利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析軍曹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性*

李偉強(qiáng) 陳 剛 馬 騫 黃建盛 施 鋼 潘傳豪 周 暉 謝瑞濤,2 張健東 湯保貴

利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析軍曹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性*

李偉強(qiáng)1陳 剛1①馬 騫1①黃建盛1施 鋼1潘傳豪1周 暉1謝瑞濤1,2張健東1湯保貴1

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088；2. 廣東恒興集團(tuán)有限公司 湛江 524000)

利用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)北海(BH)、陵水(LS)、硇洲(NZ)、徐聞(XW)和三亞(SY) 5個(gè)軍曹魚()養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，12對(duì)微衛(wèi)星引物在5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體中共檢測到129個(gè)等位基因。各養(yǎng)殖群體的平均等位基因數(shù)為3.833~6.750，平均有效等位基因數(shù)為2.284~3.645，平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.481~0.635和0.533~0.681，平均多態(tài)信息含量為0.463~0.630；哈迪-溫伯格平衡檢測結(jié)果顯示，各群體在多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上均顯著偏離平衡(<0.05)；軍曹魚養(yǎng)殖群體間的遺傳分化指數(shù)(st)為0.055~0.150，遺傳距離()為0.240~0.635，其中，BH和NZ的st最大(0.150)，最遠(yuǎn)(0.635)；AMOVA分析表明，軍曹魚養(yǎng)殖群體的84%遺傳變異來自于個(gè)體之間；基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，BH和SY聚為一支，LS和XW聚為一支，兩支聚為一支后與NZ聚為一支。研究結(jié)果將為軍曹魚種質(zhì)資源保護(hù)和改良等提供科學(xué)的數(shù)據(jù)參考。

軍曹魚；養(yǎng)殖群體；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

軍曹魚()，是一種暖水性遠(yuǎn)洋洄游魚類，廣泛分布于地中海、大西洋和印度–太平洋(東太平洋除外)的熱帶或亞熱帶海域(麥賢杰等, 2005)。因其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美且無肌間刺，生長速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為最具養(yǎng)殖潛力的海水魚之一(李劉冬等, 2002; Nazar, 2013)。20世紀(jì)80年代末到90年代初，臺(tái)灣最先開始軍曹魚人工養(yǎng)殖，并突破了軍曹魚的人工育苗等技術(shù)(Liao, 2004; Zhou, 2006)。1996年，廣東、海南等地開始了軍曹魚海上網(wǎng)箱養(yǎng)殖，隨后，葉富良等(2002)成功完成軍曹魚的全人工繁育，軍曹魚逐漸成為廣東、海南等地重要的海水養(yǎng)殖對(duì)象。2017年，我國軍曹魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量為43657 t，比2016年產(chǎn)量增加了17.78%，在全國海水養(yǎng)殖魚類中，軍曹魚產(chǎn)量位居第7 (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局, 2018)?，F(xiàn)有軍曹魚種質(zhì)資源的保護(hù)和遺傳改良工作，對(duì)促進(jìn)我國軍曹魚養(yǎng)殖業(yè)健康快速發(fā)展具有重要意義。

微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite)是繼限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)之后的第二代遺傳標(biāo)記。由于其在真核生物基因組中分布廣泛，遵循孟德爾分離、呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定和種群遺傳學(xué)等領(lǐng)域(Dewoody, 2000; 孫效文等, 2008)。微衛(wèi)星標(biāo)記在魚類遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用(張小谷等, 2006)，其在軍曹魚群體遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究也有諸多報(bào)道。國外學(xué)者曾利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)波斯灣和阿曼海(Aliabadi, 2008)、泰國灣(Phinchongsakuldit, 2013)、美國東海岸(Darden, 2014)、阿拉伯海和孟加拉灣(Divya, 2019)等地軍曹魚野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在天然水域中軍曹魚群體具有較高的遺傳多樣性。劉麗等(2008)、王中鐸等(2010)分別對(duì)中國南海湛江海域野生軍曹魚群體和海南、廣東和福建的軍曹魚養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，軍曹魚養(yǎng)殖群體與天然群體遺傳結(jié)構(gòu)特征基本一致，均具有較高遺傳多樣性水平。

為進(jìn)一步做好軍曹魚的選育工作，本研究選取廣東、廣西、海南的5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體為研究對(duì)象，利用12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記開展群體遺傳多樣性分析，旨在闡明軍曹魚養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，為軍曹魚良種選育、種質(zhì)資源保存和利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

