東莨菪內(nèi)酯在大鼠肝微粒體孵育體系中的代謝產(chǎn)物分析及其含藥血清對大鼠肝星狀細(xì)胞的影響

楊增艷，張 穎，李 嘉，陳少鋒，黃 鑫，靳洪濤

(1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201； 2.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，南寧 530022；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

黃根又名南山花、狗骨木，來源于茜草科植物三角瓣花(prismatomeris connata r.Z.Ruan)的根。黃根具有利濕退黃，強(qiáng)筋壯骨，涼血止血，祛瘀生新的功效。在廣西壯族民間常用于風(fēng)濕跌打、肝炎、矽肺等疾病的治療。資料顯示，黃根含有甲基異茜草素、β—各甾醇及蒽類、有機(jī)鋁化合物、柚木醌、虎刺醛、萜類等成份。黃根提取物有抗肝纖維化、抗肺纖維化、抗菌消炎、祛瘀平喘、保肝等作用[1]，課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)黃根的乙酸乙酯部位有抗肝纖維化作用[2]，并從該部位中首次分離得到了東莨菪內(nèi)酯化合物[3]。

肝纖維化的形成和發(fā)展過程與肝中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞等密切相關(guān)，而肝星狀細(xì)胞(HSC)作為肝的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，它的激活被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[4]。HSC可被多種致病因子激活，轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，并能產(chǎn)生肝絕大部分的細(xì)胞外基質(zhì)。因此，抑制HSC活性和增殖，誘導(dǎo)HSC凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的主要策略[5]。課題組進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，東莨菪內(nèi)酯能保護(hù)肝纖維化大鼠肝，正向調(diào)控與肝纖維相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，降低肝細(xì)胞外基質(zhì)的水平，改善大鼠肝纖維化病變程度，具有抗肝纖維化作用[6]。但體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示，東莨菪內(nèi)酯對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用很弱，誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)發(fā)生凋亡的比例也比較低[7]。

大鼠肝微粒體孵育體系是采用大鼠肝微粒體進(jìn)行藥物體外謝研究的一種模型，近年來利用大鼠肝微粒體孵育體系的研究也非常廣泛。為探究東莨菪內(nèi)酯體內(nèi)、體外抗肝纖維化作用存在差異的原因，課題組前期對肝纖維化大鼠血漿中東莨菪內(nèi)酯的代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定，但未能檢測出相關(guān)任何代謝成分。為進(jìn)一步分析東莨菪內(nèi)酯抗肝纖維化的作用機(jī)制與其代謝過程，我們提出以下研究思路：借助肝微粒體孵育體系摸擬體內(nèi)環(huán)境，了解東莨菪內(nèi)酯的代謝產(chǎn)物；以含藥血清為研究對象，了解東莨菪內(nèi)酯在體內(nèi)代謝后對HSC的作用，以明確東莨菪內(nèi)酯可能的代謝產(chǎn)物和體內(nèi)外對大鼠肝星狀細(xì)胞作用差異的原因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠，SPF級，體重180～200 g(誤差不大于10%)，60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供 [SCXK(京)2012-0001]。動物實(shí)驗(yàn)是在北京市藥品檢驗(yàn)所進(jìn)行[SYXK(京)2015-0033]。

1.1.2 細(xì)胞

受試細(xì)胞為北京市藥品檢驗(yàn)所提供的肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，其表型為活化的HSC。以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液單層傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

黃根(采自廣西壯族自治區(qū)防城市)；東莨菪內(nèi)酯對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度大于98%)；秋水仙堿(西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號170305)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；甲酸 (分析純，南京化學(xué)試劑一廠)；FITC-labeled Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；MTT(sigma公司)；Trypsin(Gibco公司)。

CDX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FlexStation 3微孔板檢測系統(tǒng)(美國Molecular Devices公司)、；CJ820標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(中國蘇潔凈化設(shè)備公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

