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，SDS-PAGE以及ELISA檢測抗體純度及親和常數(shù)，分裝后凍存于-80 ℃，備用。

1.6 單克隆抗體的初步應(yīng)用

1.6.1 單克隆抗體與全蟲抗原的反應(yīng)性檢測 用巨型艾美耳球蟲全蟲抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉后，取稀釋(1∶5 000)的腹水作為一抗進(jìn)行Western Blot檢測，檢測抗體與蟲體AMA1蛋白的特異反應(yīng)性。

1.6.2 單克隆抗體檢測EmAMA1在巨型艾美耳球蟲子孢子的表達(dá)分布 將純化的巨型艾美耳球蟲提取子孢子，取稀釋(1∶2 000)的腹水作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，分析單克隆抗體與蟲體天然抗原的結(jié)合特性與檢測EmAMA1在子孢子階段的表達(dá)與分布。

2 結(jié)果

2.1 獲得分泌抗EmAMA1抗體的雜交瘤細(xì)胞株 小鼠經(jīng)重組EmAMA1蛋白免疫后，產(chǎn)生了針對EmAMA1的特異性抗體(見中插彩版圖1)，選取4號小鼠再次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。取免疫后小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)第1次陽性篩選，獲得47株陽性雜交瘤細(xì)胞株；經(jīng)第2次陽性篩選，得到19株陽性雜交瘤細(xì)胞株。將篩選出來的19株陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，得到16株IgG類型陽性雜交瘤細(xì)胞株。

2.2 單克隆抗體與巨型艾美耳球蟲可溶性抗原特異性反應(yīng) 巨型艾美耳球蟲蟲體抗原經(jīng)SDS-PAGE分離后，以獲得的16株單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。結(jié)果顯示，編號為21與34的單克隆抗體與全蟲抗原反應(yīng)后，出現(xiàn)清晰的目的條帶(約60 kDa)，說明這2株單克隆抗體均能夠識別巨型艾美耳球蟲中特異性的EmAMA1組分(圖2)。

圖2 利用免疫印跡試驗(yàn)篩選與巨型艾美耳球蟲可溶性蛋白反應(yīng)的抗EmAMA1單克隆抗體Fig.2 Selection of monoclonal antibodies against EmAMA1 that reacted with native E. maxima soluble antigens by Western Blot

2.3 EmAMA1在巨型艾美耳球蟲子孢子的表達(dá)分布 為了驗(yàn)證獲得的單克隆抗體能否識別巨型艾美耳球蟲EmAMA1抗原，進(jìn)行了間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果顯示，篩選獲得的16株單克隆抗體，只有編號為34和45的單克隆抗體能夠識別巨型艾美耳球蟲子孢子的AMA1，在頂質(zhì)體和胞漿中檢測到特異性的熒光信號(見中插彩版圖3)。結(jié)果表明，編號為34和45的單克隆抗體與EmAMA1具有良好反應(yīng)性，為研究EmAMA1蛋白的表達(dá)分布及免疫學(xué)特性提供了科學(xué)依據(jù)。

3 討論

本文篩選獲得了16株抗巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白的單克隆抗體，其中2株(編號為21和34)能夠與巨型艾美耳球蟲可溶性抗原發(fā)生特異性反應(yīng)；2株(編號為34和45)能夠用于檢測EmAMA1在子孢子階段的表達(dá)與分布。初步證實(shí)編號為34的單克隆抗體可用于后續(xù)EmAMA1基因功能和免疫學(xué)的研究。

頂復(fù)門原蟲種類繁多，包括瘧原蟲、弓形蟲、巴貝斯蟲、艾美耳球蟲等。與瘧原蟲和弓形蟲相比，艾美耳球蟲基因功能的研究相對滯后，其原因在于一是艾美耳球蟲尚不能進(jìn)行有效的體外培養(yǎng)，導(dǎo)致反向遺傳操作等技術(shù)平臺效率極低[5]；二是針對艾美耳球蟲研究的一些工具或試劑，比如單克隆抗體等相對缺乏。已報(bào)道的研究中，艾美耳球蟲單克隆抗體主要集中于柔嫩艾美耳球蟲的微線體蛋白，其他細(xì)胞器或蟲種的單克隆抗體極少[5-7]。巨型艾美耳球蟲是7種雞球蟲中免疫原性強(qiáng)的蟲種，經(jīng)口免疫5個(gè)孢子化的卵囊即可產(chǎn)生免疫力[2]。研究表明，巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白為其保護(hù)性抗原之一，基于EmAMA1的DNA或重組蛋白亞單位疫苗能夠?yàn)殡u群提供部分抵抗巨型艾美耳球蟲感染的免疫保護(hù)力[3,5]。以柔嫩艾美耳球蟲為疫苗載體表達(dá)EmAMA1的重組球蟲同樣能夠提供一定的免疫保護(hù)力[4]。但巨型艾美耳球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答及保護(hù)性免疫的分子機(jī)理仍不清楚。本文制備了針對EmAMA1的單克隆抗體，為研究巨型艾美耳球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本文篩選獲得了1株抗巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白的單克隆抗體，可用于后續(xù)EmAMA1基因功能和免疫學(xué)的研究。