Taq DNA聚合酶5′～3′外切活性對(duì)熒光定量PCR的影響

蔣析文 劉靄珊 陳巍

Taqman 法熒光定量PCR 是利用Taq DNA聚合酶（后簡(jiǎn)稱(chēng)Taq 酶）的5′～3′DNA 外切活性，在PCR 過(guò)程中切割與模板鏈結(jié)合的熒光探針，釋放出熒光基團(tuán)而產(chǎn)生信號(hào)［1］。在反應(yīng)過(guò)程中，Taq DNA聚合酶的聚合酶活性區(qū)與5′～3′DNA 外切活性區(qū)均參與反應(yīng)［2-4］。目前Taq 酶標(biāo)定的濃度為聚合酶活性單位濃度［5-6］，缺乏對(duì)5′～3′DNA 外切活性的定量。由于Taqman 探針?lè)晒舛縋CR 信號(hào)的產(chǎn)生與Taq 酶的5′～3′DNA 外切活性直接相關(guān)，因此本文研究了不同熱啟動(dòng)Taq 聚合酶的5′～3′DNA 外切酶活性差異，以及該活性對(duì)Taqman 探針?lè)晒舛縋CR的影響，以期進(jìn)一步了解Taq 酶兩種不同活性區(qū)在反應(yīng)中所起的作用，并指導(dǎo)Taqman 法熒光定量PCR 反應(yīng)的優(yōu)化。

1 方法

1.1 材料

Taq 酶、Hotstar Taq 酶、HotStar-II Taq 酶均為達(dá)安基因制備的原料產(chǎn)品，濃度均為10 U/μL。5′～3′DNA 外切酶活性檢測(cè)底物為：Sub1：ATGCTGGTTAAGCTGCCGTAGTCATGCAGTACGTCCGT ACGTCA，Probe1：FAM-CAGCTTAACCAGCATBQH1。外切活性反應(yīng)buffer（10X）：500 mM Tris、500 mM KCl、20 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、pH8.8。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒為達(dá)安基因產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 5′～3′DNA 外切酶活性的測(cè)定

酶樣品用保存液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?、4、3、2、1、0 U/μL，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 5′～3′DNA 外切酶活性測(cè)定反應(yīng)體系Table 1 The Reaction of 5′～3′exonuclease activity assay

反應(yīng)體系放置于Q5 熒光定量PCR 儀中，設(shè)置熒光檢測(cè)通道為FAM，設(shè)置反應(yīng)程序：95℃10 min，（95℃10 s，55℃30 s 并讀取熒光）X 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后將原始熒光數(shù)據(jù)導(dǎo)出，以熒光強(qiáng)度（relative fluorescence units，RFU）為縱坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)作圖，得到在各濃度下的外切酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。計(jì)算反應(yīng)前期的RFU 值線(xiàn)性增長(zhǎng)部分（線(xiàn)性R2＞0.9）的斜率，即為各聚合酶濃度梯度下外切酶活性測(cè)試的反應(yīng)速率（RFU/min）。

1.2.2 不同酶的5′～3′DNA 外切酶活性的對(duì)比

根據(jù)1.2 測(cè)定的同一個(gè)聚合酶在不同聚合酶活性濃度下的外切酶活性反應(yīng)速率，以反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，聚合酶活性濃度（U/μL）為橫坐標(biāo)作圖，得線(xiàn)性關(guān)系方程，方程的斜率即為在單位聚合酶活性濃度下所具有的外切酶活性。對(duì)比不同酶所作線(xiàn)性關(guān)系方程的斜率，即可計(jì)算其外切酶活性的差異倍數(shù)。

1.2.3 不同酶在HBV 病毒DNA 熒光定量PCR 反應(yīng)體系中的性能測(cè)試

取達(dá)安HBV 病毒DNA 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行陽(yáng)性參照品的提取制備。將酶樣品稀釋至1 U/μL，然后按使用說(shuō)明每反應(yīng)加入27 μL 反應(yīng)液A 及3 μL 的1 U/μL酶樣品，混合均勻后加入20 μL 陽(yáng)性參照樣品提取物。按95℃10 min，（95℃10 s，55℃30 s 并讀取熒光）×40 個(gè)循環(huán)，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 5′～3′DNA 外切酶活性的測(cè)定

