復(fù)方蒲公英制劑幼齡大鼠重復(fù)給藥毒性研究

張城達(dá)，宋翼升，扈 榮，白海波，謝 鋒，黃敏聰，陳云祥，鄭高利，張立將*

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心，杭州 310053； 2.杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新藥研究院有限公司，杭州 310005)

急性扁桃體炎是由細(xì)菌或病毒引起腭扁桃體的急性非特異性炎癥，是小兒內(nèi)科的多發(fā)病[1]。臨床上常以對(duì)癥處理為主，使用大量抗生素，但副作用大，易發(fā)生耐藥、反復(fù)發(fā)作而成為慢性扁桃體炎[2]。復(fù)方蒲公英制劑為中藥復(fù)方制劑，以蒲公英(TaraxacummongolicumHand-Mazz)等4種具有清熱解毒作用或清肺利咽功效的中藥材經(jīng)水煎提取而成，臨床擬聯(lián)合抗生素治療兒童急性扁桃體炎、咽炎，達(dá)到減輕癥狀、縮短病程、增強(qiáng)療效的目的。

復(fù)方蒲公英制劑中的蒲公英等4味中藥已在臨床上大量使用，已有豐富的臨床使用數(shù)據(jù)，但專門針對(duì)6歲以上兒科人群的復(fù)方蒲公英制劑是一種創(chuàng)新藥，且沒有前期的動(dòng)物和臨床安全性數(shù)據(jù)，不能確定對(duì)兒童發(fā)育中器官系統(tǒng)是否有潛在安全性擔(dān)憂。根據(jù)國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)《S11：Nonclinical safety testing in support of development of paediatric medicines(Draft)》指導(dǎo)原則中證據(jù)權(quán)重法(WoE)要求以及我國原國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心(CDE)《兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》和CDE對(duì)中藥兒科用藥非臨床安全性評(píng)價(jià)的考慮共識(shí)，復(fù)方蒲公英制劑臨床試驗(yàn)申請前需要進(jìn)行幼齡動(dòng)物毒性試驗(yàn)(Juvenile Animal Study, JAS)[3-6]。JAS沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)，藥品監(jiān)管部門對(duì)此無統(tǒng)一要求，原則上基于研究目的和科學(xué)原理做逐案處理，具體情況具體分析，以支持相應(yīng)年齡段的兒科人群進(jìn)行臨床試驗(yàn)[7-8]。對(duì)于兒科專用/先是兒科藥物，由于沒有成年動(dòng)物/成人研究的支持，應(yīng)該采用類似于成年動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的篩選式JAS設(shè)計(jì)[4,7]。

根據(jù)上述指導(dǎo)原則要求，本研究考察幼齡SD大鼠連續(xù)4周(Postnatal Day(PND)27～ PND54)經(jīng)口給予“復(fù)方蒲公英制劑”(給藥結(jié)束恢復(fù)4周)可能產(chǎn)生的一般毒性以及對(duì)幼齡動(dòng)物發(fā)育毒性的影響，確定未觀察到不良反應(yīng)劑量(NOAEL)，為臨床試驗(yàn)提供參考依據(jù)。同時(shí)通過本試驗(yàn)探索合適的幼齡動(dòng)物毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，為中藥的JAS提供可行的評(píng)價(jià)體系供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，21日齡(PND21)，144只，雌雄各半，雄鼠體重42～61 g，雌鼠體重37～59 g。購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(浙)2018-0001]，動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心屏障系統(tǒng)動(dòng)物房[SYXK(浙)2017-0010]，每籠飼養(yǎng)同性別動(dòng)物不多于5只，自由飲水?dāng)z食，室溫20.5℃～23.5℃，相對(duì)濕度50%～69%，12 h明、12 h暗。本實(shí)驗(yàn)由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)審核動(dòng)物倫理，動(dòng)物倫理審批號(hào)：GLP-A-020，本試驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

