核桃葉片多酚類物質積累及相關酶活性分析

王玉瓊，劉群龍，牛鐵荃

（山西農業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801）

核桃不僅營養(yǎng)豐富，而且風味獨特，所以成為四大干果之首，是堅果類果樹的重要樹種，也是油料樹種，其種子、樹皮、青皮、葉片被廣泛應用于制藥業(yè)和化妝品產業(yè)[1-2]。醫(yī)學工作者認為，核桃葉可治療出汗、皮膚病、潰瘍，同時防止出血、預防瀉、能趕蟲，這主要得益于其富含的酚酸[3]、類黃酮、萘醌等多酚類物質。以往對核桃種群中的Lara、Franquette、Marbot、Mayette 等品種以及西南地區(qū)的鐵核桃進行了多酚類物質的研究[1，4]，而對黃土高原栽植的中林5 號、香玲、禮品1 號、禮品2 號未見報道。

本試驗選取4 個山西省農業(yè)科學院果樹研究所栽植核桃品種（中林5 號、香玲、禮品1 號、禮品2 號）為試材，采用動態(tài)取樣的方法[5]，研究葉片發(fā)育進程中各類單體酚的含量變化及相關酶活性的變化，以明確核桃葉片在不同發(fā)育時期多酚類物質積累與相關代謝酶活性的關系，為合理調控多酚類物質積累和提高核桃相關代謝酶活性奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試核桃品種為中林5 號、香玲、禮品1 號、禮品2 號，樹齡20 a（盛果期）。

1.2 試驗方法

試材于2018 年5—9 月在山西省農業(yè)科學院果樹研究所（37.35°N，112.51°E）采集。4 個品種的核桃分別于5 月25 日、7 月5 日、8 月18 日、9 月4 日對生長在樹冠中的外圍枝條復葉接近的基部葉片進行采集，用裝有冰塊的泡沫盒快速拿回實驗室，分樣并進行液氮冷凍，之后于-80 ℃的冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?，并在液氮環(huán)境下進行研磨。

1.2.1 核桃葉片中多酚類物質的提取 稱取0.5 g研磨好的核桃葉片，加入10 mL 體積分數(shù)為50%的甲醇水溶液，研磨成勻漿，放置在50 ℃、40 kHz 的超聲波中提取40 min。提取液經12 000 r/min 離心10 min，即得多酚提取液。置于4 ℃下冷藏備用。

1.2.2 高效液相色譜測定核桃葉片單體酚 用0.22 μm 濾膜對多酚提取液進行過濾，自動裝置進樣。色譜條作為：色譜儀（UltiMate UltiMate 3000），Venusll ASB C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）[6]。0.8%乙酸作為流動相A，色譜甲醇作流動相B，柱溫為25℃，進樣為10μL，流速為0.9mL/min。采用2 種梯度洗脫方法，分別是：方法1（測核桃葉片中的沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸）.0～10 min，10%～20%B；10～25 min，20%～50%B；25～35 min，50%B；35 ～40 min，50%～55%B；40 ～45 min，55%～10%B；檢測波長為280 nm；方法2（測核桃葉片中的丁香酸、丁香醛、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、楊梅素、胡桃醌、槲皮素）.0～10 min，10%～40%B；10～25 min，40%～60%B；25 ～35 min，60%～80%B；35～45 min，80%～10%B；檢測波長為251 nm[7]。

1.2.3 酶標儀測定核桃葉片酶活性 采用酶標儀、酶聯(lián)免疫試劑盒對3-脫氧-阿拉伯庚酮酸糖-7-磷酸合酶（DAHPS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、分支酸變位酶（CM）、檸檬酸合酶（CS）、查爾酮合成酶（CHS）活性進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2010 和SPSS 23.0 進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 核桃葉片中多酚含量動態(tài)變化和組成分析

不同品種核桃各單體酚含量間存在差異[8]。由表1 可知，沒食子酸含量由高到低為：禮品2 號＞中林5 號＞香玲＞禮品1 號；綠原酸、咖啡酸、丁香酸含量由高到低為：中林5 號＞禮品1 號＞香玲＞禮品2 號；丁香醛含量由高到低為：禮品2 號＞禮品1 號＞香玲＞中林5 號；兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素含量由高到低為：中林5 號＞禮品1 號＞禮品2 號＞香玲；對香豆酸含量由高到低為：中林5 號＞香玲＞禮品1 號＞禮品2 號；阿魏酸、胡桃醌含量由高到低為：中林5 號＞禮品2 號＞香玲＞禮品1 號。