5′～3′ DNA 外切酶活性的測(cè)定原理如圖1。Taq 聚合酶的5′～3′DNA 外切酶活性不依賴(lài)于上游的模板及引物，對(duì)交叉DNA 或雙鏈DNA 的5′游離末端具有特異性因此設(shè)計(jì)與單鏈DNA（Sub1）互補(bǔ)的探針（Probe1），探針5′端標(biāo)記FAM 熒光，3′端標(biāo)記BQH1 淬滅基團(tuán)，當(dāng)Taq 聚合酶5′～3′DNA 外切活性降解Probe1 時(shí)，F(xiàn)AM 熒光基團(tuán)從探針脫離，發(fā)出熒光信號(hào)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀可檢測(cè)出反應(yīng)曲線(xiàn)（圖2）。從圖2 可見(jiàn)，隨著聚合酶濃度的下降，反應(yīng)曲線(xiàn)的斜率隨之下降，反應(yīng)曲線(xiàn)前期熒光線(xiàn)性增長(zhǎng)區(qū)的斜率即為各濃度梯度下反應(yīng)速率。從圖3 可見(jiàn)，反應(yīng)的初始速率與加入的聚合酶濃度成線(xiàn)性關(guān)系（r2=0.982），此直線(xiàn)的斜率可衡量單位濃度的Taq 酶所具有的5′～3′DNA 外切活性高低。

圖1 5′～3′DNA 外切酶活性測(cè)定原理Figure 1 Schematic of 5′～3′exonuclease activity assay

圖2 不同濃度的Taq 酶與底物反應(yīng)后的熒光曲線(xiàn)Figure 2 Fluorescence curve of substrate reaction with gradient of Taq

圖3 Taq 酶濃度與其5′～3′DNA 外切活性的線(xiàn)性關(guān)系Figure 3 Linear relationship between the concentration of Taq and its 5′～3′exonuclease

2.1 不同熱啟動(dòng)Taq 酶的5′～3′DNA 外切活性的對(duì)比

兩種熱啟動(dòng)酶Hotstar Taq 和Hotstar-II Taq 來(lái)源于Taq 酶，經(jīng)不同化學(xué)修飾方法制備而成。測(cè)定3 種酶在相同濃度下的5′～3′DNA 外切活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Hotstar Taq、Hotstar-II Taq、Taq 酶在相同聚合酶活性濃度下的5′～3′外切活性的對(duì)比Figure 4 comparison of 5～3′exonuclease activity of Hotstar Taq、Hotstar-II Taq、Taq with the same polymerase activity

從圖4 可見(jiàn)，未經(jīng)化學(xué)修飾的Taq 酶同等聚合酶活性濃度下具有最高5′～3′外切活性，而經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的制備而成的Hotstar Taq 及Hotstar-II Taq的5′～3′外切活性均有所下降，其中Hoststar Taq 5′～3′外切活性最低。

2.3 熱啟動(dòng)酶5′～3′ DNA 外切活性對(duì)Taqman 探針?lè)晒舛縋CR的影響

使用不同濃度的Hotstar Taq、Hotstar-II Taq 及Taq 酶，對(duì)4 個(gè)梯度的HBV 陽(yáng)性參照物（2e6～2e3）進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。結(jié)果見(jiàn)圖5。

從圖5 可見(jiàn)，當(dāng)每反應(yīng)中加入3 U HotStar Taq、HotStar-II Taq、Taq 酶時(shí)，各陽(yáng)性參照物梯度擴(kuò)增的情況基本一致，熒光曲線(xiàn)重合；每反應(yīng)中加入0.38 U、0.19 U 酶時(shí)，Taq 酶對(duì)各陽(yáng)性參照物梯度擴(kuò)增每循環(huán)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)于HotStar-II Taq，Hot-Star-II Taq 強(qiáng)于HotStar Taq。證明酶對(duì)探針的外切反應(yīng)為PCR 反應(yīng)的限速步驟。

根據(jù)圖4 中測(cè)定的各不同Taq 酶單位濃度下的5′～3′ DNA 外切活性（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的斜率），Taq 酶的外切活性為HotStar-II Taq 的2.70 倍，Hot-Star Taq 的4.55 倍，調(diào)整PCR 反應(yīng)中酶的用量至反應(yīng)中加入的5′～3′外切酶活性單位一致（Taq：0.38 U/反應(yīng)，HotSatr Taq：1.73 U/反應(yīng)，HotStar-II Taq 1.03 U/反應(yīng)），測(cè)試對(duì)HBV 陽(yáng)性參照物樣品的擴(kuò)增效率，結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6 可見(jiàn)，即使各酶加入量不同，但擴(kuò)增曲線(xiàn)基本一致，證明當(dāng)反應(yīng)中5′～3′外切酶活性一致時(shí)，增加聚合酶活性并沒(méi)能進(jìn)一步提高PCR的擴(kuò)增效率，因此進(jìn)一步證明了酶對(duì)探針的外切反應(yīng)為PCR 反應(yīng)的限速步驟。

圖5 3 種聚合酶活性不同活性梯度下對(duì)HBV 陽(yáng)性參照物的測(cè)試結(jié)果Figure 5 Amplification of HBV positive sample by three polymerases with equal activity unit

圖6 3 種聚合酶擴(kuò)增不同梯度HBV 陽(yáng)性參照物的測(cè)試結(jié)果Figure 6 Amplification of gradient HBV positive sample by three polymerases with different activity unit