復(fù)方蒲公英制劑(批號(hào)：171001)，由杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新藥研究院有限公司生產(chǎn)提供，每克浸膏粉相當(dāng)于生藥5.4 g；棕黃色至棕褐色粉末，氣微，微苦，溶于水。受試物臨用前用純水配制成所需濃度。

血液學(xué)檢查試劑(Siemens)；生化學(xué)檢查試劑(德國 DiaSys)；Anti-rat CD3 FITC、Anti-rat CD45RA PE、Anti-rat CD8a PE、Anti-rat CD4 APC(BD公司)；大鼠免疫球蛋白A(IgA)、補(bǔ)體4(C4)、骨鈣素(BGP)、睪酮(T)、雌二醇(E2)、類胰島素生長因子-1(IGF-1)、類胰島素生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBp-3)、生長激素(GH) ELISA試劑盒(R&D公司)。

ADVIA2120全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國 Bayer)；7100全自動(dòng)生化分析儀(日本 日立)；CA-1500全自動(dòng)血凝分析儀(日本 Sysmex)；N-600尿液分析儀(長春 迪瑞)；Top Scan動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(CSI 公司)；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國 BD)；Synergy HT酶標(biāo)儀(Bio Tek)；Discovery-Wi骨密度儀(Hologic)；Welch Allyn 12500雙目間接檢眼鏡(美國偉倫)；80i顯微鏡(日本尼康)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及劑量設(shè)計(jì)

144只幼齡SD大鼠(雌雄各半)，按體重隨機(jī)分為4組(即溶媒對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組)，每組36只(雌雄各半)，分別每天灌胃(ig)給予純水、復(fù)方蒲公英制劑1.2、3.8、12 g/kg，給藥體積均為1 mL/100 g，每天2次(給藥間隔2～3 h)，連續(xù)給藥4周(28 d)。

1.3.2 劑量設(shè)計(jì)依據(jù)

低劑量相當(dāng)于幼齡大鼠等效劑量；高劑量為最大可行劑量(MFD)，即以最大濃度、幼齡大鼠最大給藥體積給藥；中劑量等比設(shè)置。

1.3.3 起始給藥年齡和給藥期限

受試物擬使用人群為6歲以上兒童(6～12歲)，根據(jù)人和大鼠對(duì)應(yīng)的發(fā)育階段[9]，本試驗(yàn)從PND27開始給藥，經(jīng)口灌胃(ig)，連續(xù)給藥28 d(PND27 ～ PND54，覆蓋兒童期初期至青少年期)，可以支持6歲以上兒童的療程為1周的臨床試驗(yàn)及臨床應(yīng)用。

1.3.4 檢測指標(biāo)

試驗(yàn)期間每天觀察動(dòng)物的臨床癥狀；大鼠的體重和攝食量在給藥期每周各稱量2次，恢復(fù)期每周各稱量1次；雄鼠于PND31 ～ PND50、雌鼠于PND24 ～ PND37每天進(jìn)行性征發(fā)育觀察(龜頭包皮分離情況/陰道張開情況)；所有大鼠每周檢查1次頂臀長；給藥中期、給藥結(jié)束檢查和恢復(fù)期結(jié)束檢查分別對(duì)全部存活大鼠進(jìn)行一般行為學(xué)檢查；給藥結(jié)束檢查、恢復(fù)期結(jié)束檢查對(duì)各組同批大鼠(5或6只/性別/組)進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)。給藥結(jié)束檢查和恢復(fù)期結(jié)束檢查分別隨機(jī)抽樣80只(每組20只，♀♂各半)和64只(每組16只，♀♂各半)進(jìn)行常規(guī)重復(fù)給藥毒性指標(biāo)以及發(fā)育毒性相關(guān)指標(biāo)檢查。具體指標(biāo)，見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀、體重、攝食量

