侵染廣東連州葫蘆的黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子特征及致病性分析

李正剛，農(nóng)媛，湯亞飛，佘小漫，于琳，藍(lán)國(guó)兵，鄧銘光，何自福

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640）

0 引言

【研究意義】黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）隸屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）[1]，該屬病毒的特點(diǎn)是極易通過(guò)機(jī)械摩擦進(jìn)行傳播。CGMMV可以侵染黃瓜、葫蘆、甜瓜、西瓜等葫蘆科作物，造成植株生長(zhǎng)遲緩、葉片褪綠斑駁、果實(shí)變色和纖維化，導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p失[2-5]。CGMMV是典型的種傳病毒[6-7]，是我國(guó)植物檢疫性有害生物[4]。因此，對(duì)CGMMV進(jìn)行監(jiān)測(cè)及鑒定，有利于對(duì)該病毒進(jìn)行預(yù)防，減輕該病毒造成的危害，對(duì)葫蘆科作物的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CGMMV是正義單鏈RNA病毒，全長(zhǎng)約6 400 nt，編碼4個(gè)蛋白，分別為129 kD的復(fù)制酶、186 kD的復(fù)制相關(guān)蛋白、29 kD運(yùn)動(dòng)蛋白和17.4 kD的外殼蛋白[8]。CGMMV最早是在英格蘭發(fā)現(xiàn)的[9]，隨后在全世界范圍內(nèi)陸續(xù)被報(bào)道[10-16]。CGMMV在世界范圍的傳播可以分為3個(gè)時(shí)期[17]：1935—1985年，該時(shí)期CGMMV在全球的傳播速度較慢，僅局限在歐洲、中東、南亞和東亞少數(shù)幾個(gè)國(guó)家以及中國(guó)臺(tái)灣等地區(qū)[17-20]；1986—2006年，該時(shí)期CGMMV在全球傳播的速度有所加快，已傳播至歐洲大部分國(guó)家[17]，在亞洲包括南亞的巴基斯坦，東亞的中國(guó)和韓國(guó)，東南亞的印度尼西亞和泰國(guó)，中東地區(qū)的以色列、沙特阿拉伯和敘利亞[11,17,21-27]；2007—2016年，該時(shí)期CGMMV傳播速度更加迅速，傳播至更多的國(guó)家和地區(qū)[17]，加拿大、美國(guó)、尼日利亞、澳大利亞這些國(guó)家也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了CGMMV[17,28-30]。中國(guó)大陸于2005年在廣西南瓜上最早報(bào)道CGMMV，目前已經(jīng)在山東、河北、湖北、云南、廣東、遼寧等多地普遍發(fā)生[3,22,31-33]，并對(duì)多地的瓜類作物造成了毀滅性的損失[2,4]。【本研究切入點(diǎn)】CGMMV廣東分離物雖然已經(jīng)報(bào)道[32]，但是只包含了運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白的部分序列，不是全長(zhǎng)序列，而且沒(méi)有對(duì)其侵染性進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆侵染葫蘆的CGMMV廣東分離物基因組全長(zhǎng)，構(gòu)建其全長(zhǎng)侵染性克隆，并測(cè)定其對(duì)3種重要葫蘆科植物（黃瓜、葫蘆和西瓜）的致病性，為該病毒的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年9月至2019年7月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 樣本來(lái)源

2018年9月在廣東省連州市葫蘆產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)有植株疑似感染CGMMV，采集2個(gè)有癥狀病樣以及1個(gè)無(wú)癥狀樣品后帶回實(shí)驗(yàn)室，并置于-80℃超低溫冰箱凍存。

1.2 RNA提取

采用TRIzol方法提取樣品總RNA，TRIzol購(gòu)自TaKaRa公司，提取好的RNA樣品凍存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 RT-PCR反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。CGMMV檢測(cè)引物參考CGMMV序列（GenBank登錄號(hào)：KX883801）設(shè)計(jì)，引物序列為F：CCACGAGTTGTTTCCTAAT GCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT，擴(kuò)增長(zhǎng)度為890 bp，退火溫度為53℃。

