小鼠妊娠期慢性疼痛對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制研究*

李 清 黃 悅 閆文靖 劉玉平 涂淑敏 周 芳△

（1徐州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，徐州 221004；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院護(hù)理部，徐州 221002；3北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院麻醉科，北京 102218）

疼痛是一種與組織損傷或潛在組織損傷相關(guān)的感覺(jué)、情感、認(rèn)知和社會(huì)維度的痛苦體驗(yàn)。持續(xù)或復(fù)發(fā)的時(shí)間超過(guò)3個(gè)月以上的疼痛被定義為慢性疼痛(chronic pain, CP)[1]。慢性疼痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可導(dǎo)致病人機(jī)體功能失調(diào)、免疫力下降和誘發(fā)各種并發(fā)癥，從而嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，增加家庭負(fù)擔(dān)，給社會(huì)也造成巨大損失，因此備受關(guān)注[2,3]。

孕婦作為社會(huì)生活中的特殊人群，其在整個(gè)孕期經(jīng)受的腰痛、骶尾痛、骨盆痛、下肢痛等慢性疼痛并未受到足夠的重視。本課題組前期人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)妊娠期慢性疼痛與孕婦焦慮和抑郁[4,5]、剖宮產(chǎn)率高、經(jīng)陰道產(chǎn)者總產(chǎn)程延長(zhǎng)、出血量增加、新生兒Apgar評(píng)分較差等有密切關(guān)系[6]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)整個(gè)孕期處于慢性疼痛狀態(tài)下的母鼠娩出的子鼠存在出生體重低、尾長(zhǎng)較短等生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象[7,8]，但其具體機(jī)制不明。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建孕期小鼠慢性炎性痛模型，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay, ELISA)檢測(cè)慢性疼痛對(duì)孕鼠及子鼠外周血中去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)和皮質(zhì)醇(cortisol)水平的影響，并通過(guò)實(shí)施優(yōu)裕胎教方案對(duì)慢性疼痛進(jìn)行干預(yù)，以揭示妊娠期慢性疼痛對(duì)子鼠生長(zhǎng)發(fā)育影響的機(jī)制。

方 法

1.材料

實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物均為SPF級(jí)昆明小鼠，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK (Jiangsu) 2002-0038。雌性小鼠，65～90日齡，25～35 g，無(wú)孕產(chǎn)史。雄性小鼠，75～90日齡，25～45 g，用于與雌鼠交配。

2.方法

（1）動(dòng)物受孕及實(shí)驗(yàn)分組：取25個(gè)小鼠鼠籠，每個(gè)鼠籠內(nèi)放1只雄鼠和2只雌鼠，同時(shí)間點(diǎn)交配，10～12 h后發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道口出現(xiàn)陰栓或陰道涂片發(fā)現(xiàn)精蟲(chóng)者定為妊娠第 0天。選取40只成功受孕雌鼠，隨機(jī)分為四組（每組10只）：正常對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組、慢性疼痛組（下簡(jiǎn)稱“慢疼”） 、慢疼+優(yōu)裕胎教組。

（2）孕鼠慢性關(guān)節(jié)炎疼痛模型的制備[5]：母鼠交配成功后當(dāng)日（妊娠第0天），在七氟烷麻醉下，圍繞其左后足足跖關(guān)節(jié)部選擇兩點(diǎn)皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant, CFA) 100 μl(500 μg)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性關(guān)節(jié)炎。在注射后的24 h內(nèi)（妊娠第1天，即疼痛造模第1天）即出現(xiàn)熱和機(jī)械痛覺(jué)閾值的降低并可維持4周以上，覆蓋母鼠整個(gè)孕期（22 d左右）及產(chǎn)后1周。分別在造模后第1、3、7、14、21、28天，通過(guò)監(jiān)測(cè)母鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)來(lái)評(píng)估其疼痛程度，以確定慢性疼痛模型制備成功且母鼠在各時(shí)間點(diǎn)疼痛水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。假手術(shù)對(duì)照組母鼠用同樣方式注入同體積無(wú)菌PBS。監(jiān)測(cè)儀器：IITC series 8, IITC Co., LTD., USA。

（3）飼養(yǎng)方式：常規(guī)飼養(yǎng)方案：?jiǎn)位\單只飼養(yǎng)，鼠籠周圍環(huán)境溫度23±1℃，相對(duì)濕度以50%～60%，食物充足，自由攝食飲水，晝夜均衡，直至分娩后3周。

優(yōu)裕胎教飼養(yǎng)方案：將慢疼 + 優(yōu)裕胎教組孕鼠放置于寬敞的鼠籠中飼養(yǎng)，每籠1只?；\中擺放有洞假房、云梯、滑繩、供孕鼠啃咬木頭，在常規(guī)飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上還額外提供花生、葵花子、堅(jiān)果等，同時(shí)將小鼠置于節(jié)奏舒緩的音樂(lè)中（每天6 h，音量控制在50～60分貝）[9]。