軍曹魚養(yǎng)殖群體樣品包括北海養(yǎng)殖群體(BH) 30尾、陵水養(yǎng)殖群體(LS) 30尾、硇洲養(yǎng)殖群體(NZ) 30尾、徐聞養(yǎng)殖群體(XW) 20尾和三亞養(yǎng)殖群體(SY) 64尾，共計(jì)174尾。將各群體的所有個(gè)體運(yùn)回廣東海洋大學(xué)東海島養(yǎng)殖基地進(jìn)行養(yǎng)殖和保種，通過剪取少量軍曹魚尾鰭，保存在95%的乙醇中，于–40℃儲(chǔ)存，用于基因組DNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 實(shí)驗(yàn)采用Mamiatis等(1985)的“酚–氯仿”法提取軍曹魚基因組DNA，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用微量核酸分析儀測定其濃度，–40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物的篩選 軍曹魚微衛(wèi)星引物參考Renshaw等(2005)，共35對(duì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以SY的48尾軍曹魚基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和硝酸銀染液染色觀察，根據(jù)條帶情況共篩選出12對(duì)多態(tài)性引物。

1.2.3 多態(tài)性微衛(wèi)星引物擴(kuò)增和分型檢測 在初篩的12對(duì)微衛(wèi)星引物的正向引物5′端進(jìn)行M13尾巴修飾(5′-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3′或5′-GAGC-GGATAACAATTTCACAC-3′)，并合成相同序列的M13通用引物(5′端用FAM或HEX熒光基團(tuán)標(biāo)記)。以2個(gè)軍曹魚基因組DNA為模板優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，參照Schuelke (2000)三引物法對(duì)174個(gè)軍曹魚基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μl：10 × PCR Buffer 2.5 μl，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μl，酶(5 U/μl) 0.5 μl (RR001Q，TaKaRa)，M13正向引物(10 umol/L) 0.1 μl，反向引物(10 umol/L) 0.6 μl，M13通用引物(10 μmol/L) 0.6 μl，DNA模板(10~50 ng) 1 μl，無菌去離子水14.2 μl。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性4 min；94℃變性30 s，引物各自退火溫度下復(fù)性30 s，72℃延伸 30 s，27個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測后，根據(jù)條帶情況，將產(chǎn)量高且特異性強(qiáng)的PCR產(chǎn)物送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

等位基因數(shù)(a)、有效等位基因數(shù)(e)、Shannon指數(shù)()、基因流(m)、近交系數(shù)(is)、遺傳距離()和遺傳相似度()采用PopGene3.2軟件完成；運(yùn)用Cervus 3.0.7軟件(Kalinowski, 2007)計(jì)算微衛(wèi)星標(biāo)記觀測雜合度(o)、期望雜合度(e)和多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳學(xué)參數(shù)；Genepop version 4.0.7軟件進(jìn)行哈迪溫伯格(Hardy-Weinberg, HWE)檢測；FSTAT軟件計(jì)算軍曹魚群體的遺傳分化指數(shù)(st)；采用ARLEQUIN3.1軟件對(duì)各軍曹魚群體分子方差分析(AMOVA)。并基于Nei′s遺傳距離和非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)，使用MEGA6軟件構(gòu)建群體間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 位點(diǎn)多態(tài)性和群體遺傳多樣性

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠和硝酸銀染色后的條帶圖，最終篩選出12對(duì)微衛(wèi)星引物用于本研究(表1)，群體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測后送往廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行基因分型。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。12對(duì)微衛(wèi)星在5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體中共檢測到129個(gè)等位基因，其中，Rca1-D08位點(diǎn)的等位基因數(shù)最多(a=16)，Rca1B-A10和Rca1B-D09位點(diǎn)最少(a=6)；觀測雜合度(o)為0.218~0.805，平均值為0.569，期望雜合度(e)為0.514~0.844，平均值為0.710；多態(tài)信息含量(PIC)為0.451~0.826，平均值為0.671；12個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體中的近交系數(shù)(is)范圍為–0.234~0.475。

表1 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

Tab.1 Information of 12 microsatellite loci in this study

表2 12個(gè)位點(diǎn)上的遺傳多樣性參數(shù)

Tab.2 Genetic diversity indices of 12 microsatellite loci in five cultured population

表3是5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體在12個(gè)位點(diǎn)上的遺傳多樣性參數(shù)。其中，5個(gè)養(yǎng)殖群體的平均等位基因數(shù)依次為6.167、4.167、3.833、6.083和6.750；平均有效等位基因數(shù)依次為3.253、2.525、2.284、3.578和3.645；平均期望雜合度依次為0.611、0.541、0.533、0.664和0.681；平均觀測雜合度依次為0.519、0.575、0.481、0.558和0.635；平均多態(tài)信息含量依次為0.568、0.474、0.463、0.605和0.630。

表3 5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體在12個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)

Tab.3 Genetic diversity indices of 12 microsatellite loci in different cultured population

