探討活化蛋白C對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的影響

童曉紅，查錦芬，丁家望，李 松，李穩(wěn)慧，吳 輝，陳 勇

(1.宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003； 2.宜昌市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443003)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion，I/R)一直是心肌缺血治療難以解決的問題，迄今為止，臨床用來治療心肌缺血再灌注損傷的藥物仍存在一定的局限性[1]。心肌缺血再灌注損傷(MIRI)指冠狀動(dòng)脈部分、完全急性阻塞后再通時(shí)，缺血心肌雖可恢復(fù)正常灌注，但其組織損傷反而加重[1-2]。缺血期患者心肌超微結(jié)構(gòu)、心功能等出現(xiàn)損傷，可誘發(fā)心律失常、心肌細(xì)胞壞死、心肌組織損傷、心肌收縮功能的減退等，并且再灌注時(shí)產(chǎn)生的氧自由基會(huì)進(jìn)一步加重心肌損傷，甚至可發(fā)生嚴(yán)重的心律失常而導(dǎo)致猝死。雖然缺血預(yù)處理被證實(shí)是減輕I/R損傷的有效方法之一，但多種原因?qū)е缕渑R床應(yīng)用受限[2]。近年藥物預(yù)處理成為I/R損傷研究的熱點(diǎn)。蛋白C系統(tǒng)為機(jī)體重要的抗凝系統(tǒng)，由活化蛋白C抑制物(APCI)、血漿蛋白C(PC)、蛋白S(PS)和血栓調(diào)節(jié)素(TM)組成，其中PC是該系統(tǒng)發(fā)揮抗凝效應(yīng)的重要部分?；罨鞍證(APC)是一種天然的抗凝劑，APC可選擇性滅活FⅤa、FⅧa 及纖溶酶原激活物抑制物(PAI)，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗凝和促纖溶作用。APC作為心肌細(xì)胞磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，參與了心肌缺血再灌注損傷，心肌缺血再灌注時(shí)PKC活性顯著增強(qiáng)除了抗凝作用外，它還能通過抑制炎性因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，達(dá)到抗炎作用，還能通過抑制細(xì)胞的凋亡過程有效的預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[3-5]。本實(shí)驗(yàn)探討APC對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

納入30只體重為220～250 g的SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡；購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(鄂)2011-0012]，所有實(shí)驗(yàn)操作均在三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室[SYXK(鄂)2011-0061]進(jìn)行，在溫度(22±2)℃，濕度(60±10)%和光照(12 h光照和12 h黑暗循環(huán))條件下，將所有實(shí)驗(yàn)大鼠喂養(yǎng)在無特定病原體的動(dòng)物房中。每個(gè)籠子最多容納5只大鼠，每4～6天更換1次。同時(shí)經(jīng)過我院委員會(huì)的批準(zhǔn)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

MPO試劑盒購買自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司(貨號(hào)：ym-sx1873)；TNF-α試劑盒購買自上海生物科技有限公司(貨號(hào)：f00473)；ICAM-1試劑盒購買自上海雅吉生物科技有限公司(貨號(hào)：iM-05687b)；APC購買自上海春麥生物科技有限公司(貨號(hào)：enz-349)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型的制作

30只SD大鼠隨機(jī)分為APC組、缺血再灌注(I/R)組和假手術(shù)(Sham)組，各10只。APC組：將APC 100 Ug/kg 溶于1 mL生理鹽水中，再灌注前5 min通過頸外靜脈注射。I/R組和假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。

按文獻(xiàn)[6]復(fù)制模型，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(劑量為30 mg/kg)麻醉大鼠，切開氣管，插管連接微型動(dòng)物呼吸機(jī)。參數(shù)：潮氣量20 mL/kg，呼吸頻率每分鐘50次，呼吸時(shí)比為1∶1。用大頭針將四肢皮下穿刺，然后連接心電圖機(jī)記錄一段，對(duì)照為正常心電圖。開胸、暴露心臟。APC組和I/R組用5/0縫線在左冠狀動(dòng)脈前降支根部穿線，在前降支上墊一塑料管一同結(jié)扎，缺血60 min后，剪斷結(jié)扎線再灌注6 h。假手術(shù)組僅在左前降支下穿線不結(jié)扎。手術(shù)完成，每組隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行心肌梗死面積的檢測(cè)，其余大鼠用于病理切片檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 標(biāo)本的收集