各動(dòng)物組均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡或?yàn)l死。高劑量組大鼠僅在給藥后出現(xiàn)一過性流涎(持續(xù)約10～20 min左右恢復(fù))，未見其他異常；中、低劑量組未見任何異常。主要高劑量組雄鼠體重和攝食量有一定降低影響，具體表現(xiàn)為：高劑量組雄鼠在給藥期第12、19、25、28天的體重顯著低于溶媒對(duì)照組(P<0.05)，其余各組雌雄大鼠體重未見明顯變化(P>0.05)；高劑量雄鼠給藥期第5、8、12天的攝食量明顯低于溶媒對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠攝食量未見明顯變化(P>0.05)?；謴?fù)期間，各組體重、攝食量均未見明顯異常，見圖1和圖2。

2.2 血液學(xué)

僅高劑量組雌雄大鼠給藥結(jié)束檢查部分血液學(xué)指標(biāo)有一定的異常影響，低、中劑量組給藥結(jié)束檢查及各劑量組恢復(fù)期結(jié)束檢查雌雄大鼠血液學(xué)指標(biāo)均未見明顯異常和毒性影響。主要表現(xiàn)為給藥結(jié)束檢查時(shí)高劑量組雌雄大鼠RBC、HGB、HCT顯著降低(P<0.05或P<0.01)，#RETIC、%RETIC、RDW顯著升高(P<0.05或P<0.01)，這些指標(biāo)變化與造血功能影響相關(guān)，但給藥結(jié)束4周后恢復(fù)期結(jié)束檢查時(shí)上述指標(biāo)均恢復(fù)正常，見表2。

表1 復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡大鼠毒性檢測指標(biāo)

注：與溶媒對(duì)照組比較，*P<0.05。圖1 雄性/雌性大鼠體重增長曲線Note. Compared with the control group,*P<0.05.Figure 1 Weight curve of male/female rats

注：與溶媒對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 雄性/雌性大鼠攝食量曲線Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.Figure 2 Feed intake curve of male/female rats

表2 復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡SD大鼠血液學(xué)的影響

注：與溶媒對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.3 生化學(xué)

復(fù)方蒲公英制劑主要對(duì)高劑量組雌雄大鼠給藥結(jié)束檢查時(shí)血清生化學(xué)部分脂代謝、糖代謝、電解質(zhì)相關(guān)指標(biāo)有一定的異常影響，低、中劑量組給藥結(jié)束檢查及各劑量組恢復(fù)期結(jié)束檢查雌雄大鼠血液學(xué)指標(biāo)均未見明顯異常。具體主要表現(xiàn)有：給藥結(jié)束檢查時(shí)雄性大鼠高劑量組T.CHO、TG、GLU、Na+，中劑量組T.CHO顯著降低(P<0.05或P<0.01)，高劑量組K+顯著升高(P<0.05)；雌性大鼠高劑量組TG、Na+顯著下降(P<0.05或P<0.01)，K+顯著升高(P<0.05)，其余指標(biāo)未見明顯異常，見表3。

2.4 尿液、眼科及骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)

給藥結(jié)束檢查時(shí)，高劑量組大鼠酮體、蛋白質(zhì)、白細(xì)胞、比重、pH、微白蛋白升高(P<0.05或P<0.01)；中劑量組雄性大鼠pH、微白蛋白升高(P<0.05)，雌性大鼠比重升高(P<0.01)。各組其余尿液指標(biāo)未見明顯異常。恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，各劑量組上述異常均恢復(fù)，見表4。