1.4 CGMMV-GDLZ分離物全長(zhǎng)序列擴(kuò)增

將CGMMV全長(zhǎng)序列分為兩段，前半段1—3 511 nt，后半段3 301—6 423 nt，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增。前半段擴(kuò)增引物為F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAG GGTTTTAATTTTTATAATTAAACAAA （下劃線序列為同源重組序列）/R：AGTTCTGCATTAATTGCTA TTTGGTAGGCACAGTGGTAG；后半段擴(kuò)增引物為F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGAT TGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCC T GGGCCCCTACCCGGGGAAAGG（下劃線序列為同源重組序列）。將擴(kuò)增好的前半段和后半段序列通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建到pCB301載體上[34]。將構(gòu)建好的pCB301-CGMMV質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序所得CGMMV全長(zhǎng)序列在NCBI中進(jìn)行Blast分析。利用MEGA7軟件[35]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 CGMMV-GDLZ侵染性克隆構(gòu)建及農(nóng)桿菌注射接種

將約為0.5 μg的pCB301-CGMMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)入100 μL GV3101（pSoup）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司），菌落PCR驗(yàn)證。將含有pCB301-CGMMV質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含有卡那霉素（100 μg·mL-1）和利福平（25 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基內(nèi)，28℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，4 000 r/min離心10 min收集沉淀，棄上清，沉淀用農(nóng)桿菌懸浮緩沖液（10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，150 μmol·L-1As）重懸，利用紫外分光光度計(jì)將菌液OD600調(diào)至1.0。28℃培養(yǎng)箱靜置4 h，用注射器注射植物。

1.7 Western blot檢測(cè)

采集0.5 g發(fā)病及健康對(duì)照樣品于2 mL離心管中，液氮速凍，通過(guò)組織研磨機(jī)充分破碎，趁冷加入0.3 mL蛋白提取緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，2% SDS，2.5%巰基乙醇），充分振蕩混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。Western blot一抗為CGMMV CP多克隆抗體，羊抗兔二抗購(gòu)自于Sigma Aldrich。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集及檢測(cè)

2018年9月在廣東省連州市一個(gè)葫蘆種植區(qū)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分葫蘆植株葉片呈現(xiàn)明顯的褪綠、花葉、斑駁等癥狀（圖1-A），疑似感染CGMMV。采集了2株發(fā)病植株及1株無(wú)癥狀植株，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，2個(gè)發(fā)病樣品均可檢測(cè)到大小為900 bp左右的特異條帶（圖1-B），無(wú)癥狀CK樣品則沒(méi)有條帶，說(shuō)明2個(gè)發(fā)病樣品確實(shí)感染了CGMMV。

圖1 疑似感染CGMMV的葫蘆植株田間發(fā)病癥狀以及RT-PCR檢測(cè)Fig.1 Symptoms of bottle gourd infected by CGMMV and RT-PCR detection of CGMMV

2.2 CGMMV-GDLZ基因組全長(zhǎng)序列及其系統(tǒng)進(jìn)化

為了得到CGMMV廣東連州分離物（CGMMVGDLZ）基因組的全長(zhǎng)序列，將CGMMV全長(zhǎng)分為兩段擴(kuò)增，PCR結(jié)果顯示，從毒源病樣中成功擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的條帶（未展示數(shù)據(jù)），將膠回收的片段與pCB301載體[34]進(jìn)行重組反應(yīng)，得到CGMMVGDLZ分離物基因組全長(zhǎng)序列，同時(shí)也構(gòu)建了其侵染性克隆pCB301-CGMMV。CGMMV-GDLZ分離物全長(zhǎng)為6 423 nt（GenBank登錄號(hào)：MK933286），編碼4個(gè)蛋白，分別為129K復(fù)制酶（61—3 495 nt）、186K復(fù)制相關(guān)蛋白（61—5 007 nt）、運(yùn)動(dòng)蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外殼蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ分離物與CGMMV-eWT分離物（GenBank登錄號(hào)：KY753928）核苷酸同源性最高，為99.97%，僅有第31位和4 143位核苷酸不同，而其編碼的所有蛋白的同源性則為100%。