（4）NE、皮質(zhì)醇水平檢測(cè)：在母鼠孕第6天、12天、18天、生產(chǎn)當(dāng)日、產(chǎn)后6天和子鼠出生當(dāng)天（24 h內(nèi)）、出生后第3周、第6周、第9周分別用ELISA法檢測(cè)其血清中NE和皮質(zhì)醇水平。

（5）子鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況檢測(cè)：觀測(cè)新生子鼠一般生理指標(biāo)，檢查其頭、頸、軀干、四肢、尾等大體外觀有無(wú)變異或畸形，稱量子鼠出生當(dāng)日體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)。體重：子鼠出生后24 h內(nèi)用電子天平秤取體重，以g計(jì)數(shù)。身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)：子鼠出生后24 h內(nèi)將其平放桌上，背面向上，使身體伸直，用尺子量取鼠頭部至鼠尾根部的長(zhǎng)度為其身長(zhǎng)，取鼠尾根部至尾尖的長(zhǎng)度為其尾長(zhǎng)，長(zhǎng)度單位以cm計(jì)算。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用post-hoc LSD法。計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示，多組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜ 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.慢性疼痛對(duì)子鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

慢疼組新生鼠平均體重低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 13.890,P＜ 0.01)；慢疼組孕鼠尾長(zhǎng)均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 4.663，P＜ 0.05)；慢疼 + 優(yōu)裕胎教組新生鼠的平均體重、尾長(zhǎng)高于慢疼組，但與假手術(shù)組相比無(wú)差別；四組新生鼠身長(zhǎng)無(wú)差別(P＞ 0.05)；慢疼組發(fā)現(xiàn)4只畸形新生鼠：1只出生時(shí)無(wú)左后肢，3只有短尾現(xiàn)象，尾長(zhǎng)小于0.8 cm。其余3組未發(fā)現(xiàn)畸形新生鼠。四組新生鼠畸形率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F= 24.172，P＜ 0.01，見(jiàn)表1）。

2.慢性疼痛對(duì)子鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制

（1）慢性疼痛對(duì)母鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響（見(jiàn)圖1）：慢疼組母鼠NE和皮質(zhì)醇水平在整個(gè)孕期及產(chǎn)后6天均高于假手術(shù)組(:P＜ 0.05)。慢疼+優(yōu)裕胎教組母鼠在孕12天至分娩當(dāng)日的NE和皮質(zhì)醇水平均低于慢疼組(P＜ 0.05)，產(chǎn)后第6天與慢疼組相比無(wú)差別 (P＞ 0.05)。

（2）慢性疼痛對(duì)子鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響（見(jiàn)圖2）：慢疼組子鼠NE和皮質(zhì)醇水平在出生當(dāng)日及出生后第三周均高于假手術(shù)組(P＜ 0.05)，從出生后第6周開(kāi)始，兩種遞質(zhì)水平與假手術(shù)組均無(wú)差別(P＞ 0.05)。慢疼+優(yōu)裕胎教組子鼠NE和皮質(zhì)醇水平在出生當(dāng)日均低于慢疼組(P＜ 0.05)，從出生后第3周開(kāi)始至第9周與慢疼組相比均無(wú)差別(P＞ 0.05)。

討 論

疼痛的產(chǎn)生與傳導(dǎo)過(guò)程中機(jī)體會(huì)分泌多種可以傳遞傷害性感受的物質(zhì)，NE[10]和皮質(zhì)醇[11]是其中較為公認(rèn)的遞質(zhì)，在機(jī)體疼痛過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期抑郁的孕婦產(chǎn)前NE和皮質(zhì)醇水平高于正常對(duì)照組，她們的孩子（出生當(dāng)日測(cè)）相應(yīng)遞質(zhì)檢測(cè)結(jié)果與母親一致，且這些孩子都有較差的定向力、活動(dòng)力、自律性和較高的抑郁評(píng)分[12]。而且，有證據(jù)表明，早產(chǎn)、低出生體重與NE和皮質(zhì)醇分泌增多有關(guān)[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢疼組子鼠存在出生體重較輕、尾長(zhǎng)較短、運(yùn)動(dòng)能力較差等現(xiàn)象。且慢疼組母鼠外周血中皮質(zhì)醇和NE水平高于假手術(shù)組，該組子鼠在出生后早期相應(yīng)遞質(zhì)檢測(cè)結(jié)果與母體一致。其機(jī)制可能是因?yàn)樵衅诼蕴弁磻?yīng)激過(guò)強(qiáng)激活了胎盤(pán)和母體垂體-腎上腺素軸，使母鼠血漿內(nèi)和胎盤(pán)中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素 (corticotrophin releasing hormone,CRH) 水平升高、皮質(zhì)醇、NE分泌增多，導(dǎo)致母鼠全身小動(dòng)脈痙攣、血管阻力增大，從而影響胎鼠氧的供應(yīng)，給胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響，而出生的子鼠也可能因?yàn)殚L(zhǎng)期宮內(nèi)血供不足而出現(xiàn)生理發(fā)育遲緩，與對(duì)照組母鼠娩出子鼠相比出現(xiàn)顯著差異[15]。

