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      利用CNV-seq技術(shù)產(chǎn)前診斷Pallister-Killian綜合征胎兒一例

      2020-03-25 05:31:46馮暄張慶華張釧郝勝菊鄭雷王興
      國際生殖健康/計劃生育雜志 2020年2期
      關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)核型羊水

      馮暄,張慶華,張釧,郝勝菊,鄭雷,王興

      Pallister-Killian綜合征(Pallister-Killian syndrome,PKS,OMIM 601803)的臨床表現(xiàn)包括特征性顱面畸形、先天性心臟缺損、膈疝、低張力、癲癇和皮膚色素異常。1977年,Pallister等[1]在成人中首次描述了這種病。雖然發(fā)病率尚不清楚,但醫(yī)學文獻中已經(jīng)報道了100多例PKS,隨著產(chǎn)婦年齡的增加,PKS的發(fā)病率也隨之增加[2]。PKS的細胞遺傳學特點是特定組織中以嵌合體形式存在的12號短臂等臂染色體,故也稱為等臂12p綜合征或12p四體綜合征。這些異常細胞由4個12號短臂染色體組成,而不是正常存在的2個染色體。12p四體的嵌合效應(yīng)是由于額外染色體上攜帶的基因,最終導(dǎo)致顱面部、心血管、腎臟和其他系統(tǒng)異常。

      1 病例報告

      孕婦27歲,孕2產(chǎn)1,否認近親婚配,且無遺傳病家族史。未做產(chǎn)前篩查,妊娠中期四維彩色超聲提示:胎兒膈疝可能性大,主/肺動脈比例不協(xié)調(diào)。經(jīng)過產(chǎn)科醫(yī)生咨詢,簽署知情同意書后,于孕24周行羊水穿刺,抽取孕婦羊水30 mL,取其中10 mL用于高通量測序拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing,CNV-seq)檢測。其余20 mL羊水分2管,經(jīng)離心機(Eppendorf 5804R)2 000 r/min離心10 min后棄上清,取沉淀細胞,加適量羊水細胞培養(yǎng)基,接種于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8~9 d,后進行消化、染色體制片、G顯帶及核型分析。以G顯帶染色制備染色體標本。按照人類細胞遺傳學國際命名體制(2013)標準,計數(shù)20個中期分裂相,分析5個核型。胎兒羊水細胞染色體核型分析結(jié)果:47,XY,+i(12)(p10)[58]/46,XX[42],說明該樣本為12號短臂等臂染色體的嵌合體,見圖1。

      圖1 胎兒羊水培養(yǎng)染色體核型圖

      高通量測序CNV-seq法提取羊水基因組DNA,進行文庫構(gòu)建:通過片段化-連接、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)前純化、PCR擴增、PCR后純化一系列過程,利用Next Seq CN500高通量測序平臺行CNV-seq檢測,并進行測序分析,測序結(jié)果經(jīng)貝瑞基因Enliven?變異注釋系統(tǒng)標注。CNV-seq結(jié)果提示:du p(12)(p13.33p11.1)(mos),提示該樣本12號染色體p13.33-p11.1處檢測到拷貝數(shù)為3.5、片段大小為34.70 Mb的嵌合重復(fù)區(qū)域,起始位置為chr12:160001-34860000,見圖2,3。查閱Decipher數(shù)據(jù)庫(Database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resource)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、PubMed數(shù)據(jù)庫和UCSC Genome Browser(University of California Santa Cruz),該變異包含了Pallister-Killian syndrome(PKS)[OMIM:601803]的全部區(qū)域。數(shù)據(jù)庫顯示,PKS患者主要表現(xiàn)為不同程度的智力障礙和發(fā)育遲緩,特殊面容,毛發(fā)稀疏,皮膚著色異常,耳聾,癲癇,脊柱側(cè)彎,先天性髖關(guān)節(jié)脫位,指/趾畸形,新生兒肌張力減退,膈疝,先天性心臟缺陷,肺部發(fā)育不良,腎臟發(fā)育不良,喂養(yǎng)困難,腸旋轉(zhuǎn)不良,肛門異常,腹股溝疝,男性外生殖器異常等。結(jié)合羊水染色體核型分析與CNV-seq結(jié)果,該樣本確診為PKS。為明確變異來源,召回孕婦及其丈夫,進行外周血染色體核型分析。夫妻雙方G顯帶核型結(jié)果均未見異常,見圖4,說明胎兒的染色體異常為新發(fā)。