續(xù)表

注：*為顯著偏離HWE平衡，<0.05；**為極顯著偏離HWE平衡，<0.01

Note: * indicated significant deviation from HWE balance,<0.05; ** indicated significantly deviated from HWE balance,<0.01

2.2 軍曹魚養(yǎng)殖群體間的遺傳分化

5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體間的st有顯著差異(<0.05) (表4)。st的值在0.055~0.150之間，表明群體間遺傳分化程度為中等。其中，BH和NZ的st值最大為0.150，說明這2個(gè)群體間存在中等程度偏上的遺傳分化。AMOVA分析表明(表5)，在5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體中，84%的變異來自于群體內(nèi)個(gè)體之間，只有16%的變異來自群體之間。

表4 5個(gè)軍曹魚群體兩兩間的遺傳分化指數(shù)(st)

Tab.4 Genetic differentiation index (Fst) between two population of R. canadum

注：*表明差異顯著(<0.05)

Note: * indicated significant difference (<0.05)

5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體間的遺傳相似度()和遺傳距離()如表6所示，為0.530~0.787，為0.240~0.635。根據(jù)Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示，BH和SY聚為一支，LS和XW聚為一支，兩支聚為一支后又和NZ聚為一支。

3 討論

遺傳多樣性研究可為水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源的保存及遺傳改良等提供理論依據(jù)(崔朝霞等, 2011)。a、e、o和e等參數(shù)可以反映群體遺傳多樣性大小，在一定范圍內(nèi)，各參數(shù)數(shù)值越高，說明群體的基因豐富度越高，其遺傳多樣性也越高；反之，參數(shù)數(shù)值越低，則基因豐富度和遺傳多樣性越低(葉香塵等, 2019;司飛等, 2017)。本研究中，5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體的平均等位基因數(shù)為3.833~6.750，平均有效等位基因數(shù)為2.284~3.645，平均觀測雜合度為0.481~0.635，平均期望雜合度為0.533~0.681，各參數(shù)平均值均小于王中鐸等(2010)和劉麗等(2008)對(duì)養(yǎng)殖群體和野生群體的研究結(jié)果。在選取的12個(gè)位點(diǎn)中，o>e的位點(diǎn)，BH和SY各有4個(gè)、NZ有3個(gè)，XW和LS各有2個(gè)，除LS的is為–0.0741外，其他4個(gè)養(yǎng)殖群體的is均為正值。結(jié)果表明，5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性低于王中鐸等(2010)和劉麗等(2008)的研究群體，但仍具有較高的遺傳多樣性，其中，SY遺傳多樣性最高；5個(gè)養(yǎng)殖群體在12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上存在雜合子缺失或過剩、無效等位基因的現(xiàn)象。養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的降低可能與近10年軍曹魚的人工選育有關(guān)，經(jīng)過多代的人工選擇、近親交配等，導(dǎo)致軍曹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性呈現(xiàn)不同程度的降低，這與馬冬梅等(2018)和樊佳佳等(2019)對(duì)華南鯉()和大口黑鱸()不同世代選育群體的研究結(jié)果相似。

表5 5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體的AMOVA分析

Tab.5 AMOVA analysis in the five cultured population of R. canadum

表6 5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體的遺傳相似度和遺傳距離

Tab.6 Genetic identity and genetic distance of 5 cultured population of cobia

注：對(duì)角線以上為遺傳距離，對(duì)角線以下為遺傳相似度

Note: Genetic distance is above diagonal, genetic identity is below diagonal

圖1 基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的5個(gè)軍曹魚群體的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹

哈迪溫伯格檢測結(jié)果表明，BH、XW、LS、NZ、SY分別有5、5、7、7和10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了哈迪溫伯格平衡。平衡偏離可能是受近親交配等因素影響，軍曹魚養(yǎng)殖群體的基因頻率發(fā)生了較大的變化。連續(xù)多代的人工選育，導(dǎo)致軍曹魚選育群體中純合子的增加，雜合子的缺失，使其養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞。

st是反應(yīng)群體間遺傳分化程度的重要參數(shù) (陳錦豪等, 2019)。在本研究中，軍曹魚養(yǎng)殖群體間的st值介于0.055~0.150之間，根據(jù)Wright(1978)對(duì)st的劃分，除了BH和NZ (st=0.150)，其他群體間均存在中等程度的遺傳分化(0.150≥st≥0.05)。AMOVA分析結(jié)果顯示，84%的變異來自于群體內(nèi)個(gè)體之間，只有16%的變異來自群體之間。由于人為因素等條件的影響，5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體多數(shù)具有中等程度的遺傳分化，與王中鐸等(2010)的研究群體相比，群體分化程度變大。

