腎性骨病相關(guān)分子通路的研究進(jìn)展

伍子賢 戴如璋 林少豪 馮元藍(lán) 梁德 江曉兵 任輝 唐晶晶

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)常繼發(fā)于慢性腎炎、急性腎衰等腎性疾病，定義為任何持續(xù)時(shí)間超過3個(gè)月的腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常疾病[1]。相關(guān)調(diào)查顯示，我國40歲以上人群慢性腎病的患病率大于10%，并且隨著糖尿病發(fā)病率的上升，繼發(fā)性CKD患病率不斷上升[2]，CKD人群不斷擴(kuò)大，該疾病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，每年CKD及其并發(fā)癥導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)問題與社會(huì)問題越來越多，后者尤為突出。而CKD的主要并發(fā)癥有腎性腦病、胃腸道異常、骨病等，其中，最常見的為腎性骨病(CKD-multiple myeloma bone disease，CKD-MBD)[3]。腎性骨病是CKD引發(fā)的一系列鈣磷代謝紊亂和成骨-破骨異常而導(dǎo)致的一種疾病，是CKD引發(fā)礦物質(zhì)及骨骼代謝失調(diào)的一種表現(xiàn)形式。根據(jù)病例特點(diǎn)分為高轉(zhuǎn)運(yùn)性骨病、低轉(zhuǎn)運(yùn)性骨病及混合性骨病三類[4-6]。

腎性骨病在慢性腎病人群中十分普遍，在一項(xiàng)對(duì)2 096例腎臟替代治療患者的回顧性分析表明，在腎替代治療人群中，血液透析患者的癥狀性骨折風(fēng)險(xiǎn)是腎移植患者的兩倍，而腹膜透析患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)介于兩者之間，CKD患者未經(jīng)透析的骨折風(fēng)險(xiǎn)可能更大[7]。故腎性骨病的發(fā)生大大降低腎病患者的生活質(zhì)量且增加其死亡率。近年來，隨著對(duì)腎性骨病關(guān)注度的不斷提高，不僅進(jìn)一步更完善地闡明了腎臟-PTH信號(hào)通路在腎性骨病的作用機(jī)制，也發(fā)現(xiàn)在腎性骨病的發(fā)病進(jìn)展中有其他重要的分子信號(hào)通路參與調(diào)控，共同形成復(fù)雜的分子信號(hào)通路網(wǎng)。因此，深入探討“分子信號(hào)通路生物學(xué)機(jī)制與分子信號(hào)通路網(wǎng)之間的關(guān)系”對(duì)于研究CKD發(fā)病機(jī)制及臨床腎性骨病的防治具有一定的參考價(jià)值。

1 腎性骨病中與骨-腎軸相關(guān)的分子信號(hào)通路

研究發(fā)現(xiàn)，腎性骨病的患者會(huì)出現(xiàn)骨代謝營養(yǎng)疾病，繼而導(dǎo)致骨吸收與骨形成平衡的紊亂。同時(shí)骨作為一種特別的內(nèi)分泌器官，也能反作用于腎臟調(diào)控特定的分子信號(hào)通路。這種相互調(diào)控、相互影響的關(guān)系，被稱為骨-腎軸[3,8]。

腎性骨病通過分子信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控骨-腎軸，其中涉及的信號(hào)通路主要包括腎臟-PTH通路(軸心通路)、Wnt/β-catenin通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)通路，后兩者作為腎臟-PTH通路下游通路，3個(gè)通路共同協(xié)助調(diào)節(jié)骨形成與骨吸收；klotho基因平衡協(xié)助通路與軸心之間的關(guān)系；骨FGF23分子反饋性調(diào)節(jié)軸心通路(見圖1)。當(dāng)腎臟疾病時(shí)，腎性骨病通過上述信號(hào)通路網(wǎng)引起該病的發(fā)生。

圖1 腎性骨病中腎-骨軸的分子信號(hào)通路網(wǎng)Fig.1 Molecular signaling pathway network of renal-bone axis in renal osteodystrophy

