不同激素配比對梅花花粉離體萌發(fā)的影響

焦雪輝，史喜兵，周小娟，孫毅寧，申瀟瀟

（鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所，河南鄭州450005）

梅花（Prunus mume）是我國十大傳統(tǒng)名花之一，自古以來深受人們喜愛。其品種資源豐富，色、香、形、韻各具特色，觀賞價值極高，尤其開花時節(jié)在冬季，為蕭索的冬季增添了一道獨(dú)特的景觀。梅花在我國有超過3 000 a 的引種栽培歷史，在這期間人們不斷地探索研究，許多新品種被培育出來，在增加種質(zhì)資源的同時，也使我國的園林景觀得到了極大的豐富[1-2]。

梅花優(yōu)良品種選育一直以來是研究人員的一項(xiàng)重要工作，其中，花粉活力測定是進(jìn)行品種選育的必要步驟，對指導(dǎo)梅花育種具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[3]。在親本選擇中，除了要考慮父本的觀賞性狀和抗性等因素外，選擇花粉活力高、花粉量多的品種作父本對雜交成功至關(guān)重要[4]?；ǚ刍盍y定方法很多，其中，離體萌發(fā)測定法因其測定結(jié)果最接近原始結(jié)果而受到廣泛應(yīng)用。離體萌發(fā)法一般分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。其中，液體培養(yǎng)操作具有簡單、迅速、合理，并可完全定量的優(yōu)點(diǎn)[5]，在試驗(yàn)中應(yīng)用較多。選擇培養(yǎng)基時，要根據(jù)不同植物種類進(jìn)行選擇，必要時還需要對基本培養(yǎng)基進(jìn)行改良，增加Ca2+、K+、PEG、糖等可以促進(jìn)花粉萌發(fā)的元素或物質(zhì)等[6-7]。趙宏波等[3]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PEG 4000 能顯著促進(jìn)梅花花粉萌發(fā)，低質(zhì)量濃度（50 g/L）蔗糖對梅花品種花粉萌發(fā)作用不顯著，而高質(zhì)量濃度（≥100 g/L）蔗糖對花粉萌發(fā)和花粉管生長有明顯的抑制作用。任廣兵等[8]研究了不同離體萌發(fā)培養(yǎng)液對梅花花粉萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，10%蔗糖＋0.01%硼酸適合多數(shù)品種花粉離體培養(yǎng)。綠萼梅作為梅花中一個非常重要的品種群，其觀賞性獨(dú)特，受到大眾的青睞。目前對綠萼梅花粉的萌發(fā)鮮有研究。

本研究以綠萼梅為試驗(yàn)材料，以蔗糖、硼酸、氯化鈣和PEG 4000 溶液濃度為影響因素，采用液體培養(yǎng)基離體培養(yǎng)的方法，探索不同激素配比對梅花花粉萌發(fā)的影響，以期研究出適宜綠萼梅花粉離體培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，為梅花有性雜交提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為綠萼型梅花，取自鄭州市植物園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉采集 2018 年3 月初，天氣晴朗時采摘含苞待放的梅花花朵，用鑷子撥開花瓣，取下花藥，在硫酸紙上平攤成薄薄一層，置于60 W 白熾燈下加熱6～8 h，待花粉自然散落后，用尼龍網(wǎng)篩得花粉，收集到離心管中，標(biāo)明時間，放入裝有硅膠干燥劑的自封袋中，在-20 ℃冰箱中貯存。

1.2.2 花粉活力測定 采用離體萌發(fā)測定法進(jìn)行液體培養(yǎng)，測定不同濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣、PEG 4000 對花粉萌發(fā)的影響，根據(jù)因素水平（表1），按照L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表2）。根據(jù)不同處理，配制不同濃度的花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)液，以清水培養(yǎng)為對照。

表1 花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)液因素及水平

表2 花粉離體培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用移液槍將花粉培養(yǎng)液滴在雙孔凹玻片上，用毛筆蘸取少量待測花粉，將其置于培養(yǎng)液中，使其均勻散開；在培養(yǎng)皿底部鋪上單層濕濾紙，將雙孔凹玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察[9]。每個處理重復(fù)6 次，每個重復(fù)選擇3 個視野進(jìn)行觀察，每個視野統(tǒng)計(jì)的花粉總數(shù)不少于60 個?；ǚ勖劝l(fā)的標(biāo)準(zhǔn)按照花粉管長度超過花粉直徑2 倍計(jì)算[10]。按照花粉萌發(fā)率的計(jì)算公式，計(jì)算每個視野的花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理間花粉萌發(fā)率差異性比較