眼科檢查、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)均未見明顯異常和毒性影響。

2.5 生長發(fā)育、性激素及骨骼系統(tǒng)發(fā)育

復(fù)方蒲公英制劑主要對(duì)高劑量組大鼠頂臀長有短暫的可逆性的減小影響，主要表現(xiàn)為高劑量組雄鼠給藥期第28天、雌鼠給藥期第22天的頂臀長短于溶媒對(duì)照組(P<0.01)；給藥期中、低劑量組及恢復(fù)期各組大鼠的頂臀長與溶媒對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。各劑量組幼齡雄鼠的龜皮分離出現(xiàn)時(shí)間、幼齡雌鼠的陰道張開出現(xiàn)時(shí)間，睪酮(T)、雌二醇(E2)、股骨骨密度、股骨長、血清骨鈣素水平均與溶媒對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。各劑量組雄鼠的GH、IGFBp-3、IGF-1水平均與溶媒對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；給藥結(jié)束檢查，各組雌鼠中劑量組GH顯著升高(P<0.01)，其余各組雌鼠IGFBp-3、IGF-1水平與對(duì)照組未見明顯差異(P>0.05)；恢復(fù)期結(jié)束檢查，雌鼠高、低劑量組GH和高、中、低劑量組IGF-1顯著降低(P<0.05或P<0.01)，各組雌鼠IGFBp-3與對(duì)照組未見明顯差異(P>0.05)；見表5。鑒于給藥結(jié)束時(shí)各劑量組GH、IGF-1均未見明顯異常(僅中劑量GH出現(xiàn)無劑量-時(shí)效關(guān)系的小幅波動(dòng))，各劑量組恢復(fù)期間頂臀長、骨骼系統(tǒng)發(fā)育其他指標(biāo)(長骨長、骨密度、骨鈣素等)也均未見明顯異常，見表6，且上述異常的GH、IGF-1數(shù)值波動(dòng)幅度較小，綜合考慮無明顯毒理學(xué)意義。

表3 復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡SD大鼠血清生化學(xué)影響(給藥結(jié)束檢查,

注：與溶媒對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

表4 復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡SD大鼠尿液指標(biāo)的影響(給藥結(jié)束檢查)

注：整組(各分類/等級(jí)水平)總體與溶媒對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

表5 復(fù)方蒲公英制劑對(duì)雌性幼齡SD大鼠生長發(fā)育相關(guān)激素的影響

注：與溶媒對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.6 行為記憶

改良Irwin’s行為學(xué)評(píng)價(jià)：復(fù)方蒲公英制劑僅對(duì)中、高劑量組幼齡大鼠的應(yīng)激情緒反應(yīng)類指標(biāo)(應(yīng)激性發(fā)聲、轉(zhuǎn)移喚醒異常、觸摸逃避異常等)發(fā)生率略有升高影響(P<0.05或P<0.01)，見表7。這些異常可能與大鼠反復(fù)被抓取并給予中藥受試物所產(chǎn)生的應(yīng)激條件反射或應(yīng)激性心理情緒有關(guān)。

Morris水迷宮試驗(yàn)：復(fù)方蒲公英制劑對(duì)雌雄大鼠水迷宮訓(xùn)練期間的潛伏期時(shí)間和空間探索測定時(shí)到達(dá)平臺(tái)的相關(guān)指標(biāo)，均未見明顯影響。

2.7 免疫學(xué)指標(biāo)檢查

給藥結(jié)束檢查時(shí)，大鼠脾重量和臟器系數(shù)有升高趨勢，其中雌性高劑量顯著高于溶媒對(duì)照組P<0.05或P<0.01)；雄性大鼠高劑量組IgG明顯升高(P<0.05)，其余各組指標(biāo)未見明顯異常；恢復(fù)期結(jié)束檢查時(shí)未見異常，見表8。

2.8 臟器重量及系數(shù)及組織病理學(xué)檢查

除給藥結(jié)束檢查無毒理學(xué)意義的個(gè)別肝系數(shù)、腎系數(shù)升高波動(dòng)外，各臟器重量級(jí)系數(shù)未見顯著性差異。鏡檢主要發(fā)現(xiàn)，給藥結(jié)束檢查時(shí)高劑量組大鼠出現(xiàn)脾、肝輕度/輕微髓外造血和骨髓紅系造血細(xì)胞輕度增生，恢復(fù)期結(jié)束均恢復(fù)，其他臟器組織未見明顯病理學(xué)改變，見圖3。