核桃在不同時期各單體酚的含量存在顯著差異。由表1 可知，在中林5 號核桃葉片中，兒茶素、蘆丁的平均含量較高，分別為2 280.90、2 266.40 μg/g；丁香醛和沒食子酸的平均含量較低，分別為19.91、41.43 μg/g。12 種單體酚[9]分別表現(xiàn)出3 種變化趨勢。沒食子酸、綠原酸、兒茶素、丁香酸、咖啡酸、胡桃醌、對香豆酸、槲皮素的含量呈現(xiàn)先下降再升高，最后下降的趨勢；阿魏酸、丁香醛的含量呈“N”型變化趨勢；蘆丁和楊梅素呈前期一直升高，最后下降的趨勢。在香玲核桃葉片中，蘆丁的平均含量最高，其次為兒茶素，分別是1 628.21、1 002.20 μg/g；平均含量較低的是丁香醛和沒食子酸，分別為27.27、30.74 μg/g。12 種單體酚也表現(xiàn)出3 種變化趨勢。沒食子酸、蘆丁、綠原酸、楊梅素的含量呈現(xiàn)先下降再升高最后下降的趨勢；咖啡酸、丁香醛、丁香酸、阿魏酸、對香豆酸、胡桃醌[10]的含量呈先下降，然后一直升高的“√”型變化趨勢；兒茶素的含量在整個發(fā)育過程中一直升高；蘆丁的含量在5 月與9 月之間相差不大。在禮品1 號核桃葉片中，蘆丁的平均含量最高，其次是兒茶素，分別為1 996.38、1 281.80 μg/g；平均含量較低的是丁香醛和沒食子酸，分別為29.92、30.43 μg/g。不同于以上2 個品種的核桃，在禮品1 號核桃葉片中12 種單體酚表現(xiàn)出了5 種變化趨勢。沒食子酸、綠原酸、蘆丁、胡桃醌的含量呈現(xiàn)先下降再升高最后下降的趨勢；咖啡酸、楊梅素、丁香酸的含量呈現(xiàn)先下降，然后一直升高的“√”型變化趨勢；丁香醛、阿魏酸、對香豆酸的含量前邊一直下降，最后上升；槲皮素的含量在前期呈現(xiàn)一直上升，最后下降的趨勢；兒茶素的含量在整個發(fā)育過程中一直上升。在禮品2 號核桃葉片中，蘆丁的平均含量最高，其次是兒茶素，分別是1 922.10、1 074.69 μg/g；平均含量較低的有丁香醛、對香豆酸、丁香酸，分別為32.48、32.74、35.68 μg/g。禮品2 號核桃葉片中12 種單體酚和禮品1 號核桃葉片中12種單體酚相似，也表現(xiàn)出5 種變化趨勢。兒茶素、蘆丁、綠原酸、胡桃醌、楊梅素這5 種單體酚的含量呈現(xiàn)先下降再升高最后下降的趨勢；沒食子酸、槲皮素的含量呈先下降后一直升高的“√”型變化趨勢；咖啡酸、丁香醛的含量在前期呈現(xiàn)一直上升，最后下降的趨勢；丁香酸、對香豆酸的含量在整個發(fā)育過程中呈現(xiàn)一直上升的趨勢；阿魏酸的含量呈“N”型變化趨勢。

表1 核桃葉片發(fā)育過程中單體酚含量動態(tài)變化 μg/g

從表1 可以看出，沒食子酸的含量在核桃葉片 的整個發(fā)育周期中含量偏低，7 月5 日的葉片中，儀器已檢測不到它的存在；在9 月4 日，中林5 號、禮品1 號葉片中未見到有沒食子酸存在。兒茶素在核桃葉片整個發(fā)育過程中的含量偏高，并隨著時間的推移逐漸到達頂峰，8 月18 日和9 月4 日含量分別為1 831.02、1 964.97 μg/g；咖啡酸、丁香醛、槲皮素[11]含量在整個發(fā)育周期中含量較為穩(wěn)定；丁香酸在5 月25 日和9 月4 日含量較高，分別為101.67、104.16 μg/g；阿魏酸在8 月18 日含量最低，為39.10 μg/g，在9 月4 日含量最高，為109.46 μg/g；綠原酸、對香豆酸、蘆丁、楊梅素、胡桃醌的含量皆在8 月18日達到頂峰，分別為774.31、87.59、2 614.00、1 255.58、619.07 μg/g。

綜上可得，核桃葉片多酚類物質的含量在其生長周期呈現(xiàn)大致的變化規(guī)律為：在5 月25 日至7 月5 日多酚類物質含量下降，在7 月5 日至8 月18 日表現(xiàn)出上升趨勢，在8 月18 日至9 月4 日多酚類物質有所下降。根據(jù)HPLC[5-6]鑒定出核桃葉片中含有沒食子酸、綠原酸、兒茶素、丁香酸、咖啡酸、丁香醛、阿魏酸、對香豆酸、蘆丁、胡桃醌、楊梅素、槲皮素，共12 種單體酚；含量較高的有蘆丁、兒茶素；含量較低的有沒食子酸、丁香醛等。核桃葉片中大多數(shù)單體酚在7、9 月含量較低，在5、8 月含量較高。