由表3 可知，培養(yǎng)4 h 后，對照組花粉萌發(fā)率為35.69%，不同激素配比處理的花粉萌發(fā)率在36%～55%，均高于對照組。其中，萌發(fā)率最高的為1 號培養(yǎng)基，萌發(fā)率為54.34%，激素配比為蔗糖20 g/L＋硼酸150 mg/L＋氯化鈣10 mg/L＋PEG4000 15 g/L；萌發(fā)率最低的為4 號培養(yǎng)基，萌發(fā)率為36.92%，激素配比為蔗糖15 g/L＋硼酸50 mg/L＋氯化鈣30 mg/L＋PEG 4000 15 g/L；7 號和3 號培養(yǎng)基與6、8、4 號培養(yǎng)基間差異顯著，1 號培養(yǎng)基對萌發(fā)率的影響與其他培養(yǎng)基之間差異極顯著（P＜0.01）。說明1 號培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基相比最適合梅花花粉離體培養(yǎng)。

表3 不同處理間花粉萌發(fā)率差異性比較 %

2.2 不同因素對花粉萌發(fā)率的影響

從表4 可以看出，蔗糖和硼酸質(zhì)量濃度對梅花花粉萌發(fā)率有極顯著影響（P＜0.01），氯化鈣和PEG 4000 質(zhì)量濃度對綠萼梅花粉萌發(fā)率影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)合單因素統(tǒng)計(jì)，蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L時，萌發(fā)率最高，硼酸質(zhì)量濃度為150 mg/L 時，萌發(fā)率最高，且均顯著高于其他2 個較低質(zhì)量濃度下的萌發(fā)率，說明高質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)可能有促進(jìn)作用，但還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。氯化鈣質(zhì)量濃度為10 mg/L 時，萌發(fā)率最高，PEG 4000 質(zhì)量濃度為15 g/L 時，萌發(fā)率最高，但與其他2 個水平下的萌發(fā)率差異不顯著。通過試驗(yàn)分析得出，在正交試驗(yàn)所有處理中，最適合梅花花粉離體萌發(fā)的激素配比為蔗糖20 g/L＋硼酸150 mg/L＋氯化鈣10 mg/L＋PEG 4000 15 g/L。

表4 不同處理間的方差分析

2.3 激素配方優(yōu)化

由上述試驗(yàn)可以看出，高質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)可能有促進(jìn)作用，為進(jìn)一步研究出更加適合花粉萌發(fā)的蔗糖和硼酸濃度，探討高質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)的作用。在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對蔗糖和硼酸質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，蔗糖質(zhì)量濃度設(shè)3 個水平（20、40、60 g/L），硼酸質(zhì)量濃度設(shè)3 個水平（150、300、450 mg/L），測定高質(zhì)量濃度蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)的影響。

表5 蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)的影響

從表5 可以看出，蔗糖質(zhì)量濃度為40 g/L 時，花粉萌發(fā)率最高，為64.31%；蔗糖質(zhì)量濃度為60 g/L時，花粉萌發(fā)率為63.53%，且與40 g/L 間差異不顯著；蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L 時，花粉萌發(fā)率只有32.14%，與40、60 g/L 間差異極顯著。由此可以看出，高質(zhì)量濃度蔗糖能夠促進(jìn)花粉萌發(fā)，低質(zhì)量濃度的蔗糖則會抑制花粉萌發(fā)。硼酸質(zhì)量濃度為300 mg/L時，花粉萌發(fā)率最高，為52.18%；硼酸質(zhì)量濃度為150 mg/L 時，花粉萌發(fā)率為33.73%；硼酸質(zhì)量濃度為450 mg/L 時，花粉萌發(fā)率為36.86%，且150 mg/L與450 mg/L 的萌發(fā)率之間差異不顯著，而均與300 mg/L 時的萌發(fā)率差異極顯著。說明高質(zhì)量濃度的硼酸對花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用，但質(zhì)量濃度過高時對花粉萌發(fā)有抑制作用。激素配比為蔗糖40 g/L＋硼酸300 mg/L＋氯化鈣10 mg/L＋PEG 4000 15 g/L可作為綠萼梅花粉萌發(fā)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

