香菇栽培菌株區(qū)別性鑒定及其比較試驗(yàn)

胡曉強(qiáng) 趙光輝 馬瑋超 李 峰

（1河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建福州350018）

我國(guó)是世界上最早認(rèn)識(shí)和利用食用菌的國(guó)家。早在公元前240年就有關(guān)于食用食用菌的記載，公元600年開始食用菌的野生馴化和人工栽培，公元14世紀(jì)，香菇人工栽培技術(shù)研究成功[1]。菌種是香菇生產(chǎn)最重要的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料，對(duì)香菇產(chǎn)量及質(zhì)量具有決定性影響。香菇生產(chǎn)中引種頻繁，且隨意冠名，出現(xiàn)了同名異物和同物異名的現(xiàn)象。筆者對(duì)來(lái)自不同香菇栽培基地的香菇菌株進(jìn)行區(qū)別性鑒定，并進(jìn)行栽培對(duì)比試驗(yàn)，以期獲得適合當(dāng)?shù)卦耘嗟南愎骄辍?/p>

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從5個(gè)香菇栽培基地分離得到了8個(gè)香菇菌株，通過(guò)體細(xì)胞不親和性鑒定，剔除彼此間不產(chǎn)生拮抗的菌株，初步獲得5個(gè)差異性菌株，用于進(jìn)一步開展ISSR區(qū)別性鑒定（表1）。

表1 供試香菇菌株及來(lái)源

1.2 引物及ISSR-PCR反應(yīng)體系[2-4]

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

反應(yīng)體系為 20 μL，其中含有 1×PCR Buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.6 μmol/L引物，200 μmol/L dNTP，模板DNA 50 ng，0.06 U/μL Taq酶。

ISSR-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸7 min，停止反應(yīng)。4℃保存反應(yīng)液備用。

表2 ISSR引物及其序列

1.3 栽培方法

栽培料配方：雜木屑79%，麩皮20%，石膏1%。料含水量55%～58%，pH自然。

栽培袋選用15 cm×55 cm×0.005 cm的聚乙烯塑料袋，培養(yǎng)料現(xiàn)拌現(xiàn)裝；培養(yǎng)料采用常壓滅菌，溫度達(dá)100℃后保持14 h。出鍋冷卻后在接種室常規(guī)方法接種，每袋接種4穴；發(fā)菌期控制發(fā)菌溫度25℃以下，菌絲長(zhǎng)滿袋后，加強(qiáng)通風(fēng)降溫促進(jìn)菌棒轉(zhuǎn)色，轉(zhuǎn)色完成后，通過(guò)噴水及加強(qiáng)通風(fēng)控溫不超過(guò)30℃，之后進(jìn)入越夏管理[5]。

1.4 考察內(nèi)容及方法

每個(gè)菌株接種24 h后開始觀察菌絲萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度，記錄菌絲滿袋時(shí)間[6]。出菇試驗(yàn)采用層架出菇方法，設(shè)置三組重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50棒。常規(guī)出菇管理，按照鮮銷采收標(biāo)準(zhǔn)，子實(shí)體七八分熟時(shí)采收并記錄產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)香菇菌株的ISSR標(biāo)記分析

6條引物分別對(duì)5個(gè)菌株的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，各引物擴(kuò)增的片段數(shù)為3～9條，分子量為0.15～1.9 kb，表現(xiàn)出供試菌株的擴(kuò)增差異性，圖1、2分別為引物822、引物855的擴(kuò)增圖譜。

圖1 引物822PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物855PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 香菇菌株的聚類分析

利用NTSYS軟件對(duì)5個(gè)香菇菌株的相似性進(jìn)行（UPMGA）聚類分析，得到5個(gè)菌株的遺傳距離樹狀圖（圖3）。由圖3可以看出，供試的5個(gè)香菇菌株遺傳距離在0.25～0.57，其中菌株L2與供試的其余4個(gè)菌株遺傳距離最大，為0.57；菌株L3與L4遺傳差異最小，遺傳距離為0.25；5個(gè)供試菌株遺傳距離較大，具有明顯的遺傳差異。