黃根藥材藥材經(jīng)廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院蘭日春副主任藥師鑒定為茜草科植物南山花(prismatomeris connata r.Z.Ruan)的干燥根。黃根經(jīng)95%乙醇回流提取，濃縮提取液后得到黃根醇提浸膏，加水充分混溶后。依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，減壓濃縮得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠色譜柱分離，以石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，收集各流分。Fr.2-3再經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離純化得化合物東莨菪內(nèi)酯[3]。取東莨菪內(nèi)酯21.5 mg，純化水溶解后定容至體積95 mL，超聲30 min，再稀釋100倍為東莨菪內(nèi)酯高劑量組用量(2.27×10-2mg/kg)，東莨菪內(nèi)酯低劑量濃度是高劑量的1/3。

秋水仙堿片0.1 mg，研磨成粉，純水溶解，定溶至100 mL。

1.3.2 大鼠肝微粒體孵育體系及樣品處理

1.3.3 給藥血清的制備

60只大鼠隨機(jī)平均分為4組分別為東莨菪內(nèi)酯高劑量組、東莨菪內(nèi)酯低劑量組、正常對照組和秋水仙堿組。除正常對照組外，其余三組均采用四氯化碳復(fù)合因素法造模，造模第四周后開始灌胃給藥，其中東莨菪內(nèi)酯高、低給藥組每天分別灌胃給予東莨菪內(nèi)酯2.27×10-5g/kg、7.56×10-6g/kg，正常對照組以等劑量生理鹽水灌胃，秋水仙堿對照組按0.1 mg/kg體重給予秋水仙堿混懸液，每天1次，連續(xù)2周[6]。給藥的同時繼續(xù)造模，直至第6周給藥結(jié)束。給藥結(jié)束后，腹腔注射4%戊巴比妥鈉，腹總動脈取血，并按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行制備含藥血清[8]。

1.3.4 Annexin V-APC單染法檢測大鼠HSC凋亡

大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，接種6孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞密度為4×104cell/mL，分別加入東莨菪內(nèi)酯高、低劑量組、空白對照組和秋水仙堿組的含藥血清，完全培養(yǎng)基共同孵育48 h后，經(jīng)胰酶消化后收集受試細(xì)胞，參照凋亡檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。

1.3.5 MTT法檢測HSC-T6細(xì)胞的增殖和抑制

大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，接種96孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞密度為4×104cell/mL，分別加入空白對照組、秋水仙堿組、東莨菪內(nèi)酯高劑量組和低劑量組的含藥血清，設(shè)置本底孔。處理48 h后，每個復(fù)孔分別加10 μL MTT(5 mg/mL)，充分混合后繼續(xù)孵育4 h，棄去各孔中的上清液，再加入100 μL DMSO，平面震蕩混勻10 min，待藍(lán)紫色甲瓚沉淀完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各孔的OD值。細(xì)胞增殖抑制率(IR)按下面公式計(jì)算：IR(%)=(1- ODtreated group/平均ODcontrol group)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.6 液相條件

Thermo Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀 (包括二元溶劑輸送泵，柱溫箱，自動進(jìn)樣器)；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱 (100×2.1 mm內(nèi)徑, 1.8 μm)；柱溫 40℃；流動相為水(含0.1%甲酸)與乙腈(含0.1%甲酸)梯度洗脫：0～1 min，1%～1%乙腈；1～2 min，1%～20%乙腈；2～3 min，20%～35%乙腈；3～4 min，35%～90%乙腈；4～5 min，90%～90%乙腈；5～6 min，90%～1%乙腈。流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.7 質(zhì)譜條件

Q-Orbitrap質(zhì)譜儀(Thermofeisher, Q-Exactive)；ESI 離子源；負(fù)離子檢測模式；離子源參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓 (spray voltage) 2.5 kV；噴霧溫度 (vaporizer temperature), 200℃；鞘氣流速(sheath gas), 40 unit；輔助氣流速 (aux gas), 10 unit；毛細(xì)管溫度 (capillary temperature) 250℃；碰撞氣(collision gas, argon) 1.5 mTorr；質(zhì)譜掃描模式dd-MS2；碰撞能量為25、35和40 eV；所有操作以及數(shù)據(jù)處理由Xcalibur (version 2.2)軟件控制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件，P< 0.05表示組間差異顯著。柱形圖均使用GraphPad Prism 8繪制。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝微粒體孵育體系中東莨菪內(nèi)酯代謝物的鑒定