再灌注6 h末，經(jīng)下腔靜脈采血3 mL，常溫下靜置20 min，以3000 r/min離心10 min，提取血清，置于-20℃冰箱保存；將心臟迅速剪下，并且用生理鹽水進(jìn)行沖洗，將靠近心尖部分的心肌組織放在10%福爾馬林中進(jìn)行固定24 h，采用常規(guī)石蠟進(jìn)行包埋。另一塊快速放入液氮中進(jìn)行速凍，-80℃保存[7]。

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)

心肌組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。切片經(jīng)脫蠟后，參照ICAM-1試劑盒說明書用SP法進(jìn)行免疫組化染色，光鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行半定量分析[8]。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清TNF-α的濃度，采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定心肌組織MPO的水平；HE染色觀察各組心肌組織病理學(xué)改變。

表1 各組大鼠心肌梗死面積的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與I/R組比較，△P<0.01。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the I/R group,△P<0.01.

表2 各組血清TNF-α水平及心肌組織MPO含量的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01; 與I/R組比較，△P<0.01。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the I/R group,△P<0.01.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積比較

與假手術(shù)組比較，I/R組和APC組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.01)，而APC組大鼠心肌梗死面積較I/R組明顯減少(P<0.05)(見表1)。

2.2 血清TNF-α水平和心肌組織MPO水平的測(cè)定

與假手術(shù)組比較，I/R組和APC組血清TNF-α的水平明顯升高(P<0.01)，而APC組TNF-α的水平較I/R組明顯降低(P<0.01)。在I/R組和APC組心肌組織MPO的水平與假手術(shù)組比較明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，APC組心肌組織MPO水平明顯降低(P<0.05)(見表2)。

2.3 心肌組織ICAM-1免疫組化染色

與假手術(shù)組比較，I/R組和APC組ICAM-1的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)與I/R組比較，APC組心肌組織ICAM-1的表達(dá)明顯減少(P<0.05),(見圖1A、1B)。

2.5 HE染色觀察各組心肌組織病理學(xué)變化

再灌注6 h后，假手術(shù)組未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞包膜完整；與I/R組比較，APC組心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(見圖2)。

3 討論

心肌缺血再灌注能夠觸發(fā)急性炎癥反應(yīng)所具備條件，包括補(bǔ)體激活，心肌內(nèi)化學(xué)因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生，細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞死亡，活性氧生成和微血管通透性增強(qiáng)[9]。近年來有關(guān)心肌缺血再灌注損傷等血栓性疾病與活化蛋白C密切相關(guān)。活化蛋白C是人體重要抗凝因子，其缺乏可導(dǎo)致血栓性疾?。荒负脱ㄕ{(diào)節(jié)蛋白相互結(jié)合時(shí)可以激活A(yù)PC，從而達(dá)到抗凝效果。血漿PC系統(tǒng)主要包括血漿蛋白C、PS、APCI和TM等，當(dāng)凝血酶與TM結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)可激活PC，滅活FⅤa/FⅧa，達(dá)到抗凝及促纖溶目的。PS為輔因子可加強(qiáng)PC活性，APCI可降低PC活性。研究表明，心肌缺血再通后血小板聚集率明顯增高?；颊呷舫霈F(xiàn)心肌缺血，血漿中 TM含量大幅度上升，與凝血酶形成復(fù)合物，消耗血漿APC，同時(shí)活化的血小板釋放大量 APC抑制血漿APC活性。冠狀動(dòng)脈再灌注后血流急劇增加，血液呈高凝狀態(tài)，抗凝系統(tǒng)活化，進(jìn)而激活A(yù)PC，血漿FPS代償增多以抵抗高凝狀態(tài)。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與I/R組比較，#P<0.01。圖1 心肌組織ICAM-1免疫組化染色Note. Compared with the sham group,*P<0.05. Compared with the I/R group,#P<0.01.Figure 1 Myocardial tissue ICAM-1 immunohistochemical staining

