莪術(shù)二酮對腦缺血再灌注損傷小鼠認知功能及神經(jīng)功能的保護作用研究

李佳娜，郭蘇蘭，肖水秀

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110)

缺血性腦病是由于腦局部供血不足或中斷而引起的腦組織局灶性損傷。缺血性腦病具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點，嚴重危害著人們的健康[1-2]。臨床上治療時，往往通過藥物溶栓或其它手術(shù)方法實現(xiàn)血管再通，然而會進一步引發(fā)腦缺血再灌注損傷[3]。目前，腦缺血再灌注損傷機制尚不明確，但有研究表明腦缺血再灌注損傷期間，血液系統(tǒng)有促凝傾向[4]，有研究發(fā)現(xiàn)抗凝藥物對腦缺血再灌注損傷有較好的保護作用，但由于有嚴重的出血副作用，限制了臨床應(yīng)用[5-6]。因此，尋找有抗凝作用和出血副作用小的抗腦缺血再灌注損傷新藥具有重要意義。

廣西莪術(shù)(Curcuma kwangsiensis S. G. Lee etC. F. Liang)為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)的干燥根莖，是廣西的道地藥材[7]。莪術(shù)二酮是廣西莪術(shù)的主要有效成分之一，具有明顯抗血小板、抗炎和抗腫瘤作用等藥理作用[8-9]。關(guān)于莪術(shù)二酮對腦缺血再灌注損傷小鼠認知功能及神經(jīng)功能的作用未見相關(guān)研究報道。因此，本研究旨在探討莪術(shù)二酮對腦缺血再灌注損傷小鼠認知功能及神經(jīng)功能的保護作用，為莪術(shù)二酮的進一步研究開發(fā)提供部分實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級2月齡C57BL/c小鼠100只，雌雄各半，體重為18～22 g，購買于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0002]。動物飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所SPF級屏障動物實驗設(shè)施進行[SYXK(粵)2016-0122]，實驗動物的使用過程中嚴格遵守3R原則，并得到了廣東省實驗動物監(jiān)測所實驗動物倫理委員會的批準(倫理審批號：2016005)。

1.2 主要試劑與儀器

莪術(shù)二酮(純度≥98%，批號：13657-68-6)購于成都格利普生物科技有限公司；依諾肝素鈉注射液(批號：20170321)購于法國Sanofi公司；血栓素B2(TXB2) ELISA試劑盒(批號：20170214)購于南京建成生物工程研究所；6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α) ELISA試劑盒(批號：20170313)購于南京建成生物工程研究所；一抗cAMP(貨號AB：26657，批號：20161204)和一抗p-CREB(貨號AB：26321，批號：20170121)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

BW-MWM101morris水迷宮：上海軟隆科技發(fā)展有限公司；550酶標測定儀：日本Bio-red 公司；LG10-2.4 A型超速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；DGG-9070B電熱鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；體式顯微鏡：深圳市西派克光學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠腦缺血再灌注損傷模型

小鼠按體重隨機分為假手術(shù)組(20)、模型組(20)、低分子肝素鈉組(HS組，20)、莪術(shù)二酮低劑量組(CD-L組，20)和莪術(shù)二酮高劑量組(CD-H組，20)。各組小鼠于造模當天連續(xù)灌胃給藥5 d，HS組小鼠灌胃給藥1 mg/(kg·d)，CD-L組和CD-H組小鼠分別灌胃給藥20 mg/(kg·d)，60 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。參照文獻方法[10]進行造模。主要方法如下：4%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將小鼠仰臥固定于37℃手術(shù)臺，剃去頸部毛發(fā)，用碘伏消毒液消毒頸部皮膚，小心暴露和分離頸部左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，先結(jié)扎頸外動脈遠端，于頸外動脈遠心端剪一小口，將尼龍線由頸外動脈剪口處插入，稍遇阻力停止推進并固定栓線。缺血30 min，拔出尼龍線，完成再灌注，建立小鼠MCAO模型。

1.3.2 小鼠神經(jīng)功能學評分

造模24 h后，參照Longa等[11]5分制法進行行為學評分。評分方法如下：無精神損傷癥狀記為0分；未能完全伸展對側(cè)前爪記為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2分；向?qū)?cè)傾倒記為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失記為4分，其中0分視為造模不成功，剔除。