      2 討論

      圖2 孕婦及丈夫外周血染色體核型圖

      圖3 胎兒CNV-seq檢測12號染色體測序散點圖

      圖4 胎兒cnv-seq檢測12號染色體拷貝數(shù)變異圖示

      PKS可能涉及體內(nèi)的任何器官系統(tǒng)。雖然沒有可以作為PKS臨床診斷的典型畸形表現(xiàn),但依然存在著很明顯的臨床特征:①特殊面容,皮膚色素異常、粗獷面容、眼距寬、高腭弓、前額突出、短頸等;②神經(jīng)系統(tǒng):腦結(jié)構(gòu)異常、癲癇、肌張力減退;③心臟缺陷:房間隔缺損;④肺部受累:肺發(fā)育不全、膈疝;⑤胃腸道表現(xiàn)可能包括腸旋轉(zhuǎn)不良和肛門移位;⑥骨骼肌肉系統(tǒng)發(fā)育異常,包括PKS特有的生長模式,即在宮內(nèi)提示明顯的生長過度現(xiàn)象,但在出生后立即表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩;75%的PKS患者還患有一定程度的視力損傷[3]。先天性膈疝被認為是PKS典型的特征,并且經(jīng)常是出生后早期的死亡原因[4]。PKS在妊娠中期超聲中可顯示明顯的畸形,常見的畸形包括:羊水過多、膈疝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、胎兒水腫、顏面部異常、心室擴張、短肢畸形;當超聲提示羊水過多、膈疝、肢根骨短小,尤其伴有生長過度時,尤其應(yīng)考慮本病[5]。本病例中的孕婦,妊娠中期系統(tǒng)超聲提示:胎兒先天性膈疝,股骨、肱骨位于平均值的2個標準差以下、心臟移位至右側(cè)胸腔、肺/主動脈比值增大、心包積液、三尖瓣返流(少量)。符合PKS超聲指標的主要特征。

      PKS是一種散發(fā)的,罕見的染色體疾病,具有復(fù)雜的臨床表型及特殊的遺傳學特點,臨床上往往容易漏診,所以準確有效的產(chǎn)前診斷,是避免缺陷患兒出生、減輕患兒家庭和社會負擔的最佳手段。在產(chǎn)前診斷中,超聲檢查對PKS的診斷具有重要價值,當碰到羊水過大、先天性膈疝、四肢短小、過度發(fā)育的胎兒應(yīng)該高度警惕,隨著三維超聲技術(shù)的發(fā)展,胎兒面部特點的三維成像也能為PKS產(chǎn)前診斷提供更多的信息;當在臨床中遇到特征性的粗獷面容(大前額、頭發(fā)稀疏、眼間距增寬、短鼻且鼻孔前傾、鼻梁低平、人中長、頸短),重度發(fā)育遲緩、皮膚色素異常等癥狀時,臨床醫(yī)師可提出初步判斷,并且應(yīng)注意不同組織來源標本的特點,并結(jié)合多種檢測技術(shù)進行診斷。盡管PKS真實的發(fā)病率不能確定,但其是一種很罕見的遺傳病,因為癥狀相對較輕的此病患兒可能會被人們忽視,所以某些患者事實上并未在醫(yī)院留有確診記錄。因此,被確診的病例僅僅是此病癥狀相對嚴重的一些患兒。在已有的醫(yī)學文獻記錄中,僅有150多例PKS的確診病例。正是由于PKS具有特殊的細胞遺傳學特點,即異常的染色體有組織特異性,在臨床中診斷可能常會被遺漏,所以遺傳咨詢就顯得更為重要。特別是對已經(jīng)生過PKS患兒的家庭,產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢是杜絕此類患兒再次出生的唯一手段。首先,從遺傳模式來講,PKS不具有遺傳性。誘發(fā)此病的染色體變異一般是屬于父源或母源生殖細胞(精子或卵子)形成過程中發(fā)生的不確定事件。通?;颊咂渌彝コ蓡T都并沒有此病癥的患病史。細胞分裂中的反?,F(xiàn)象,醫(yī)學上常稱其為黏合現(xiàn)象,很可能會在某個生殖細胞中產(chǎn)生多余的12號短臂等臂染色體。如果此反常的生殖細胞影響到了下一代體內(nèi)細胞的基因組合,那么該新生兒體內(nèi)細胞可能會兼有12號染色體的兩份正常拷貝和多余的12號短臂等臂染色體。在胎兒的早期發(fā)育過程中,其體內(nèi)某些細胞內(nèi)并沒有多余的父源或母源12號短臂等臂染色體,而另一些細胞內(nèi)卻有。此遺傳現(xiàn)象在醫(yī)學上被稱為染色體嵌合。幾乎所有的PKS都是由于此染色體嵌合現(xiàn)象引發(fā)的。如果所有的機體細胞里都有此多余的等臂染色體的話,那么引發(fā)的PKS癥狀的嚴重程度會使患者的生存質(zhì)量大為降低。