1.1 腎臟-PTH通路為腎性骨病骨-腎軸的軸心

在正常情況下，由甲狀旁腺分泌的PTH所介導(dǎo)的通路能夠通過調(diào)節(jié)骨鈣與血鈣的平衡來調(diào)控骨平衡，是參與骨合成代謝的重要信號(hào)通路。其主要的通路機(jī)制為：PTH主要與PTH 受體(PTHR)結(jié)合而發(fā)揮其生物功能。PTH1R是II型G蛋白偶聯(lián)受體，具有2條信號(hào)通路[9]：(1)Gsɑ偶聯(lián)的依賴cAMP的蛋白激酶A信號(hào)途徑；(2)Gq/11偶聯(lián)的PLC-蛋白激酶C信號(hào)途徑。CKD繼發(fā)鈣磷代謝紊亂甲狀旁腺增大，PTH分泌過多，最終導(dǎo)致骨平衡徹底紊亂。見圖2。

圖2 PTH1R 的兩條信號(hào)通路Fig.2 Two signaling pathways of PTH1R

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為[10-11]，CKD-MBD主要是由于腎功能下降導(dǎo)致鈣的代謝排泄受到影響，故腎臟生成1,25(OH)2D3的能力下降，同時(shí)腎臟排泄磷離子能力下降，導(dǎo)致血清磷的水平過高，鈣代謝紊亂，引發(fā)一系列機(jī)體鈣磷平衡的紊亂，繼而導(dǎo)致了甲狀旁腺增生，異常分泌PTH增多，此過程可稱為繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)。血清PTH水平過高，生物通路機(jī)制紊亂，破骨細(xì)胞活性代償性增加，成骨細(xì)胞活性代償性下降，釋放骨鈣入血，可單獨(dú)或同時(shí)導(dǎo)致成骨-破骨過程異常，最終表現(xiàn)為礦物質(zhì)、1,25(OH)2D3代謝異常，骨轉(zhuǎn)化、礦化、容量、線性生長或強(qiáng)度異常以及血管或軟組織異位鈣化[3]。故CKD晚期的患者幾乎都會(huì)存在CKD-MBD的問題，嚴(yán)重的可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，極大地降低CKD患者的生活質(zhì)量，縮短患者的生存時(shí)間。

在臨床研究中，針對(duì)腎臟-PTH通路分子靶點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的用藥，能夠在臨床上取得確切的療效，如：給予1,25(OH)2D3與鈣磷結(jié)合劑[12]，或者調(diào)節(jié)透析的方式[13]清除異常的鈣磷代謝物，能夠大大緩解腎性骨病的病程進(jìn)展；現(xiàn)存最新的治療方案是對(duì)CKD患者早期運(yùn)用甲狀旁腺切除術(shù)并甲狀旁腺移植術(shù)[14]，該方案能取得一定的療效[3]。但在最新的研究發(fā)現(xiàn)，單純的針對(duì)腎臟-PTH通路進(jìn)行用藥治療效果已經(jīng)不能滿足越來越高的醫(yī)療需求，同時(shí)調(diào)控與軸心相關(guān)的分子信號(hào)通路提高預(yù)后已成為最新的治療觀念。

1.2 Wnt/β-catenin通路

正常情況下，Wnt/β-catenin通路作用機(jī)制如下： Wnt蛋白與細(xì)胞膜受體(LRP5/6)結(jié)合，活化Fz受體，通過骨架蛋白(Dv)和酪蛋白激酶1(CK1)傳遞信號(hào)，活化由軸蛋白(axin)、結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)和糖原合成酶激酶3(GSK3)組成的復(fù)合物，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[15-16]。無Wnt信號(hào)刺激時(shí)，β-catenin被GSK3磷酸化，并通過泛素/蛋白酶體途徑被降解。而當(dāng)有Wnt 信號(hào)刺激時(shí)，蛋白復(fù)合物解離不發(fā)生磷酸化，catenin在胞漿中積聚并轉(zhuǎn)位入核，與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(TCF/LEF)結(jié)合啟動(dòng)靶基因如c-myc、cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的增殖或活化，該過程對(duì)成骨非常關(guān)鍵[17](見圖3)。

此過程可受多種調(diào)節(jié)因子共同調(diào)節(jié)，其中硬化蛋白(sclerostin，SOST)與 Dickkopf 1(DKK1)是目前被研究最多的，也是最為重要的 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的兩個(gè)抑制物，其作用是主要通過與LRP5/6共受體結(jié)合阻礙具有活性的Wnt受體復(fù)合物的形成[18]，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(見圖3)。高表達(dá)的SOST主要通過抑制 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，阻礙間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟的骨細(xì)胞分化，降低骨形成，調(diào)節(jié)骨量[19]。DKK-1是一種糖蛋白，在胚胎形成過程中表達(dá)于多種組織中(包括骨組織)，通過與LRP6以及跨膜蛋白Kremen1/2形成復(fù)合體，導(dǎo)致 LRP內(nèi)吞與降解，減少細(xì)胞膜上可用性的LRP與Wnt配體結(jié)合[20-21]，阻斷了Wnt信號(hào)向胞內(nèi)的傳遞，從而抑制骨形成，降低骨量[22]。