1.3.3 小鼠Morris水迷宮實驗

參照文獻[12]的實驗方法，具體實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，定位航行實驗：每次實驗將小鼠分別從1、2、4象限中點放入水池，記錄小鼠找到平臺的時間，即潛伏期，假如小鼠在1 min內(nèi)還沒找到平臺，需引導(dǎo)小鼠到平臺上停留20 s，并記錄其潛伏期按1 min，連續(xù)4 d。第5天撤掉平臺，進行空間探索實驗，記錄小鼠60 s內(nèi)通過平臺的次數(shù)以及分析小鼠尋找平臺的策略。

1.3.4 小鼠腦梗死體積測定

小鼠取血后，頸椎脫臼處死小鼠，開顱取腦，生理鹽水沖洗干凈，-20℃冰箱內(nèi)冰凍30 min，從額極向枕極方向把腦組織作冠狀切片，厚度為2 mm，共4片，1% TTC染液37℃并避光孵育30 min，掃描儀掃描，使用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件計算和統(tǒng)計腦梗死率，其中腦梗死率=梗死面積/總面積×100%。

1.3.5 腦水含量測定

小鼠開顱取腦后，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，準確稱量為濕重，將腦組織放入恒溫干燥箱(105℃)烤48 h，稱取腦組織為干重，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.6 血清6-keto-PGF1α和TXB2含量測定

各組小鼠取血，4℃放置3 h，3000 r/min，離心30 min。吸取上層血清，按照試劑盒說明書步驟檢測血清6-keto-PGF1α和TXB2含量。

1.3.7 腦組織勻漿cAMP和p-CREB的表達

BCA試劑盒檢測腦組織勻漿總蛋白濃度，加入等量樣品于電泳槽進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育cAMP(1∶2000)、p-CREB(1∶1500)一抗過夜；洗膜、孵育二抗(1∶8000)、洗膜、顯影，使用Image J軟件半定量分析各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)二酮對MCAO小鼠行為學評分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、HS組和CD給藥組小鼠行為學分數(shù)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組行為學分數(shù)明顯降低(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠行為學分數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖1。

與假手術(shù)組比較，模型組、HS組和CD給藥組小鼠行為學分數(shù)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組行為學分數(shù)明顯降低(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠行為學分數(shù)明顯降低(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。圖1 行為學評分結(jié)果Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group, cP<0.05,ccP<0.01.Figure 1 Results of behavioral evaluation

2.2 莪術(shù)二酮對MCAO小鼠學習記憶能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠尋找到平臺的潛伏期顯著延長(P<0.01)，穿越平臺所在位置的次數(shù)顯著減少(P<0.01)，探索策略也多采用趨向式。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠找到平臺的潛伏期均顯著降低(P<0.05)，穿越平臺所在位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05)，探索策略也多采用直線式。與CD-L組比較，CD-H組小鼠找到平臺的潛伏期均顯著降低(P<0.05)，穿越平臺所在位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05)，見表1和表2。

2.3 莪術(shù)二酮對MCAO小鼠梗死率和腦水含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦梗死率和腦含水量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠腦梗死率和腦含水量明顯降低(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠腦梗死率和腦含水量明顯降低(P<0.05)，見圖2和表3。

2.4 莪術(shù)二酮對MCAO小鼠血清6-keto-PGF1α和TXB2含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清TXB2含量明顯升高(P<0.01)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠血清TXB2含量明顯降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯升高(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠血清TXB2含量明顯降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯升高(P<0.05)，見表4。

表1 各組小鼠潛伏期結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

表2 各組小鼠空間探索能力結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

表3 腦梗死率和腦水含量結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：HS組；D：CD-L組；E：CD-H組。TTC染色圖2 腦梗死體積觀察Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, HS group. D, CD-L group. E, CD-H group. TTC stainingFigure 2 Observation of cerebral infarction volume

2.5 莪術(shù)二酮對MCAO小鼠腦組織勻漿cAMP和p-CREB表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦勻漿cAMP和p-CREB表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，HS組和CD給藥組小鼠腦勻漿cAMP和p-CREB表達明顯升高(P<0.05)。與CD-L組比較，CD-H組小鼠腦勻漿cAMP和p-CREB表達(P<0.05)，見圖3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷常常會導(dǎo)致不可逆的腦組織損傷，進而引起運動、認知等方面的腦功能損傷。腦缺血再灌注損傷發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、細胞凋亡等密切相關(guān)[13]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷常?？梢鹉X組織微循環(huán)障礙，通過抗凝藥物防治具有較好的改善作用[14]。低分子量肝素鈉是一種新型的抗凝血酶Ⅲ依賴性抗血栓形成藥，藥理作用與普通肝素鈉基本相似。但其抗凝出血傾向較弱，使用相對安全，臨床上可用于孕婦抗血栓防治[15]，故本實驗選用低分子量肝素鈉作為陽性對照藥。莪術(shù)二酮是廣西莪術(shù)的主要有效成分之一，藥理學研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯抗血小板、抗炎和抗腫瘤作用等藥理作用。此外，石紅等[9]研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二酮可顯著改善老年小鼠部分肝切除術(shù)后認知功能障礙，其機制可能與其通過抑制海馬組織中氧化應(yīng)激，抑制NF-κB激活，減少炎癥細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放有關(guān)。那么莪術(shù)二酮對腦缺血再灌注損傷小鼠認知功能及神經(jīng)功能是否有較好的保護作用？這是本文章重點探討的問題。