圖1 大鼠肝微粒體孵育體系中東莨菪內(nèi)酯及代謝物的色譜圖Figure 1 Chromatogram of scopoletin and its metabolites in rat liver microsomal incubation system

大鼠肝微粒體孵育體系中研究人員發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯產(chǎn)生3個代謝物峰，對其分別標(biāo)注為M1、M2和M3(見圖1)。在負(fù)離子模式下，東莨菪內(nèi)酯的分子離子峰為m/z191.0350，分子式為C10H8O4(誤差-0.5 ppm)。在M1的MS圖譜中，產(chǎn)生了m/z353.0523的分子離子峰(C15H14O10，誤差-0.27 ppm)，而其 MS2譜圖中產(chǎn)生m/z177.0182的分子離子峰(C9H6O4，誤差-0.5 ppm)，提示中性丟失176 Da，這是發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)的結(jié)果；在M2的MS圖譜中，產(chǎn)生了m/z367.0674的分子離子峰(C16H16O10，誤差-0.25 ppm)，而M2的MS2圖譜中產(chǎn)生m/z191.0344的分子離子峰(C10H8O4，誤差-0.5ppm)，提示也是葡萄糖醛酸化代謝的結(jié)果。M3的MS譜圖中產(chǎn)生m/z177.0218的分子離子峰(C9H6O4，誤差-0.5 ppm)與原藥分子離子相差CH2基團(tuán)，則推斷是原藥脫甲基而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。以上結(jié)果表明M3是東莨菪內(nèi)酯脫甲基的產(chǎn)物，M1是M3的葡萄糖醛酸結(jié)合物，M2是東莨菪內(nèi)酯的葡萄糖醛酸結(jié)合物(見圖2)。

2.2 東莨菪內(nèi)酯含藥血清誘導(dǎo)大鼠HSC凋亡作用研究

與空白對照組比較，東莨菪內(nèi)酯高劑量組的誘導(dǎo)凋亡率無明顯差異(P>0.05)，低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但作用強(qiáng)度明顯低于秋水仙組提示東莨菪內(nèi)酯含藥血清有較弱的誘導(dǎo)大鼠HSC凋亡作用(見圖3)。

2.3 東莨菪內(nèi)酯含藥血清對大鼠HSC增殖的抑制作用

各組含藥血清對大鼠HSC均有較弱的抑制作用，其中，秋水仙堿組抑制HSC增殖的作用最強(qiáng)(平均抑制率為10.6%)，給藥低劑量組(平均抑制率為4.8%)比給藥高劑量組(平均抑制率為1.2%)的平均抑制率要高。與空白對照組比較，低劑量組平均抑制率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見圖4)。

3 討論

肝纖維化可以發(fā)展為肝硬化和肝癌，早期進(jìn)行抗肝纖維化治療可以有效地緩解或者逆轉(zhuǎn)這一過程，因此尋找有效的抗肝纖維化藥物成為熱點(diǎn)[9]。課題組前期通過系列研究，分別確定了黃根提取物中的乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位中單體成分東莨菪內(nèi)酯有明顯的抗肝纖維化作用[3,6]。同時采用肝大鼠肝星狀細(xì)胞，觀察了包括東莨菪內(nèi)酯在內(nèi)的系列單體對HSC的抗增值和誘導(dǎo)凋亡作用，發(fā)現(xiàn)東莨菪內(nèi)酯的抗增值和誘導(dǎo)凋亡作用較弱，與體內(nèi)作用符合度不高[7]。課題組還對東莨菪內(nèi)酯在肝纖維化大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，但未能檢測出相關(guān)代謝產(chǎn)物，分析其主要原因在于實(shí)驗(yàn)動物所給予的東莨菪內(nèi)酯量較低(高劑量為2.27×10-5g/kg、低劑量為7.56×10-6g/kg)，經(jīng)動物代謝后的代謝產(chǎn)物濃度可能低于檢測限，致使東莨菪內(nèi)酯的體內(nèi)代謝產(chǎn)物不能被檢出。