為了分析比較CGMMV-GDLZ分離物與其他分離物之間的關(guān)系，利用MEGA7軟件[35]構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。選取不同地點(diǎn)（中國(guó)大陸、中國(guó)臺(tái)灣、日本、韓國(guó)、加拿大、以色列、西班牙、俄羅斯）、不同作物（黃瓜、葫蘆、西瓜）上的CGMMV分離物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。結(jié)果顯示CGMMV分離物根據(jù)地點(diǎn)分成了3個(gè)組：中國(guó)大陸、中國(guó)臺(tái)灣、韓國(guó)和日本等亞洲國(guó)家和地區(qū)的CGMMV分離物為第1組；以色列和加拿大CGMMV分離物為第2組；西班牙和俄羅斯CGMMV分離物為第3組。CGMMV-GDLZ分離物與山東黃瓜CGMMV-SD分離物（KJ754195）、河南西瓜CGMMV-hn分離物（KC851866）、浙江香瓜CGMMV-JD8分離物（KM873784）、浙江西瓜CGMMV-DY9分離物（KM873786）距離最近（圖2）。

2.3 CGMMV-GDLZ分離物侵染性克隆接種驗(yàn)證

為了驗(yàn)證侵染性克隆pCB301-CGMMV的侵染性，首先利用農(nóng)桿菌注射的方法接種了本生煙，結(jié)果顯示第7天時(shí)，與Mock植株相比，接種的本生煙上部葉片開(kāi)始出現(xiàn)明顯的泡狀凸起，隨著時(shí)間的發(fā)展，癥狀愈加明顯（圖3-A）。采集發(fā)病葉片進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示發(fā)病樣品可以檢測(cè)到CGMMV特異條帶，Mock樣品沒(méi)有檢測(cè)到（圖3-B）。進(jìn)一步利用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示發(fā)病樣品可以檢測(cè)到CGMMV CP條帶，而Mock沒(méi)有檢測(cè)到（圖3-C）。說(shuō)明侵染性克隆pCB301-CGMMV具有侵染性。

圖2 基于CGMMV全長(zhǎng)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on full-length sequence of CGMMV

圖3 利用pCB301-CGMMV侵染性克隆接種本生煙Fig.3 Ago-infiltration into N.benthamiana with pCB301-CGMMV infectious cDNA clones

2.4 CGMMV-GDLZ分離物的致病性

利用含有CGMMV-GDLZ侵染性克?。╬CB301-CGMMV）的農(nóng)桿菌注射接種黃瓜、葫蘆和西瓜的子葉，15 dpi時(shí)，葫蘆和西瓜上部葉片出現(xiàn)明顯的斑駁、花葉、突起，植株生長(zhǎng)遲緩，24 dpi時(shí)癥狀更明顯；而15 dpi時(shí)，CGMMV-GDLZ分離物在黃瓜上的癥狀不明顯，與未接種對(duì)照植株幾乎沒(méi)有區(qū)別；將植株從控溫接種室移入網(wǎng)室中，30 dpi，黃瓜植株上部葉片開(kāi)始出現(xiàn)斑駁和花葉，40 dpi時(shí)，癥狀已經(jīng)非常明顯（圖4-A）。RT-PCR和Western blot結(jié)果驗(yàn)證了CGMMV的成功侵染（圖4-B、4-C）。這些結(jié)果說(shuō)明，CGMMVGDLZ分離物可以侵染黃瓜、葫蘆、西瓜等瓜類作物，顯癥時(shí)間有所差異。

3 討論

中國(guó)是世界上瓜類種植面積最大的國(guó)家，而CGMMV則是危害瓜類作物生產(chǎn)的主要病原菌之一，給我國(guó)的瓜類產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。CGMMV屬于煙草花葉病毒屬[1]，該屬病毒可以通過(guò)汁液、花粉、農(nóng)事操作以及嫁接的方式傳播，因此CGMMV在田間非常容易擴(kuò)散。CGMMV還是典型的種傳病毒[6-7]，種子帶毒也是CGMMV長(zhǎng)距離傳播的主要方式。

