MCUR1表達對卵巢癌細胞生長的影響及作用機制

白翔宇曹珊珊楊世榮高天陳艷琴鮑登克

作者單位：475004開封 1河南大學(xué)藥學(xué)院；710032西安 2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院普外科；3空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科；716000延安 4延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院

卵巢癌是女性發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，全世界范圍內(nèi)每年新發(fā)病例近239 000例，而相關(guān)死亡病例152 000例［1-2］。卵巢癌臨床癥狀隱匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，侵襲性強，但臨床上尚缺乏特異性的診斷方法，70%以上的患者確診時已為晚期［3］，5年生存率低于30%［4-5］。因此亟待開發(fā)可用于卵巢癌診斷及治療的靶點。

線粒體作為“能量工廠”為細胞提供能量，Ca2+作為細胞內(nèi)第二信使在細胞內(nèi)傳遞信號，兩者都在細胞生命活動中扮演重要的角色。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)因子1（mitochondrial calcium uniporter regulator 1，MCUR1）是細胞內(nèi)的鈣調(diào)節(jié)分子，在調(diào)控線粒體鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［6-7］。而線粒體鈣穩(wěn)態(tài)可決定細胞氧化呼吸功能進程、細胞生死、活性氧生成、線粒體ATP生成、細胞質(zhì)內(nèi)的鈣信號及胞漿鈣環(huán)境維持等，目前研究發(fā)現(xiàn)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)異常與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，且MCUR1在其中起重要作用［8-9］。本研究首先利用TCGA（the Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫分析卵巢癌組織中MCUR1的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系，然后進一步收集組織標(biāo)本及在細胞水平和動物實驗中觀察MCUR1對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響，并初步探討MCUR1發(fā)揮作用的分子機制，以期為卵巢癌診斷和治療尋找的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫 在TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選卵巢癌患者數(shù)據(jù)集，采用R語言（3.1.1版本）軟件進行統(tǒng)計分析。共下載372例卵巢癌患者數(shù)據(jù)，年齡為30～87歲，均有總生存期（overall survival，OS）和RNA seq數(shù)據(jù)，OS定義為診斷日期至死亡或者失訪的時間。

1.1.2 組織樣本來源 納入43例卵巢癌組織石蠟切片，均購自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科，組織樣本于2017年2月至2019年2月由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院收集，所有患者具有完整臨床資料并簽署知情同意書，本研究已通過空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 細胞株與裸鼠 人卵巢癌細胞系A(chǔ)2780購自武漢普諾賽公司；4～6周雌性BALB/c-nu裸鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于無菌條件下，12 h明暗周期，水和食物充足。動物實驗按照空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)的規(guī)程進行。

1.2 主要試劑

新生胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；LipofectamineTM2000、引物購自Invitrogen公司；MCUR1干擾片段和過表達質(zhì)粒購自上海吉瑪公司；real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色液購自福州邁新試劑公司；MCUR1抗體購自Sigma-Aldrich公司；p53抗體購自Cell Signaling Technology公司；Caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl2抗體、Cyclin D1抗體、Cyclin E抗體購自Abcam公司；β-actin抗體購自北京天德悅公司；MTS試劑盒購自Promega公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測卵巢癌組織中蛋白的表達水平

免疫組化染色采用SP法，即脫蠟水化、抗原修復(fù)、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉，滴加對應(yīng)一抗過夜，第2天滴加生物素標(biāo)記的二抗、鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶三抗孵育，用新鮮配置的DAB工作液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，鏡下觀察。結(jié)果判讀采用IRS表示，IRS為每個樣本中的染色強度值（0分：無染色；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：強染色）和陽性細胞百分比值（0分：＜10%；1分：10%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%）的乘積，IRS＞3為陽性，IRS≤3為陰性。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

A2780細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，取適量對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板，24 h后細胞培養(yǎng)板覆蓋率為70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑采用LipofectamineTM2000，用瞬時轉(zhuǎn)染法分別將MCUR1干擾片段及過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細胞，標(biāo)記為siMCUR1組和MCUR1組，并分別設(shè)置相應(yīng)的陰性對照，標(biāo)記為siCtrl組和EV組。