表6 復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡SD大鼠骨骼發(fā)育的影響(給藥結(jié)束檢查，

注：整組(各分類/等級(jí)水平)總體與溶媒對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

表8 給藥結(jié)束檢查復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡大鼠免疫指標(biāo)的影響

注：與溶媒對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

3 討論

我國缺乏專門的兒科藥物，臨床上常采用在成人劑量基礎(chǔ)上進(jìn)行減量來解決兒童專用藥短缺問題。但是由于兒科人群的特殊性，兒童不等于小的成人，因?yàn)閮和谏?、心理和發(fā)育方面與成人不同，這就導(dǎo)致了預(yù)期藥物的毒性與成人間存在差異[6,10]。所以美國食品藥品管理局(FDA)、歐盟藥監(jiān)局(EMA)要求除了仿制藥、生物類似物、指定罕用適應(yīng)證/孤兒藥、失去專利保護(hù)的藥物和已經(jīng)被廣泛使用的產(chǎn)品，其它藥物研發(fā)必須包含兒科研究計(jì)劃(Pediatric Study Plan, PSP; Pediatric Investigation Plan, PIP)，必須開展兒科用藥臨床前安全性評(píng)價(jià)，提交幼齡動(dòng)物安全性數(shù)據(jù)[11]。然而我國對(duì)于兒科用藥尤其是兒科中藥的非臨床安全性評(píng)價(jià)研究尚屬于起步階段，評(píng)價(jià)技術(shù)體系還有待完善。

自2006年起，F(xiàn)DA、EMA、日本厚生勞動(dòng)省(JMHLW)、ICH等機(jī)構(gòu)相繼頒布了兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(或草案)來規(guī)范、促進(jìn)兒科藥物的研發(fā)[3,12-14]。但上述指導(dǎo)原則主要涉及化學(xué)藥和生物制品，并未涉及中藥。2017年我國CDE起草公布的《兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(征求意見稿)，推進(jìn)了我國兒科用藥監(jiān)管要求與國際技術(shù)要求的進(jìn)一步接軌，且明確適用于中藥。

復(fù)方蒲公英制劑是一種中藥復(fù)方新藥，臨床擬用人群為6歲以上兒童(6～12歲)。本研究結(jié)果顯示，幼齡SD大鼠連續(xù)4周(PND27 ～ PND54，每天給藥2次)重復(fù)經(jīng)口灌胃給予復(fù)方蒲公英制劑1.2、3.8、12 g/kg劑量，高劑量組出現(xiàn)一定異?；蚨拘苑磻?yīng)，而中、低劑量組未見明顯的毒性影響。給藥期間，高劑量組大鼠出現(xiàn)流涎、體重和攝食量減輕，給藥結(jié)束后即可恢復(fù)，可能與幼齡大鼠經(jīng)口給予大體積高濃度中藥有關(guān)。而高劑量組頂臀長的增長減緩與體重變化呈正相關(guān)。給藥結(jié)束檢查時(shí)，高劑量組大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞的增多考慮為由于紅細(xì)胞減少而引起代償性的骨髓生成的幼紅細(xì)胞的增加；而組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的脾、肝輕度/輕微髓外造血和骨髓紅系造血細(xì)胞輕度增生(給藥結(jié)束后即可恢復(fù)正常)，可能也與給藥后大鼠出現(xiàn)的貧血傾向(紅細(xì)胞、血紅蛋白降低，網(wǎng)織紅細(xì)胞升高等)相關(guān)的代償性影響有關(guān)。然而，給藥結(jié)束檢查時(shí)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)并未出現(xiàn)明顯與粒、紅細(xì)胞系相關(guān)的異常，可能因?yàn)樯鲜鲐氀Y狀及其代償性造血程度較輕，尚未能引起骨髓細(xì)胞各分類比例的明顯變化。綜合考慮，上述紅細(xì)胞系指標(biāo)異?？赡転樗幬锵嚓P(guān)的可逆的溶血性貧血，給藥結(jié)束即可恢復(fù)，與受試物的藥物作用有一定關(guān)系，提示血液紅細(xì)胞可能為本受試物的毒性靶組織，臨床上要注意監(jiān)測紅細(xì)胞指標(biāo)的變化。給藥結(jié)束檢查時(shí)中劑量組雄鼠、高劑量雌雄大鼠在給藥結(jié)束檢查時(shí)T.CHO、TG、GLU水平均低于溶媒對(duì)照組，提示本品在體內(nèi)對(duì)脂肪代謝及糖代謝有一定作用。這一作用可能與復(fù)方中所含的一味藥材的降糖降脂藥理學(xué)作用(降糖降脂)有關(guān)，可能為藥理作用的延伸或放大。給藥結(jié)束檢查時(shí)，高劑量組雌雄大鼠均有Na+↓、K+↑，其中K+↑考慮可能與紅細(xì)胞減少及溶血性貧血相關(guān)。