近期研究顯示，wingless related MMTV integration site(Wnt)/β-catenin 信號(hào)通路在腎性骨病發(fā)病過程中具有至關(guān)重要的作用(見圖4)，PTH能夠使GSK3β失活[23]，從而穩(wěn)定β-catenin[24]。另外，PTH與PTH1R結(jié)合后，PTH1R與LRP6形成復(fù)合物，使得具有破壞性的復(fù)合物(即由軸蛋白、APC和GSK 3組成的復(fù)合物)的解離[24]，從而避免β-catenin被降解而激活了Wnt信號(hào)途徑。PTH 能夠作用于骨細(xì)胞以減少Wnt抑制因子骨硬化蛋白[25]和DKK1的表達(dá)[26]，這些內(nèi)源性抑制因子的減少導(dǎo)致了自分泌Wnt信號(hào)途徑的增強(qiáng)，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，PTH對(duì)敲除LRP5基因的小鼠并不發(fā)揮其促骨合成代謝的作用[25,27]，提示PTH通路對(duì)Wnt下游信號(hào)通路的作用。

綜上，在腎性骨病中Wnt/β-catenin通路作為腎臟-PTH通路的下游通路，PTH可通過對(duì)硬化蛋白(sclerostin，SOST)、Dickkopf 1(DKK1)和β-catenin的調(diào)控，控制Wnt/β-catenin通路激活與否，進(jìn)而影響腎性骨病的進(jìn)展。

圖3 正常的Wnt/β-catenin信號(hào)通路Fig.3 Normal Wnt/β-catenin signaling pathway

圖4 PTH與Wnt/β-catenin通路作用機(jī)制Fig.4 Mechanism of action of PTH and Wnt/β-catenin pathway

PTH通過抑制SOST，DKK1與復(fù)合體中β鏈蛋白的活性調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路的激活與否。同時(shí)，PTH與PTH1R結(jié)合激活PTH1R，PTH1R與LRP蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，可促使由軸蛋白(axin)、結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)和糖原合成酶激酶3(GSK3)等組合成的復(fù)合物分解，使細(xì)胞內(nèi)β-catenin的含量上升。

1.3 BMP通路

BMP屬于轉(zhuǎn)移生長因子TGF-β超家族中的一員，其主要生物學(xué)作用是誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞增殖及發(fā)生成骨分化，最終促進(jìn)骨的形成。在CKD-MBD中，研究發(fā)現(xiàn)隨著PTH信號(hào)通路異常，腎性骨病的病程進(jìn)展，血清中的BMP-7會(huì)持續(xù)下降，說明PTH信號(hào)通路的異常可能導(dǎo)致了BMP通路的功能下降[28]，從而加速了腎性骨病的進(jìn)展。

BMP主要信號(hào)通路是通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)下游通路如Smad和MAPK等信號(hào)通路，從而發(fā)生一系列磷酸化或聚合酶聯(lián)反應(yīng)[29]。其中與腎性骨病最為相關(guān)的分子為BMP-7[30]。在實(shí)驗(yàn)研究中，一方面BMP-7可以逆轉(zhuǎn)腎纖維化進(jìn)程，誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，保護(hù)腎功能，促進(jìn)損傷腎再生修復(fù)[30]；另一方面在慢性腎性骨病模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[31]，給予外源性的BMP-7可以使血磷顯著降低，骨質(zhì)病變基本消失；除此之外，在細(xì)胞層面上，還可以增加成骨細(xì)胞活性，抑制骨小梁纖維化，減少骨的重吸收。同時(shí)，BMP-7還能在一定程度上預(yù)防腎性骨病血清鈣異常在血管內(nèi)膜沉積而導(dǎo)致血管硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥，避免發(fā)生血管疾病。