表1 各組新生鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況比較()Table 1 Comparison of the growth and development of newborn mice among groups ()

表1 各組新生鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況比較()Table 1 Comparison of the growth and development of newborn mice among groups ()

*P ＜ 0.05，與假手術(shù)對(duì)照組相比；#P ＜ 0.05，與慢疼組相比*P ＜ 0.05, compared with the group Sham; #P ＜ 0.05, compared with group CP.

畸形率Deformity rate (%)正常對(duì)照組 Normal 1.7±0.1 3.3±0.2 1.1±0.2 0假手術(shù)對(duì)照組 Sham 1.7±0.1 3.3±0.1 1.1±0.2 0慢疼組 CP 1.3±0.1* 3.2±0.1 1.0±0.1* 4.9*慢疼+優(yōu)裕胎教組 CP + EEI 1.5±0.2# 3.3±0.2 1.1±0.2# 0#組別Groups出生體重Birth weight (g)身長(zhǎng)Body length (cm)尾長(zhǎng)Tail length (cm)

圖1 各組孕鼠在不同時(shí)間點(diǎn)NE和皮質(zhì)醇水平的比較 ()Fig.1 Comparison of NE and Cortisol level of pregnant mice in each group at different time points ()

圖2 各組子鼠在不同時(shí)間點(diǎn)NE和皮質(zhì)醇水平的比較()Fig.2 Comparison of NE and Cortisol level of offspring mice in each group at different time points ()

綜合性優(yōu)裕生活環(huán)境干預(yù)方案已被多項(xiàng)研究證實(shí)對(duì)嚙齒類動(dòng)物的生理、心理健康有顯著改善作用[16]。如接受優(yōu)裕環(huán)境干預(yù)方案的大鼠炎性痛恢復(fù)速度顯著加快，其痛覺(jué)超敏現(xiàn)象亦顯著減少[17]。慢性疼痛小鼠負(fù)性情緒和運(yùn)動(dòng)障礙也可經(jīng)優(yōu)裕環(huán)境干預(yù)后而顯著改善[18]。本研究中慢性疼痛狀態(tài)下的孕鼠，經(jīng)過(guò)優(yōu)裕胎教方案干預(yù)后，其子鼠體重、尾長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力等方面均得到顯著改善。與慢疼組相比，干預(yù)組孕鼠和子鼠外周血內(nèi)NE、皮質(zhì)醇水平顯著降低。這說(shuō)明優(yōu)裕胎教能夠有效改善慢性疼痛引發(fā)的不利影響。其機(jī)制可能是通過(guò)營(yíng)造良好的環(huán)境氛圍、提供合理營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的飲食、音樂(lè)療法等，有效改善母體的不良情緒，調(diào)整其體內(nèi)NE、皮質(zhì)醇等遞質(zhì)水平，從而改善了孕鼠健康狀況，進(jìn)而改善了子代生長(zhǎng)發(fā)育情況。同時(shí)我們也注意到：慢疼組母鼠NE和皮質(zhì)醇水平在孕12天至分娩當(dāng)日均高于慢疼+優(yōu)裕胎教組，但產(chǎn)后第6天與慢疼+優(yōu)裕胎教組相比無(wú)差別。其原因可能是因?yàn)樵惺蟮腘E、皮質(zhì)醇水平不僅受慢性疼痛影響，還可能受雌、孕激素水平的作用。產(chǎn)后雌、孕激素的急劇下降，使母鼠機(jī)體對(duì)疼痛的敏感度比孕前降低，因此慢疼組和干預(yù)組之間遞質(zhì)水平的差異不再顯著。但優(yōu)裕環(huán)境干預(yù)方案在鼠類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果如何推廣到人類，還有待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，妊娠期慢性疼痛會(huì)導(dǎo)致母鼠體內(nèi)NE、皮質(zhì)醇等遞質(zhì)水平產(chǎn)生變化，且伴有母鼠子代出現(xiàn)體重較輕、尾長(zhǎng)較短、發(fā)育畸形等現(xiàn)象，優(yōu)裕胎教方案對(duì)上述指標(biāo)有顯著改善作用。本項(xiàng)目的完成揭示了妊娠期慢性疼痛對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育的不利影響，探討了可能的機(jī)制并提供了干預(yù)策略，為臨床患有慢性疼痛的孕婦的無(wú)創(chuàng)、非藥物性干預(yù)提供了實(shí)踐依據(jù)，為改善分娩結(jié)局，提高出生人口素質(zhì)，促進(jìn)母嬰健康提供了有力支持。