圖2 心肌組織HE染色Figure 2 HE staining of myocardial tissue

APC是存在于血漿中的維生素K依賴性的胰島素樣絲氨酸蛋白酶，生理情況下是血液中的主要抗凝成分，同時(shí)近年來的研究顯示其具有抗炎、抗凋亡及保護(hù)內(nèi)皮屏障的功能。它的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)可以中和細(xì)胞損傷，使細(xì)胞得以存活并且其效應(yīng)的發(fā)揮依細(xì)胞和損傷類型的不同而不同，主要表現(xiàn)為抗炎、抗凋亡、改變基因表達(dá)譜和穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞屏障的功能。炎癥是機(jī)體的防御性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為血流速度加快、血管通透性增加。中性粒細(xì)胞在化學(xué)趨化因子的作用下滲出血管外在受損組織大量集聚浸潤(rùn)同時(shí)釋放大量炎性因子如 TNF-α，IL-1β，IL-6，NO，誘導(dǎo) TNF 的表達(dá)導(dǎo)致了大量的凝血酶的產(chǎn)生，這些反應(yīng)修復(fù)現(xiàn)存的組織損傷同時(shí)造成進(jìn)一步的損傷：使凝血和抗凝血平衡紊亂從而促進(jìn)血栓形成和炎癥反應(yīng)。機(jī)體可釋放 IL-4、IL-10 產(chǎn)生進(jìn)一步代償炎癥反應(yīng)。在人體內(nèi)，活化蛋白 C 可以減少白細(xì)胞與選擇素的連接從而抑制中性粒細(xì)胞在體內(nèi)的活化和白細(xì)胞產(chǎn)物的定位；抑制核因子 NF-кB 的核轉(zhuǎn)移從而減少單核細(xì)胞炎性因子如 TNF-α的釋放；通過內(nèi)皮蛋白 C 受體(EPCR)減少白細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子；通過抑制凝血酶的生成和功能的發(fā)揮從而間接抑制其促炎效應(yīng)；促進(jìn)纖維蛋白溶解，防止血栓形成，減輕炎癥反應(yīng)。活化蛋白 C與內(nèi)皮蛋白 C 受體結(jié)合，激活蛋白激酶活化受體-1(PAR-1)，從而激活上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子(SIP-1)轉(zhuǎn)錄，活化內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-1，減少 TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?；罨鞍?C 可抑制凋亡基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。研究表明其亦可以通過蛋白激酶活化受體復(fù)合物阻礙細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子-1 轉(zhuǎn)錄，增加抗凋亡基因 Bcl-2 、凋亡蛋白抑制物的表達(dá)，抑制 Caspase-3、Caspase-9、P21 及 P53 等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究表明其亦可以通過蛋白激酶活化受體復(fù)合物阻礙細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子-1 轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)再灌注6 h心肌組織中有明顯的炎性反應(yīng)，而與對(duì)照組比較，APC組的心肌損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減輕。相關(guān)表明APC能夠改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷腎血流量，減少白細(xì)胞在腎組織的浸潤(rùn)、遷移，降低維持腎小球通過性的穩(wěn)定和在受損腎組織內(nèi)纖維素沉積[10-11]。相關(guān)研究表明APC能夠通過下調(diào)血漿髓過氧化物酶、IL-8、TNF-α水平，來改善受損骨骼肌的電生理作用[12-13]。TNF-α是一種重要的炎性因子，它能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，并促進(jìn)產(chǎn)生中性粒細(xì)胞趨化因子[14-15]。本次研究我們發(fā)現(xiàn)APC能明顯降低再灌注血清TNF-α的水平，同時(shí)減少心肌組織中MPO的含量，降低了ICAM-1的表達(dá)水平，減少了炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮的接觸機(jī)會(huì)，在心肌缺血再灌注中具有抗炎作用。

在凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的作用下蛋白C所形成的APC具有抗凝、抗炎、粗纖溶以及抗凋亡和保護(hù)內(nèi)皮的功能。它通過調(diào)節(jié)炎性因子的產(chǎn)生，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)來減輕炎性損傷。目前APC已被廣泛用于膿毒癥的治療，降低了全身炎性反應(yīng)的病死率[16]同樣本次研究也證實(shí)了APC通過抑制缺血再灌注的炎性反應(yīng)明顯改善了再灌注后的心肌損傷。同時(shí)為心肌缺血再灌注損傷臨床干預(yù)提供新的途徑。