由于花粉包含了植物父本全部基因信息，因而，它對研究植物的生殖、遺傳、進(jìn)化以及育種有著非常重要的意義。而花粉存活、生長、萌發(fā)和發(fā)育的前提是花粉活力，由此可以看出，父本花粉活力的高低是育種成敗的關(guān)鍵[11-12]?；ǚ垭x體培養(yǎng)需要一定的糖、硼酸和鈣，不同植物花粉萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基不盡相同，它們的濃度大小很大程度上影響著花粉的萌發(fā)和花粉管的生長[13]。多數(shù)植物花粉離體培養(yǎng)都需要蔗糖的作用，其主要體現(xiàn)在2 個方面：一方面蔗糖可以為花粉萌發(fā)和花粉管伸長提供營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面可以維持離體培養(yǎng)環(huán)境滲透壓的穩(wěn)定[14-15]。張彥書[16]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在適宜的溫度條件下，蔗糖瓊脂培養(yǎng)基濃度在5%～10%時，梅花的花粉萌發(fā)率最高，超過15%以上時，萌發(fā)率顯著下降。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，綠萼梅花粉在高質(zhì)量濃度蔗糖溶液（40、60 g/L）中培養(yǎng)時，萌發(fā)率顯著高于低質(zhì)量濃度（20 g/L），說明高質(zhì)量濃度蔗糖對花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用，但40、60 g/L 對萌發(fā)率影響不顯著。由于試驗(yàn)中設(shè)置的濃度梯度較少，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究更高濃度蔗糖對綠萼梅花粉萌發(fā)的影響。

在植物的生殖過程中，硼起到了重要的作用，花粉的形成、花粉管的萌發(fā)以及受精過程都與硼密切相關(guān)[17]。硼酸作為微量元素雖對花粉的萌發(fā)具有促進(jìn)作用，但不是越多越好[18]。在花粉萌發(fā)過程中，硼酸的濃度對花粉萌發(fā)的影響很大，主要原因在于一方面硼酸有助于形成細(xì)胞外的Ca2+濃度梯度，另一方面硼酸可以加強(qiáng)對糖類的吸收[19]。李娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硼酸的質(zhì)量濃度為300 mg/L 時，溲疏的花粉萌發(fā)率最高，當(dāng)硼酸質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時，花粉萌發(fā)率開始降低。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

PEG 是一種高分子滲透劑，能使花粉內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改變膜表面的電荷，使膜的柔軟程度和通透性提高，從而促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長[21]。不同濃度的PEG 所起的效果是不同的，濃度過高或過低均不利于花粉萌發(fā)生長。趙宏波等[3]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PEG 4000 質(zhì)量濃度為200 g/L 時，梅花花粉離體萌發(fā)率最高，質(zhì)量濃度過高或過低均不利于花粉的萌發(fā)。張紹鈴等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PEG 4000 對花粉萌發(fā)及花粉管生長的促進(jìn)效果最大，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加PEG 4000 時，果梅花粉萌發(fā)率較低，花粉管伸長長度較短。本研究結(jié)果表明，PEG 4000 可以促進(jìn)花粉萌發(fā)，但是不同濃度之間差異不顯著。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖和硼酸對綠萼梅花粉萌發(fā)率有極顯著影響，氯化鈣和PEG 4000 對綠萼梅花粉萌發(fā)率影響不顯著；最適宜梅花花粉萌發(fā)的激素配比為蔗糖40 g/L＋硼酸300 mg/L＋氯化鈣10 mg/L＋PEG 4000 15 g/L；高濃度的蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用，但濃度過高會抑制花粉萌發(fā)。因此，為了提高以綠萼梅為父本的授粉坐果率，若采用人工噴霧的方法進(jìn)行授粉，可在溶液中添加一定濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣和PEG 4000 等，這樣更有利于節(jié)省花粉和提高授粉效果。