      隨著二胎政策的全面放開,高齡孕婦不斷增加,現(xiàn)行產(chǎn)前診斷技術(shù)核型分析不能滿足臨床產(chǎn)前診斷需求,鑒于CNV-seq在臨床的不斷實踐,其憑借著檢測范圍廣、精準、通量高、成本低、操作簡便等優(yōu)勢,在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用逐步深入。2019年4月10日,國內(nèi)首個《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》(簡稱《共識》)在《中華醫(yī)學遺傳學》上刊發(fā)?!豆沧R》對CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用規(guī)范進行了詳細的闡述說明,對規(guī)范CNV-seq技術(shù)的臨床應(yīng)用,推動技術(shù)發(fā)展起到了非常重要的作用。本病例用CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前明確診斷出PKS,也進一步證實了CNV-seq技術(shù)作為一線技術(shù)應(yīng)用在臨床的效果,真實有效地評價了該技術(shù)的診斷水平。

      本病例妊娠中期超聲提示先天性膈疝、股骨短等異常,進行產(chǎn)前診斷。運用染色體G顯帶核型分析和CNV-seq技術(shù)檢測。羊水核型最初發(fā)現(xiàn)該樣本核型以嵌合形式存在1條額外標記染色體,核型結(jié)果為47,X Y,+mar[58]/46,X Y[42]。與CNV-seq結(jié)果核對之后,可以明確這條額外標記染色體的來源為12號染色體短臂,最終確定了羊水核型分析結(jié)果:47,X Y,+i(12)(p10)[58]/46,X Y[42]。這也證明了CNV-seq技術(shù)可以鑒別來源不明的胎兒標記染色體,明確其遺傳物質(zhì)的來源,對染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的診斷有重要價值。PKS患者異常的染色體有組織特異性,通常在皮膚成纖維細胞中可以檢測到異常。因此,由于PKS這種特殊的組織特異性,PKS的診斷可能經(jīng)常被遺漏,并且通常在快速分裂的細胞,如外周血淋巴細胞中未檢測到[6-7]?,F(xiàn)已報道的病例中幾乎沒有在外周淋巴細胞中診斷出異染色體i(12)(p10)的報道[8]。據(jù)不同組織中期染色體核型分析統(tǒng)計,包含異常染色體i(12)(p10)的組織中,淋巴細胞檢出率為0~2%,成纖維細胞檢出率為50%~100%,羊水細胞和骨髓細胞檢出率為100%[9]。本病例羊水細胞中i(12)(p10)占58%,羊水CNV-seq結(jié)果示12號染色體短臂重復(fù),拷貝數(shù)為3.5,一般來說,單純的染色體重復(fù),檢測到的拷貝數(shù)應(yīng)為3,但該樣本是12號短臂等臂四倍體的嵌合體,導(dǎo)致其拷貝數(shù)為3.5。說明CNV-seq技術(shù)可以精準地檢測出比例高于5%的嵌合體。綜上所述,G顯帶核型分析與CNV-seq技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,可以明確診斷PKS。

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