3 討論

Taqman 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR 是當(dāng)今分子診斷的主流技術(shù)，以其快速、高通量［7］、多通道［8］、高靈敏度［1，9］、高特異性［2］等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病原微生物的定性及定量檢測(cè)［10-12］、單核苷酸多 態(tài)（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測(cè)［13-14］、短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR）分型檢測(cè)［15］、基因表達(dá)水平差異檢測(cè)［16］、等位基因表達(dá)差異檢測(cè)（Allelic Expression Imbalance，AEI）［17］、融合基因檢測(cè)［4］等方面，在科研、臨床診斷、疾病防控、獸醫(yī)、法醫(yī)、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。其檢測(cè)原理是：具有5′～3′DNA 外切活性的DNA聚合酶在PCR 延伸過(guò)程中遇到結(jié)合在模板鏈上的熒光標(biāo)記探針時(shí)，利用其5′～3′DNA 外切活性將探針降解，釋放熒光信號(hào)并由實(shí)時(shí)定量PCR 儀檢測(cè)［5］。根據(jù)此原理，Taqman探針?lè)晒舛縋CR 檢測(cè)的信號(hào)與PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增及探針的切割直接相關(guān)。在Taq DNA聚合酶上，聚合酶活性區(qū)與5′～3′DNA 外切活性區(qū)位于不同的結(jié)構(gòu)域［15］，聚合活性區(qū)與外切活性區(qū)共同作用，驅(qū)動(dòng)新生DNA 鏈合成的同時(shí)切割熒光探針釋放信號(hào)。在聚合與外切兩種不同的反應(yīng)中，反應(yīng)效率低的一方直接決定DNA 擴(kuò)增的效率以及熒光信號(hào)釋放的效率。根據(jù)報(bào)道，Taq 酶并非完全降解探針，其降解的區(qū)域從探針的5′端起約5～12 bp，未完全降解的探針有可能參與后續(xù)的PCR 循環(huán)，從而抑制熒光信號(hào)的釋放，而探針的降解與Taq 酶的外切活性的強(qiáng)弱密切相關(guān)［3，18］。從本研究所得結(jié)果可見(jiàn)，當(dāng)反應(yīng)中酶過(guò)量時(shí)（3 U/反應(yīng)），聚合酶活性及外切酶活性同時(shí)滿(mǎn)足反應(yīng)的需求，不同酶之間擴(kuò)增效率沒(méi)有明顯差異。但在酶量不足的情況下（0.38、0.19 U/反應(yīng)），反應(yīng)中加入相同聚合酶活性的Taq 酶，具有更高外切酶活性的酶其擴(kuò)增效率更高；而加入相同外切酶活性的Taq 酶，即使聚合酶活性不同，但擴(kuò)增效率基本一致。以上結(jié)果證明外切反應(yīng)為限速步驟，其速率決定DNA擴(kuò)增的效率。

提高Taq 酶的DNA 聚合活性及持續(xù)延伸能力是改進(jìn)PCR 效率的一貫策略，但由于Taqman 探針?lè)晒舛縋CR的信號(hào)產(chǎn)生依賴(lài)于探針的降解，而本研究揭示了Taq 酶5′～3′ DNA 外切活性與PCR 熒光信號(hào)的關(guān)系，為T(mén)aq 酶的性能改造指出了新的方向。為提高PCR 特異性，均需要對(duì)Taq酶的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉修飾從而達(dá)到熱啟動(dòng)的目的?；瘜W(xué)修飾由于成本較低，能在較高溫度下保持封閉，是對(duì)Taq 酶進(jìn)行熱啟動(dòng)修飾的較常用方法。但化學(xué)修飾不可避免地對(duì)Taq 酶的結(jié)構(gòu)和活性有影響，在修飾過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)蛋白變性、沉淀和失活，被修飾基團(tuán)在酶上各結(jié)構(gòu)域分布的情況也可能影響各結(jié)構(gòu)域在修飾后性能改變的程度［19］。本研究中兩種不同化學(xué)修飾制備的Taq 酶表現(xiàn)出不同的外切酶活性和PCR 擴(kuò)增性能也證明了這一弊端。抗體修飾Taq 酶或配體修飾Taq 酶由于通過(guò)與Taq酶結(jié)合而屏蔽活性位點(diǎn)達(dá)到熱啟動(dòng)的目的［20-21］，因此能保留Taq 酶完整的活性。在耐熱DNA聚合酶的突變改造中，突變篩選方法通常專(zhuān)注于提高聚合酶性能而忽視對(duì)外切酶性能的考察［6，22-23］，而抑制或刪除5′～3′外切活性結(jié)構(gòu)域已被證明是提高聚合酶性能的有效途徑［25］，因此篩選出的突變體很可能因外切酶活性低而不適用于Taqman 探針?lè)ǘ縋CR。為解決這一問(wèn)題，有必要在篩選前確認(rèn)突變體具有完整的外切活性功能。