圖3 5個(gè)香菇菌株ISSR遺傳距離樹狀圖

2.3 供試香菇菌株菌絲生長(zhǎng)情況

由表3可見(jiàn)，5個(gè)供試香菇菌株接種后48 h內(nèi)均開始萌發(fā)，菌絲滿袋時(shí)間為37～40 d。香菇菌株L4菌絲體平均長(zhǎng)速最快，為0.34 cm/d，滿袋時(shí)間為37 d；香菇菌株L2和L3菌絲平均長(zhǎng)速最慢，均為0.31 cm/d，滿袋時(shí)間為40 d。供試的5個(gè)香菇菌株菌絲形態(tài)均表現(xiàn)為菌絲粗壯、濃白，僅在菌絲平均長(zhǎng)速上存在差異。

表3 供試香菇菌株菌絲生長(zhǎng)比較

2.4 供試香菇菌株產(chǎn)量

5個(gè)供試香菇菌株產(chǎn)量見(jiàn)表4。菌株L4單棒平均產(chǎn)量最高，為1013 g/棒，生物學(xué)效率為75.04%，顯著高于其他4個(gè)菌株；其次為菌株L5，單棒平均產(chǎn)量為999 g/棒，生物學(xué)效率為74.00%；菌株L1、L3生物學(xué)效率分別為63.56%、64.67%，產(chǎn)量較低。生物學(xué)效率排序：L4＞L5＞L2＞L3＞L1。方差分析結(jié)果顯示，5個(gè)供試香菇菌株產(chǎn)量之間差異顯著。

表4 供試香菇菌株產(chǎn)量比較

表5 供試香菇菌株子實(shí)體性狀比較

2.5 供試香菇菌株子實(shí)體主要農(nóng)藝性狀

5個(gè)供試香菇菌株子實(shí)體主要農(nóng)藝性狀見(jiàn)表5，出菇狀態(tài)見(jiàn)圖4。香菇菌株L1、L4鮮菇單朵較大，菌蓋直徑為5.8 cm，菌株L1單朵較重，為18.4 g。菌株L2朵形最小。

圖4 5個(gè)供試香菇菌株出菇狀態(tài)

3 小結(jié)與討論

食用菌菌種質(zhì)量直接關(guān)系到食用菌產(chǎn)業(yè)能否良性發(fā)展，單純依靠食用菌子實(shí)體形態(tài)特征有時(shí)難以有效區(qū)分菌株之間的差異，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)，可以更加準(zhǔn)確、科學(xué)地對(duì)食用菌菌種進(jìn)行鑒定及檢測(cè)[8]。簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）DNA標(biāo)記技術(shù)是根據(jù)真核生物中廣泛存在簡(jiǎn)單重復(fù)序列的特點(diǎn)，利用在真核生物基因組中常出現(xiàn)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列本身設(shè)計(jì)引物，通常為顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)柺竭z傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，已廣泛應(yīng)用于食用菌遺傳多樣性分析和雜交育種方面的研究[8-10]。

針對(duì)示范基地存在的菌種混亂現(xiàn)象，采用體細(xì)胞不親和性鑒定方法，可以初步鑒定出菌株的異同，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠更進(jìn)一步清晰地鑒定出同物異名及同名異物菌株，并能夠量化出各個(gè)菌株之間的遺傳差異，是食用菌菌株遺傳分析及科學(xué)鑒定的有效工具。試驗(yàn)對(duì)來(lái)自河南省新鄉(xiāng)市5個(gè)示范基地的8個(gè)香菇菌株，最終鑒定出5個(gè)為特異菌株，說(shuō)明存在同物異名現(xiàn)象。

5個(gè)香菇菌株越夏栽培結(jié)果表明，其產(chǎn)量及主要農(nóng)藝性狀存在差異。其中菌株L4菌絲生長(zhǎng)速度快，商品性狀優(yōu)，產(chǎn)量高，可作為當(dāng)?shù)卮杭驹耘嘞愎絻?yōu)選品種；菌株L2出菇較快，但子實(shí)體菇形小，菌肉較薄、柄長(zhǎng)，總體商品性狀較差。