1.5 qRT-PCR實驗檢測卵巢癌細胞中MCUR1 mRNA的表達情況

按總RNA提取試劑盒操作方法提取瞬時轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞總mRNA，OneDrop檢測RNA純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qRT-PCR實驗。MCUR1上游引物：5'-AACTCTACTTCGACACTCATGCCTTAG-3'，下游引物：5'-GCCTCCAGGATCTTGACCAATGC-3'；GAPDH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件設(shè)置為95℃30 s；95℃5 s、55℃30 s、72℃30 s，40個循環(huán)；72℃1 min。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量，實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot實驗檢測卵巢癌細胞中增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

收集轉(zhuǎn)染48 h后的A2780細胞，PBS洗滌3遍，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min，4℃12 000 r/min離心30 min，收集上清液。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min使其變性。按每孔40μg上樣，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加一抗4℃孵育過夜。用1×TBST洗膜3次，每次5 min。加二抗室溫孵育1 h。用1×TBST洗膜3次，每次5 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影分析。

1.7 MTS法檢測干預(yù)MCUR1后卵巢癌細胞的生長情況

取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為100μL/孔，加入96孔板，2×103/孔；5% CO2、37℃孵育24 h，顯微鏡觀察；每孔加入20μL MTS溶液（5 mg/mL），培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測細胞吸光度值。每組采用5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.8 克隆形成實驗檢測干預(yù)MCUR1后卵巢癌細胞的增殖能力

取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化收集細胞，將細胞懸液梯度稀釋接種于6孔板，1 000/孔，置于培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3周，中間更換2次培養(yǎng)基，當(dāng)板中出現(xiàn)細胞克隆團時，棄去上清，PBS洗滌，用4%多聚甲醛于室溫下固定細胞30 min。棄去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染色10 min，將平板克隆進行拍照，計數(shù)克隆細胞數(shù)。

1.9 裸鼠皮下成瘤實驗

將裸鼠按接種細胞隨機分為4組，分別標(biāo)記為siMCUR1組、siCtrl組、MCUR1組和EV組，打上耳標(biāo)，每組7只，觀察2 d若狀況均良好，即接種細胞。取對數(shù)生長期細胞，2.5%胰酶消化后，加PBS制備成細胞懸液，細胞密度為1×107/mL。于裸鼠右側(cè)肩胛下部皮下注射200μL細胞懸液，形成隆起皮丘后拔出注射器，再次消毒局部皮膚。1周后開始觀察皮下腫瘤形成情況，并用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積，每隔2 d測量1次。5周后處死裸鼠，取出瘤體并稱重。腫瘤組織切至黃豆大小，用福爾馬林常規(guī)固定，脫水，至透明，石蠟包埋，制成0.3μm切片。

1.10 組織TUNEL實驗檢測細胞凋亡情況

石蠟切片脫蠟水化后，加蛋白酶K孵育20 min，1×PBS洗滌3遍；加TUNEL反應(yīng)液，37℃避光孵育1 h，1×PBS洗滌3遍；DAPI染色，封片，熒光顯微鏡拍照。將DAPI和TUNEL均呈陽性的細胞記為凋亡細胞，每塊組織于40倍目鏡下拍攝5個視野，統(tǒng)計細胞陽性率。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 7.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示。對TCGA數(shù)據(jù)進行分析，采用Kaplan-Meier法計算生存率，根據(jù)MCUR1 mRMA表達量的中位數(shù)將患者分為低表達組和高表達組，兩組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCUR1在卵巢癌組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)MCUR1 mRNA表達水平中位數(shù)（9.95）進行分組，低于中位數(shù)的樣本為低表達組，共203例；高于中位數(shù)的樣本為高表達組，共169例。對372例卵巢癌患者進行Kaplan-Meier生存分析，MCUR1高表達組中位生存期為53.7個月，低表達組中位生存期為41.3個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），見圖1A；43例卵巢癌標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)法染色，MCUR1陽性率為25.6%（11/43），見圖1B。

圖1 MCUR1在卵巢癌組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Expression of MCUR1 in ovarian cancer tissues and its relationship with prognosis