1.4 Klotho基因

日本一個(gè)研究衰老的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)機(jī)體中存在一種名為Klotho基因的抗衰老基因，它能夠協(xié)調(diào)腎性骨病相關(guān)的分子信號(hào)通路。Klotho基因表達(dá)蛋白有兩類，即循環(huán)型Klotho蛋白(Circulating Klotho)與跨膜型Klotho蛋白(Trans-membrane Klotho)[16]。該表達(dá)蛋白可以作為一種新型的去糖基類固醇類b型葡萄糖醛酸酶和鈣通道瞬變受體電位vallinoid-5(TRPV5)發(fā)揮相應(yīng)的生理功能；或作為FGF23刺激成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體的輔助因子。Klotho基因表達(dá)蛋白的這兩項(xiàng)功能導(dǎo)致了Klotho基因成為調(diào)節(jié)礦物質(zhì)和維生素D代謝的關(guān)鍵因子[32]，使之可以在腎臟功能中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Klotho基因的表達(dá)受到雌激素、鈣、磷酸鹽、1,25(OH)2D3、PTH和年齡等的影響，其表達(dá)會(huì)受到影響，從而維持上述分子的動(dòng)態(tài)平衡，以保護(hù)骨-腎結(jié)構(gòu)；而當(dāng)Klotho基因表達(dá)異常的時(shí)候，反而會(huì)加速腎性骨病的進(jìn)展[16]。

在相關(guān)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究中[33-35]，對(duì)于1,25(OH)2D3的調(diào)控，當(dāng)小鼠Klotho基因高表達(dá)時(shí)，小鼠內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)鈣磷酸鹽穩(wěn)態(tài)紊亂和血清活性維生素D[1,25(OH)2D3]濃度異常升高的情況；當(dāng)這些小鼠模型大多數(shù)發(fā)展為衰老表型(包括腎-骨損傷)，即衰老致Klotho基因表達(dá)水平下降，該內(nèi)環(huán)境紊亂可一定程度上被糾正，可見血清鈣和1,25(OH)2D3濃度降低。同時(shí)通過飲食中磷酸鹽的限制[17-18]，提示這些表型是下游事件。有研究者推測，Klotho基因異常表達(dá)模型可能通過調(diào)節(jié)25-羥維生素d-1a-羥化酶(CYP27b1)活性調(diào)節(jié)1,25(OH)2D3，但這種機(jī)制具體尚不清楚。

另外，通過對(duì)Klotho基因突變轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，突變體小鼠會(huì)出現(xiàn)高鈣血癥或高磷血癥。其中一種途徑近期已被闡明[33-35]：Klotho基因通過一種新的分子機(jī)制調(diào)節(jié)，即通過細(xì)胞膜表面的去糖基化和穩(wěn)定上皮鈣通道TRPV5實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)曲小管中鈣的再吸收。Klotho基因、TRPV5和 calbindin-D28 K在小鼠腎細(xì)胞遠(yuǎn)曲連接小管中結(jié)合并發(fā)揮其功能，使腎段負(fù)責(zé)活躍的跨上皮鈣再吸收的相應(yīng)小管功能增強(qiáng)。相反，缺乏Klotho基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面TRPV5的表達(dá)減少，減少管狀鈣的再吸收。同樣，缺乏TRPV5的小鼠減少了Klotho基因表達(dá)，并降低了腎鈣的再吸收，盡管增加了1,25(OH)2D3的水平，但并不能維持原有的平衡。

除此之外，由于高鈣血癥、高維生素D及Klotho基因?qū)α姿猁}的腸道和腎吸收的影響，Klotho基因表達(dá)蛋白的缺乏還可能會(huì)減少尿中磷酸鹽的排泄導(dǎo)致高磷血癥的發(fā)生。

1.5 FGF23分子相關(guān)的骨反饋機(jī)制

FGF23是一種主要由骨細(xì)胞分泌的32-kDa蛋白(含251個(gè)氨基酸)。FGF23通過與腎臟中的特定受體相互作用，可以反饋調(diào)控腎的相關(guān)分子信號(hào)通路(BMP通路、Klotho基因等)，從而調(diào)節(jié)腎臟磷酸鹽排泄和維生素D合成，在腎-骨軸機(jī)制中扮演了一個(gè)重要的新角色[8]。

這種骨激素需要特定的輔助因子能夠有效地激活其受體。這類輔助因子主要以Klotho基因?yàn)榇?，已知在男性體內(nèi)主要在腎臟產(chǎn)生，為現(xiàn)研究中較為熱點(diǎn)的骨-腎模型。而在最新的研究進(jìn)展中[8]，其中兩個(gè)輔助因子已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)：第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的輔助因子Klotho[16]能與受體FGFR1c(FGF23受體)結(jié)合，并激活該受體；而第二因子b-Klotho[21]與肝臟、胰腺和脂肪細(xì)胞中剩余的FGF受體相互作用，最終改變維生素D、鈣和磷酸鹽的平衡[36]，甚至影響膽汁酸和能量的穩(wěn)態(tài)?；谏鲜鯧lotho基因與FGF23的相互作用，相關(guān)研究者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：FGF23與Klotho基因存在重要聯(lián)系[21]，因此可以推斷出FGF23與骨病之間存在重要聯(lián)系，但背后的機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