遺傳距離()和遺傳相似度()可以用來衡量群體間的遺傳關(guān)系(宋煒等, 2017; 崔蕾等, 2012)。本研究中，SY和BH間的最小(0.240)，最大(0.787)，親緣關(guān)系最近；NZ和BH間的最大(0.635)，最小(0.530)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)?；贜ei′s遺傳距離采用UPMGA法對(duì)5個(gè)軍曹魚群體進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，BH和SY聚為一支，LS和XW聚為一支，兩支聚為一支后又和NZ聚為一支。

結(jié)果表明，5個(gè)軍曹魚養(yǎng)殖群體多數(shù)呈中等程度遺傳分化，并存在著不同程度的雜合子缺失等現(xiàn)象，與王中鐸等(2010)的研究結(jié)果相比，5個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性有不同程度的降低，但并未產(chǎn)生顯著性差異，且群體間分化程度較之前加大，各群體仍具有較高的遺傳多樣性。盡管如此，在軍曹魚人工選育過程中仍需通過引進(jìn)外來親本、收集野生群體等手段擴(kuò)大親本群體數(shù)量(王軍等, 2018)，并輔以科學(xué)的選育技術(shù)，以確保軍曹魚在人工選育多代后，仍保持較高的遺傳多樣性，這對(duì)軍曹魚種業(yè)發(fā)展及健康養(yǎng)殖具有重要意義。

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Genetic Diversity in Five Cultured Population of Cobia () Using Microsatellite Markers

LI Weiqiang1, CHEN Gang1①, MA Qian1①, HUANG Jiansheng1, SHI Gang1, PAN Chuanhao1, ZHOU Hui1, XIE Ruitao1,2, ZHANG Jiandong1, TANG Baogui1

(1. Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088; 2. Guangdong Hengxing Group Co., Ltd., Zhanjiang 524000)

Cobia,,the only species in the family Rachycentridae, is a candidate for cage culture in tropical and subtropical waters. Taiwan was the first to cage cobia in the early 1990s, and culturing of cobia has also been developed in Southeast Asia and other areas. Understanding the genetic diversity of cultured populations is important for the sustainable development and management of aquaculture.In the present study, 12 polymorphic microsatellite loci were selected to investigate and assess genetic diversity in five cultured populations of cobia from Beihai (BH), Lingshui (LS), Naozhou (NZ), Xuwen (XW), and Sanya (SY). As a result, 129 alleles were detected in the five populations. The mean number of alleles was between 3.833 and 6.750, the mean number of effective alleles ranged from 2.284 to 3.645, the mean of observed heterozygosity and expected heterozygosity was between 0.481 and 0.635, and 0.533 and 0.681, respectively, and the mean polymorphism information content ranged from 0.463 to 0.630. The population deviated significantly from a Hardy-Weinberg equilibrium at multiple microsatellite loci (<0.05). Analysis of genetic differentiation indicated that thestrange was from 0.055 to 0.150 and the genetic distance () range was from 0.240 to 0.635. BH and NZ had the highestst(0.150) and the highest(0.635). The results of an analysis of molecular variance showed that 84% of the genetic variations were within cultured populations, and 16% were among cultured populations. A phylogenetic analysis using the unweighted pair group method with arithmetic mean and based on Nei’s genetic distance showed that one cluster comprising BH and SY, and the other cluster comprising LS and XW formed a branch, which was then clustered with NZ. These results provide data for further protection and improvement of the germplasm resources of cobia.

; Culture population; Microsatellite; Genetic diversity

S917.4

A

2095-9869(2020)02-0113-08

陳 剛，教授，E-mail: cheng@gdou.edu.cn；馬 騫，副教授，E-mail: mfm_0624@163.com

2019-06-17,

2019-08-20

* 國家海水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系–軍曹魚種質(zhì)資源與品種改良崗位(CARA-47-G08)和南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江)資助項(xiàng)目(ZJW-2019-06)共同資助[This work was supported by National Technical System of Marine Fish Industry– Germplasm Resources and Variety Improvement Positions of Cobia,(CARA-47-G08), and Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory, Zhanjiang(ZJW-2019-06)]. 李偉強(qiáng)，E-mail: lwqclj@126.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190617001

http://www.yykxjz.cn/

李偉強(qiáng), 陳剛, 馬騫, 黃建盛, 施鋼, 潘傳豪, 周暉, 謝瑞濤, 張健東, 湯保貴. 利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析軍曹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(2): 113–120

Li WQ, Chen G, Ma Q, Huang JS, Shi G, Pan CH, Zhou H, Xie RT, Zhang JD, Tang BG. Genetic diversity in five cultured population of cobia () using microsatellite markers. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 113–120

CHEN Gang, E-mail: cheng@gdou.edu.cn; MA Qian, E-mail: mfm_0624@163.com

(編輯 馬璀艷)