2.2 MCUR1的轉(zhuǎn)染效果

在卵巢癌A2780細胞中，與siCtrl組相比，siMCUR1組細胞中MCUR1的mRNA和蛋白表達量均顯著下降（P＜0.01）；MCUR1組細胞中MCUR1的mRNA和蛋白表達量均較EV組顯著升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 MCUR1在卵巢癌細胞系中的表達Fig.2 Expression of MCUR1 in ovarian cancer cell lines

2.3 MCUR1對卵巢癌細胞生長的影響

MTS實驗檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染96 h后，siCtrl組和siMCUR1組相對應(yīng)的OD值分別1.14±0.02和2.47±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）；MCUR1組和EV組OD值分別為1.06±0.05和1.61±0.04，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032），見圖3A；克隆形成實驗檢測結(jié)果顯示，siCtrl組和siMCUR1組細胞克隆形成數(shù)分別為（113±27）個和（245±31）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006）；MCUR1組和EV組細胞克隆形成數(shù)分別為（46±11）個和（107±23）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004），見圖3B。

圖3 MCUR1對卵巢癌細胞增殖的影響Fig.3 Effect of MCUR1 on the proliferation of ovarian cancer cells

2.4 MCUR1對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

裸鼠皮下移植腫瘤模型實驗結(jié)果顯示，接種31 d后，siMCUR1組和siCtrl組的腫瘤體積分別為（1 450±37）mm3和（347±51）mm3，腫瘤重量分別為（1.37±0.21）g和（0.42±0.13）g，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006，P=0.004），見圖4A。MCUR1組和EV組的腫瘤體積分別為（271±53）mm3和（1 230±90）mm3，腫瘤重量分別為（0.29±0.15）g和（1.18±0.17）g，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005，P=0.004），見圖4B。

裸鼠皮下移植瘤組織切片的HE染色、免疫組化染色結(jié)果顯示，siMCUR1組的Ki67陽性率高于siCtrl組［（79.46±1.33）% vs（42.75±1.28）%，P=0.007］，見圖5A；MCUR1組的Ki67陽性率低于EV組［（19.73±1.45）%vs（53.20±1.19）%，P=0.004］，見圖5B。TUNEL實驗結(jié)果顯示，siMCUR1組的細胞凋亡率較siCtrl組降低［（1.73±0.53）% vs（3.72±0.66）%，P=0.023］，見圖5C；MCUR1組細胞凋亡率較EV組上升［（13.41±1.21）% vs（6.43±0.44）%，P=0.041］，見圖5D。

圖4 MCUR1對裸鼠皮下成瘤的影響Fig.4 Effect of MCUR1 on subcutaneous tumorigenesis in nude mice

圖5 MCUR1對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Effect of MCUR1 on proliferation and apoptosis of ovarian cancer

2.5 MCUR1對增殖和凋亡相關(guān)分子蛋白表達的影響

Western blot實驗檢測結(jié)果顯示，siMCUR1組相較于siCtrl組細胞，p53、Caspase-3和Bax表達下調(diào)，而Bcl2、Cyclin D1和Cyclin E表達上調(diào)；MCUR1組相較于EV組，p53、Caspase-3和Bax表達上調(diào)，Bcl2、Cyclin D1和Cyclin E表達下調(diào)，見圖6。

圖6 MCUR1對增殖和凋亡相關(guān)分子蛋白表達的影響Fig.6 Effect of MCUR1 on protein expression of proliferation-and apoptosis-related molecules