早在2002年和2004年，中國(guó)口岸檢疫部門就已在從日本進(jìn)口的瓜類種苗或種子中檢測(cè)到了CGMMV[36]；2005年，秦碧霞等報(bào)道在廣西觀賞南瓜上檢測(cè)到了CGMMV，該南瓜品種是從歐洲、印度、日本等國(guó)引種后選育出的[22]；2007年，研究人員在從日本引進(jìn)的西瓜中檢測(cè)到了CGMMV[37]。對(duì)不同國(guó)家和地區(qū)的CGMMV分離物進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示亞洲的中國(guó)、日本、韓國(guó)被分到了一組，加拿大和以色列分到了一組，西班牙和俄羅斯等歐洲國(guó)家被分到了一組，其中中國(guó)與日本的CGMMV分離物在遺傳距離上更為接近。這些結(jié)果均表明中國(guó)大陸的CGMMV很有可能是從日本傳播擴(kuò)散而來(lái)。CGMMV-GDLZ分離物在遺傳距離上與山東、河南、浙江等地的分離物最接近，說(shuō)明廣東、山東、河南和浙江的CGMMV分離物可能來(lái)自相同的傳染源。

圖4 CGMMV-GDLZ分離物在黃瓜、葫蘆和西瓜上的致病性Fig.4 Pathogenicity of CGMMV-GDLZ isolate on cucumber, bottle gourd, and watermelon

接種后15 d，CGMMV-GDLZ在葫蘆以及西瓜上的癥狀已經(jīng)非常明顯，而在黃瓜上的癥狀卻不明顯；將黃瓜植株由溫度恒定的控溫室移入變溫的開(kāi)放網(wǎng)室，30 dpi時(shí)黃瓜植株開(kāi)始出現(xiàn)典型的斑駁和花葉，說(shuō)明CGMMV-GDLZ在不同作物上的發(fā)病時(shí)間及發(fā)病溫度有所差異，這些差異可能與不同的作物和品種有關(guān)。不同的作物和品種對(duì)同種病毒的抗性有很大的區(qū)別，包含抗性基因的作物和品種表現(xiàn)出抗病，反之則表現(xiàn)出感??；另外溫度對(duì)植物的抗性水平也起著重要的調(diào)控作用，在不同的溫度下植物表現(xiàn)出不同的抗性水平，比如包含Rychc抗性基因的馬鈴薯在不同的溫度下對(duì)馬鈴薯Y病毒（Potaoto Y virus，PVY）表現(xiàn)出不同的抗性水平，在22℃下馬鈴薯表現(xiàn)出極端抗性（extreme resistance，ER）水平，只在接種葉上有少量小的壞死斑，上部葉片沒(méi)有任何癥狀，而當(dāng)溫度升至28℃時(shí)，接種葉上出現(xiàn)了明顯的壞死斑，上部葉片也開(kāi)始有少量發(fā)病，另外研究人員還發(fā)現(xiàn)包含有Rychc抗性基因的馬鈴薯栽培品種在夏天比春天更容易出現(xiàn)壞死斑[38]。再如小麥品種Adl-cross在25℃以下對(duì)小麥條紋花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）表現(xiàn)為抗病，而在32℃時(shí)則不抗病[39]。這些結(jié)果都表明高溫可能會(huì)降低抗性基因賦予的抗性，使植物在高溫下更容易感病。黃瓜以及其他瓜類對(duì)CGMMV有沒(méi)有抗性基因、抗性基因是否受到溫度調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

侵染廣東省連州市葫蘆的CGMMV-GDLZ分離物全長(zhǎng)6 423 nt，與CGMMV-eWT分離物同源性最高，在遺傳距離上與山東、浙江和河南的CGMMV分離物最接近，很可能具有相同的傳染源。CGMMV-GDLZ分離物可以侵染黃瓜、葫蘆和西瓜等作物，但在不同作物上顯癥時(shí)間存在差異。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王穎副教授惠贈(zèng)CGMMV CP多克隆抗體；感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院陶小榮教授惠贈(zèng)pCB301載體。