基于臨床觀察與特殊病例的收集(嚴(yán)重低磷酸酯血癥相關(guān)的腫瘤)，有研究者已經(jīng)提出關(guān)于FGF23作用的假設(shè)——骨-腎軸簡化方案[21，36](見圖5)。一方面，由骨細(xì)胞產(chǎn)生的FGF23影響腎臟活化維生素D的合成和磷酸鹽排泄。同時(shí)，F(xiàn)GF23活性直接或間接受到骨源蛋白的影響。特別是由細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(MEPE)的裂解而產(chǎn)生的酸性絲氨酸、天冬氨酸富集序列(ASARM)，具有磷酸酶-尿的作用。同時(shí)，牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷蛋白1(DMP 1)通過刺激X連鎖磷酸鹽調(diào)節(jié)基因(PHEX)，間接降低FGF23活性。另一方面，血清中磷酸鹽和(或)1,25(OH)2D3水平的增加刺激骨細(xì)胞產(chǎn)生FGF23。由于Klotho基因在腎臟中的表達(dá)，F(xiàn)GF23可以結(jié)合其在腎小管細(xì)胞上的受體。從而抑制了Na-Pi 2a共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成，增加了腎小管細(xì)胞的內(nèi)吞作用，最終減少腎磷酸鹽的再吸收和血清磷酸鹽的含量。FGF23受體的激活還能抑制1-羥化酶，增加24,25-羥化酶的合成，從而減少活化維生素D的生成。建立了一個(gè)清晰的反饋回路，二者構(gòu)成現(xiàn)有骨-腎之間的聯(lián)系。

圖5 骨-腎軸簡化方案Fig.5 Simplified schema chart of the bone-kidney axis

除了膽甾醇外，腎源性BMP-7也可以影響骨細(xì)胞的活性。另一方面，F(xiàn)GF23是由骨細(xì)胞產(chǎn)生的，它會(huì)影響腎臟活化維生素D(骨化三醇)的合成和磷酸鹽的排泄。同時(shí)，F(xiàn)GF23活性直接或間接地受到骨源性蛋白的影響。特別是由于MEPE的裂解而產(chǎn)生的ASARM具有磷-氮效應(yīng)，DMP1通過刺激PHEX間接降低FGF23的活性。骨與腎之間的激素對(duì)話能調(diào)控血液電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

2 結(jié)語

尋找腎性骨病相關(guān)分子信號(hào)通路上的作用靶點(diǎn)并進(jìn)行相關(guān)研究，是制定合理有效的腎性骨病治療方案的重要途徑。目前研究中，腎性骨病主要涉及的分子信號(hào)通路有：以腎臟-PTH通路作為腎性骨病中調(diào)控骨-腎的軸心通路，Wnt/β-catenin通路和BMP通路作為腎臟-PTH通路下游通路，共同協(xié)助調(diào)節(jié)骨形成與骨吸收；Klotho基因平衡協(xié)助通路與軸心之間的關(guān)系；骨FGF23分子反饋性調(diào)節(jié)軸心通路。

本文就其研究廣度而言，除了上述所報(bào)道的分子信號(hào)通路以外，相關(guān)文獻(xiàn)還報(bào)道了雌激素通路、谷氨酸通路、OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路參與在分子信號(hào)通路網(wǎng)中，但上述通路詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，仍有進(jìn)一步研究的必要。

通過臨床觀察與臨床治療發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)前臨床治療大部分藥物單純針對(duì)腎臟-PTH通路且作用靶點(diǎn)單一，或僅糾正PTH通路異常所引發(fā)的微量元素紊亂，此類用藥更多用于早期腎性骨病的預(yù)防與治療上，對(duì)于腎性骨病后期所導(dǎo)致的骨疾病尚且無較好的治療效果。故今后有必要進(jìn)行相關(guān)藥物的研究，通過調(diào)控與軸心相關(guān)的分子信號(hào)通路提高預(yù)后效果，同時(shí)兼顧腎性骨病后期導(dǎo)致的骨疾病，以建立更有效的治療方案。