3 討論

線粒體作為細胞中的主要能量來源細胞器，通過線粒體生物發(fā)生、代謝重編程、氧化應(yīng)激信號通路參與腫瘤細胞生長、生存和轉(zhuǎn)移，與腫瘤惡性進展密切相關(guān)［10-11］。Ca2+是細胞內(nèi)第二信使，可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和細胞增殖、遷移和死亡［12］。線粒體代謝功能和Ca2+穩(wěn)態(tài)作為細胞生命活動的重要調(diào)控環(huán)節(jié)，兩者密切相關(guān)，共同維持細胞生命活動進程［13-14］。1967年CORTASSA等發(fā)現(xiàn)，離體線粒體內(nèi)能大量累積游離Ca2+，后續(xù)研究進一步證實線粒體是細胞主要的鈣儲存場所之一［15］。MCUR1于2012年被MALLILANKARAMAN等通過靶向RNAi技術(shù)篩查得到，定位于線粒體內(nèi)膜上［7］。該研究還報道MCUR1可與線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運體（MCU）、線粒體鈣攝取分子1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）、MICU2形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運［16］。但細胞內(nèi)MCUR1的缺失會導(dǎo)致線粒體Ca2+濃度顯著降低（約85%），過表達MCUR1不僅能正向調(diào)節(jié)MCU的Ca2+攝取效率，顯著促進線粒體Ca2+內(nèi)流，同時也可提高線粒體對胞漿鈣離子的緩沖能力。值得一提的是，盡管MCUR1功能的發(fā)揮依賴于MCU，但當(dāng)MCUR1表達缺失，MCU則無法維持正常線粒體Ca2+水平，由此可見MCUR1的表達與功能的發(fā)揮是調(diào)節(jié)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［7］。此外，MCUR1在細胞正常生命活動和各種疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用［17］。MALLILANKARAMAN等［7］發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞中敲除MCUR1后可阻礙細胞氧化磷酸化過程，導(dǎo)致細胞三磷酸腺苷合成減少及其依賴的蛋白激酶活性降低，最終引起細胞自噬。TOMAR等［18］發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞敲除MCU及MCUR1后，線粒體生物合成減弱，細胞增殖速度減緩、遷移能力減弱，同時可誘發(fā)細胞自噬。REN等［19］發(fā)現(xiàn)MCUR1在肝細胞癌中表達顯著升高，且MCUR1高表達的患者預(yù)后較差，MCUR1升高還會使線粒體對Ca2+的攝取加強，同時抑制線粒體依賴性的細胞凋亡，促進細胞增殖。以上研究說明MCUR1是維持細胞正常生命活動的關(guān)鍵分子，MCUR1異常表達可能通過損害線粒體功能和改變細胞鈣穩(wěn)態(tài)損害細胞生長。為了解MCUR1與卵巢癌的關(guān)系，本研究首先下載并分析TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCUR1表達水平越高的卵巢癌患者預(yù)后較好，由此初步推測MCUR1可能與卵巢癌密切相關(guān)。

隨后本研究收集組織標(biāo)本進行驗證，免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)大多數(shù)卵巢癌樣本MCUR1染色為陰性，MCUR1陽性率僅為25.6%。進一步構(gòu)建干涉和過表達MCUR1卵巢癌細胞系，通過細胞增殖及構(gòu)建裸鼠成瘤模型等觀察MCUR1表達對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)干涉MCUR1表達后，卵巢癌細胞增殖能力明顯增強，裸鼠皮下荷瘤生長速度亦加快，Ki67表達升高，而細胞凋亡能力減弱，說明干涉MCUR1可明顯促進卵巢癌細胞生長；反之過表達MCUR1則抑制了卵巢癌細胞及裸鼠皮下移植瘤生長。在分子機制方面，本研究發(fā)現(xiàn)過表達MCUR1后，p53蛋白表達升高，p53下游凋亡關(guān)鍵分子Caspase-3和Bax表達升高，而Bcl2表達則降低，周期關(guān)鍵分子Cyclin D1和Cyclin E表達亦降低，提示MCUR1抑制卵巢癌細胞生長可能通過激活p53通路，從而促進線粒體介導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞增殖實現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明，MCUR1在卵巢癌組織中的陽性表達率較低，而在卵巢癌細胞中干涉MCUR1可抑制卵巢癌細胞增殖，促進細胞凋亡，且可能通過激活p53通路實現(xiàn)。MCUR1可能作為一個抑癌基因，有望為卵巢癌的診斷及治療提供新思路。未來本課題組將收集更多樣本并在多個細胞系重復(fù)上述實驗，進一步深入研究MCUR1參與卵巢癌惡性進展的機制。