為更好分析東莨菪內(nèi)酯在體內(nèi)的作用機(jī)制與靶點(diǎn)，課題組通過應(yīng)用液相色譜高分辯串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對東莨菪內(nèi)酯在大鼠肝微粒體孵育體系中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，對代謝產(chǎn)物鑒定的分析過程進(jìn)行了完善，重點(diǎn)對高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和二級質(zhì)譜的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理和完善。高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜法結(jié)合了高效液相色譜的快速分離能力和高分辨質(zhì)譜的高靈敏度、高質(zhì)量精度、高專屬性的檢測能力，是中藥化學(xué)成分及體內(nèi)代謝過程研究的常用方法[10]?，F(xiàn)有的結(jié)果提示東莨菪內(nèi)酯在在大鼠肝微粒體孵育體系發(fā)生脫甲基、脫甲基葡萄糖醛酸化和葡萄糖醛酸化的代謝反應(yīng)，可為真實(shí)體內(nèi)代謝提供參考。并提示我們今后進(jìn)行較高劑量的東莨菪內(nèi)酯大鼠體內(nèi)藥代研究時，除了原性藥物外，還應(yīng)該檢測上述三種代謝產(chǎn)物的濃度。

注：A：M1一級質(zhì)譜圖；B：M1二級質(zhì)譜圖；C：M2一級質(zhì)譜圖；D：M2二級質(zhì)譜圖；E：M3一級質(zhì)譜圖；F：M3二級質(zhì)譜圖；G：可能的代謝途徑。圖2 負(fù)離子模式下東莨菪內(nèi)酯的多級質(zhì)譜圖Note. A, M1 Primary mass spectrum. B, M1 Secondary mass spectrum. C, M2 Primary mass spectrum.D, M2 Secondary mass spectrum. E, M3 Primary mass spectrum. F, M3 Secondary mass spectrum.G, Possible metabolic pathways.Figure 2 ESI-MS/MS sepectrum of Scopoletin in negative ion mode

注：與空白對照組相比，**P<0.01。圖3 含藥血清對大鼠HSC凋亡率的作用Note. Compared with the control group,**P<0.01.Figure 3 Effect of drug-containing serum on the apoptosis rate of HSC in rats

注：與空白對照組相比，**P<0.01。圖4 含藥血清對大鼠HSC增值的影響Note. Compared with the control group,**P<0.01.Figure 4 Effect of drug-containing serum on the inhibition rate of HSC in rats

HSC屬于肝臟內(nèi)的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在正常肝臟中，HSC位于竇周間隙。當(dāng)肝臟受到損傷后，肝星狀細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化成激活狀態(tài)，激活后的HSC慢慢向匯管區(qū)聚集，具有收縮性、增殖性和炎癥性，并產(chǎn)生大量的肝細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)。隨著損傷的持續(xù)進(jìn)行，ECM的合成大于降解，肝臟的纖維化增生便開始形成。近年來的研究資料顯示，肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的的激活，許多抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)也主要圍繞肝星狀細(xì)胞進(jìn)行。[11]。雖然HSC激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，但抗肝纖維化作用并非只取決于是否直接作用于HSC，還包括能否抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。因?yàn)楦卫w維化是個復(fù)雜的病理過程，多種因素(膠原、酶類、糖類、細(xì)胞因子等)參與其中，相互作用相互協(xié)同，最終左右肝纖維化的進(jìn)程[12]。

課題組前期已檢測東莨菪內(nèi)酯單體體外誘導(dǎo)大鼠HSC凋亡和抑制其增殖的作用較弱[7]，現(xiàn)又再次觀測到東莨菪內(nèi)酯含藥血清對大鼠HSC的凋亡率和抑制作用與之相似，發(fā)現(xiàn)無論是東莨菪內(nèi)酯的含藥血清或其單體本身，對大鼠HSC并均未表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用和誘導(dǎo)其凋亡的作用。因此綜合前期及本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究分析莨菪內(nèi)酯能在動物體內(nèi)表現(xiàn)出較好的抗肝纖維化作用，其機(jī)理并非直接或通過代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠HSC凋亡和抑制其增殖，其確切的作用機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究，重點(diǎn)應(yīng)該在于其否抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解的相關(guān)探索。