2.2 核桃葉片中多酚類物質的相關代謝酶活性分析

由圖1 可知，大部分酶活性隨著時間的推移而升高，活性最高的酶有3-脫氧-阿拉伯庚酮酸糖-7-磷酸合酶（DAHPS），其次是肉桂酸-4-羥化酶（C4H），最低的為檸檬酸合酶（CS）。香玲、禮品1 號的查爾酮合成酶活性在8、9 月比5、7 月多1 倍，分支酸變位酶活性種間差異很小。

2.3 酶活與多酚含量、酶活的相關性分析

表2 酶活與多酚含量的相關性分析

各種酶活性與多酚類物質含量相關性如表2所示。由表2 可知，沒食子酸、咖啡酸、兒茶素、槲皮素、阿魏酸、蘆丁、胡桃醌、楊梅素與大部分酶活性呈正相關；綠原酸、丁香醛、丁香酸、對香豆酸與大部分酶活性呈負相關。檸檬酸合酶（CS）與大部分單體酚呈負相關，其余酶活與大部分單體酚呈正相關。酶活性與單體酚含量相關關系均未達到顯著水平。

由表3 可知，酶活之間的相關關系皆為正相關，且大都達到顯著水平。DAHPS 與C4H、CHS、CM間呈極顯著正相關；C4H 與CHS、CS、CM 間呈極顯著正相關；CHS 與CM間呈極顯著正相關，與CS 呈顯著正相關。

表3 酶活之間的相關性分析

3 結論與討論

張素斌等[12]研究了乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)5 個因素對龍利葉多酚提取的影響。朱亞等[13]明確了茶多酚和溶菌酶對冷鮮肉的保鮮效果，研究了不同濃度茶多酚和溶菌酶對冷鮮肉感官品質、菌落總數(shù)和理化指標的影響。靳雙珍等[14]研究了烤煙顏色特征值的變化對多酚類物質含量的影響。葛坤等[15]研究了熱激處理對引起大花蕙蘭褐變的總酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）生理指標的影響。陳亮等[16]以西瓜枯萎病鑒別寄主，研究接種處理后西瓜葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化氫酶（CAT）活性的變化，明確了西瓜枯萎病抗性與抗氧化、次生代謝相關酶活性的關系。侯名語等[17]探討了生態(tài)環(huán)境對花生種子黃酮、多酚及兩者變化與初生代謝物脂肪、總糖含量變化的相關性。張倩茹等[18]研究了XDA-1、XDA-5、XAD-16、AB-8、LH-20 國內外5 種不同大孔樹脂對蘋果多酚的吸附規(guī)律以及XAD-16 的解吸特性。

AMARAL 等[7]研究了多酚類物質含量在6 個核桃品種葉片中的變化，結果表明，酚酸、黃酮、總酚含量在5—6 月呈下降趨勢，7 月呈上升趨勢，8—9 月又呈下降趨勢。本研究表明，核桃葉片多酚類物質含量在其生長周期呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律：5 月25 日至7 月5 日是核桃葉片的快速生長期，多酚類物質合成速率小于葉片的增長速率，所以，多酚含量呈下降趨勢；7 月5 日至8 月18 日，葉片生長處于基本停滯狀態(tài)，所以，多酚含量呈上升趨勢；8 月18 日至9 月4 日，多酚物質的含量有所下降。史斌斌等[7]研究表明，在8—9 月核桃葉片多酚含量降低可能與多酚類物質的合成及分解的平衡失調有關聯(lián)。前人研究表明，夏季葉片多酚含量迅速上升可能與強光照誘導有關。

本研究表明，12 種單體酚中含量最高的為蘆丁，其次為兒茶素，含量較低的有沒食子酸、丁香醛等。核桃葉片中大多數(shù)單體酚在7、9 月含量較低，在5、8 月含量較高。不同品種核桃間各單體酚含量存在差異。在4 個核桃品種的葉片中沒食子酸含量由高到低為：禮品2 號＞中林5 號＞香玲＞禮品1 號；綠原酸、咖啡酸、丁香酸的含量由高到低為：中林5 號＞禮品1 號＞香玲＞禮品2 號；丁香醛的含量由高到低為：禮品2 號＞禮品1 號＞香玲＞中林5 號；兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素的含量由高到低為：中林5 號＞禮品1 號＞禮品2 號＞香玲；對香豆酸的含量由高到低為：中林5 號＞香玲＞禮品1 號＞禮品2 號；阿魏酸、胡桃醌含量由高到低為：中林5 號＞禮品2 號＞香玲＞禮品1 號。本研究中大部分酶活性隨著時間的推移而升高，含量最高有3-脫氧-阿拉伯庚酮酸糖-7-磷酸合酶（DAHPS），其次是肉桂酸-4-羥化酶（C4H），最低的為檸檬酸合酶（CS）。希望可以通過對這些試驗報告數(shù)據(jù)的分析、對比與討論，為進一步深入了解核桃提供參考依據(jù)。