腦缺血再灌注損傷常會引起運動功能損傷，Longa 5分制法評分主要用于評價小鼠的運動功能。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的行為學分數(shù)較假手術(shù)組有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠行為學分數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，且具有劑量依賴性，提示莪術(shù)二酮可明顯改善MCAO小鼠運動能力。Morris水迷宮是評價學習、記憶能力等認知能力的經(jīng)典方法[16]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠潛伏期較假手術(shù)組明顯延長，穿越平臺所在位置的次數(shù)明顯減少，多采用趨向式的探索策略，差異具有統(tǒng)計學意義。提示模型組小鼠的認知能力受到損害，而CD給藥組小鼠上述指標較模型組明顯改善，呈劑量依賴性，提示莪術(shù)二酮可明顯改善MCAO的認知能力。腦梗死率和腦組織病理學變化是評價模型成功和藥物有效的最直接簡便的觀察方法[17]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腦梗死率較假手術(shù)組明顯升高，腦海馬齒狀回神經(jīng)細胞損傷嚴重，差異具有統(tǒng)計學意義，提示造模成功。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠腦梗死率明顯降低，腦海馬齒狀回神經(jīng)細胞損傷明顯改善，差異具有統(tǒng)計學意義，具有劑量依賴性。提示莪術(shù)二酮可明顯改善MCAO小鼠神經(jīng)細胞的壞死。有研究表明腦水腫是腦缺血性疾病功能障礙的主要原因，也稱為該疾病最嚴重的并發(fā)癥[18]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腦含水量較假手術(shù)組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠腦含水量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，具有劑量依賴性。提示莪術(shù)二酮可明顯減輕MCAO小鼠腦水腫程度。TXB2和6-keto-PGF1α反映機體的凝血功能的兩個指標。它們分別是TXA2和PGI2的代謝產(chǎn)物，TXB2和6-keto-PGF1α的含量檢測可間接反映血液TXA2和PGI2的水平，而調(diào)節(jié)6-keto-PGF1α/TXB2比值對血栓形成有重要影響[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清TXB2含量較假手術(shù)組明顯升高，而6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯降低差異具有統(tǒng)計學意義。而給與莪術(shù)二酮后，小鼠血清TXB2含量明顯降低，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，具有劑量依賴性，提示莪術(shù)二酮可抑制血小板聚集，從而改善MCAO小鼠微循環(huán)障礙。研究發(fā)現(xiàn)[20-21]cAMP/CREB/BDNF 信號通路是中樞神經(jīng)維持正常生理和促進神經(jīng)細胞存活、再生以及分化等有關(guān)，與學習記憶能力的形成也有密切的關(guān)系。莪術(shù)二酮給藥組可明顯升高cAMP和 CREB的表達水平，提示莪術(shù)二酮可能通過促進神經(jīng)細胞存活、再生、分化，從而保護小鼠的認知功能。

表4 血清6-keto-PGF1α和TXB2含量結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

注：1：假手術(shù)組；2：模型組；3：HS組；4：CD-L組；5：CD-L組。與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,bbP<0.01；與CD-L組比較，cP<0.05，ccP<0.01。圖3 各組小鼠腦組織勻漿cAMP和p-CREB Western blot電泳圖Note. 1, Sham operation group. 2, Model group. 3, HS group. 4, CD-L group. 5, CD-H group.Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group, cP<0.05,ccP<0.01.Figure 3 Western blot electrophoresis of cAMP and p-CREB in brain tissue homogenization of various groups

綜上所述，莪術(shù)二酮對腦缺血再灌注損傷小鼠認知功能及神經(jīng)功能有較好的保護作用，其機制可能與降低TXB2含量，升高6-keto-PGF1α、6-keto-PGF1α/TXB2比值、cAMP和 CREB的水平，從而改善MCAO小鼠微循環(huán)障礙以及激活cAMP/CREB/BDNF信號通路有關(guān)。