給藥結(jié)束檢查時(shí)，復(fù)方蒲公英制劑對(duì)高劑量組雌雄大鼠部分尿液指標(biāo)(酮體↑、蛋白質(zhì)↑、白細(xì)胞↑、比重↑、pH值↑、微白蛋白↑)以及中劑量組部分尿液指標(biāo)(雄鼠pH↑、微白蛋白↑，雌鼠比重↑)有一定影響，上述異常在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)基本恢復(fù)正常。酮體為脂肪氧化物產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，這與血脂降低(脂肪代謝增加)有關(guān)聯(lián)性；以上尿液指標(biāo)有一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，給藥結(jié)束后可恢復(fù)，故考慮也可能與給予大體積高濃度的中藥后通過尿液排泄出的藥物原型或代謝產(chǎn)物的理化性質(zhì)有關(guān)。但結(jié)合腎功能相關(guān)血清指標(biāo)并無異常、腎臟并未見明顯組織病理學(xué)異常，且上述尿液異常波動(dòng)幅度較小，故綜合考慮無明顯的毒理學(xué)/臨床意義。

復(fù)方蒲公英制劑其中一味藥材有報(bào)道稱其提取物可以明顯提高小鼠機(jī)體的免疫功能，如增強(qiáng)殺傷性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(細(xì)胞免疫)、刺激B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生(體液免疫)、增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用(非特異性免疫)，并增高脾臟系數(shù)。故本研究給藥結(jié)束檢查時(shí)高劑量組大鼠IgG、脾重量和系數(shù)升高等免疫功能增強(qiáng)作用可能為受試物有效成分的藥理作用的延伸或放大。綜合生殖器官的臟器重量、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查，性激素水平以及性征發(fā)育等結(jié)果，復(fù)方蒲公英制劑對(duì)幼齡大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育未見明顯毒性影響。

綜上所述，幼齡SD大鼠連續(xù)4周(PND27 ～ PND54，每天給藥2次)重復(fù)經(jīng)口給藥毒性實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方蒲公英制劑高劑量(12 g/kg)對(duì)幼齡大鼠有一定的毒性影響，主要毒性靶組織為血液紅細(xì)胞；NOAEL為3.8 g/kg(相當(dāng)于80 g幼齡大鼠等效劑量的3.2倍，相當(dāng)于200 g大鼠等效劑量的4.2倍)。

本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上除了常規(guī)重復(fù)給藥毒理指標(biāo)，又針對(duì)幼齡動(dòng)物發(fā)育相關(guān)的特定擔(dān)憂進(jìn)行了各系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的終點(diǎn)檢測，選擇的研究方法和指標(biāo)可以滿足中藥幼齡動(dòng)物毒性評(píng)價(jià)需求，對(duì)中藥JAS試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步完善JAS在兒科中藥非臨床評(píng)價(jià)領(lǐng)域的發(fā)展提供了科學(xué)參考。