變異豬流行性腹瀉病毒M和N雙基因融合真核表達(dá)及其活性鑒定

王隆柏　陳秋勇　吳學(xué)敏　陳如敬　車勇良　周倫江

摘要：【目的】體外表達(dá)變異豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的M-N雙基因融合蛋白并明確其生物活性，為開展PEDV新型疫苗及其診斷技術(shù)研究提供更多的候選蛋白。【方法】將變異PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2（pM2）真核表達(dá)載體構(gòu)建pM2-M真核質(zhì)粒，通過同源重組將N基因克隆至M2-M基因片段構(gòu)建pM2-M-N雙基因融合重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)出M-N雙基因融合蛋白。通過Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠試驗(yàn)鑒定表達(dá)融合蛋白的生物學(xué)活性?！窘Y(jié)果】擴(kuò)增獲得的M基因、N基因片段大小分別為678和1359 bp，且與原序列的相似性均達(dá)100.0%。將M基因和N基因并連接至pM2真核表達(dá)載體成功構(gòu)建獲得pM2-M-N雙基因融合重組質(zhì)粒，M-N雙基因片段大小為2004 bp，且與原序列的相似性為99.3%。以pM2-M-N雙基因融合重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，表達(dá)出大小約75 kD且具有免疫活性的M-N雙基因融合蛋白，純化的M-N雙基因融合蛋白能與PEDV陽性血清反應(yīng)，與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等病毒均無交叉反應(yīng);以其免疫BLAB/c小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體?！窘Y(jié)論】通過pM2真核表達(dá)載體能構(gòu)建獲得變異PEDV毒株的pM2-M-N融合雙基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可表達(dá)出具有良好免疫活性的M-N雙基因融合蛋白，為后期開展變異PEDV基因工程疫苗及其診斷技術(shù)研究提供更多的候選蛋白。

關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）;M基因;N基因;雙基因;融合蛋白

中國分類號： S852.43? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-3083-07

Abstract：【Objective】The protein of M-N double gene fusion protein plasmid of variant porcine epidemic diarrhea virus（PEDV） was expressed in vitro，and clarified the immunological activity of the protein，more candidate fusion proteins were provided to carry out research on new vaccines and diagnostic technologies for PEDV. 【Method】The M gene of variant PEDV was cloned into pEASY-Blunt M2（pM2） eukaryotic expression vector and pM2-M eukaryotic plasmid was built， then N gene was cloned into M2-M gene fragment to construct pM2-M-N double gene fusion? recombinant plasmid? by homologous recombination， and transformed into 293T cell， M-N double gene fusion protein was expressed accordingly. Biological activity of expressing fusion protein was tested by Western blotting， ELISA and immunity BLAB/c mice test. 【Result】The amplified fragments of M gene and N gene were 678 and 1359 bp respectively， and the similarities compared with the original sequence were both 100.0%. The M gene and N gene were linked into pM2 eukaryotic expression vector， and pM2-M-N double gene fusion recombinant plasmid was built. The amplified fragments of M-N double fusion genes was 2004 bp， and the similarity was compared with the original sequence was 99.3%. pM2-M-N double gene fusion recombinant plasmid transfected 239T cells， and M-N double gene fusion protein（about 75 kD） with immunological competence. The purified M-N double gene fusion protein could react with PEDV positive serum. The fusion protein had no crossreactions with porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）， pseudorabies virus（PRV）， porcine circovirus type 2（PCV2）， classical swine fever virus（CSFV） and porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The BLAB/c mice immunized by it could produce specific antibody. 【Conclusion】The pM2-M-N fusion double gene recombinant plasmid of variant PEDV can be constructed by pM2 eukaryotic expression vector， the M-N double fusion protein with immunological competence is expressed after 293T cell being transfected. More candidate fusion proteins are provided to carry out genetic engineering vaccines and diagnostic techniques for variant PEDV.

Key words： porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）; M gene; N gene; double genes; fusion protein

Foundation item： Basic Research Project of Fujian Public Welfare Research Institutes（2018R1023-4）; Fujian Mo-dern Agricultural Pig Industry Technology System Construction Project（Minnongzong〔2019〕144）

0 引言

【研究意義】豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，以發(fā)病豬嘔吐、腹瀉、脫水及發(fā)病哺乳仔豬高致死率為特征的腸道傳染病（Chang et al.，2002;楊曉宇等，2018）。PED最早于1978年在英國報道，隨后蔓延至歐洲，我國于1980年首次報道。由于商品化疫苗的廣泛使用，該病在一定程度上得到有效控制。但至2010年底，因PEDV變異，原有商品化疫苗對豬群的保護(hù)效果不佳，從而致使PED在我國再次大規(guī)模暴發(fā)流行;且2013年在墨西哥、美國及加拿大等歐美養(yǎng)豬國家也相繼再次暴發(fā)流行（Huang et al.，2013;Pasick et al，2014;Sun et al.，2016）。因此，開展PEDV變異研究，尤其對變異的結(jié)構(gòu)蛋白M和N雙基因進(jìn)行融合表達(dá)，可為進(jìn)一步研究變異PEDV新型基因工程疫苗及其診斷技術(shù)提供候選蛋白?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PEDV隸屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），其病毒核酸為正義單鏈RNA，PEDV基因組全長約28 kb（Vlasova et al.，2014），主要結(jié)構(gòu)蛋白有膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）、小膜蛋白（E）和突糖蛋白（S）（Brian and Baric，2005）。M蛋白是PEDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子組裝及出芽過程中發(fā)揮重要作用，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)抗體，并介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α干擾素，可作為新疫苗的候選抗原（Gao et al.，2007）。N蛋白在病毒結(jié)構(gòu)中屬于較大的蛋白，在感染宿主細(xì)胞內(nèi)能大量表達(dá)，豬群在感染早期即能檢測到較高水平的N蛋白抗體（Li et al.，2009;祁光宇等，2018）;此外，N蛋白是病毒主要的免疫原蛋白之一，可刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，抑制細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，還能誘導(dǎo)輔助特異性體液免疫的Th細(xì)胞增殖（Vlasova et al.，2014）。S蛋白具有B淋巴細(xì)胞抗原決定簇和宿主細(xì)胞氨肽酶受體（PAPN）的識別位點(diǎn)，對病毒的吸附、融合及侵入宿主細(xì)胞等過程起重要作用，且在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生（Mariela and Laude，1994;Yeo et al.，2003）。E蛋白決定病毒的形狀，參與病毒包膜形成和出芽過程，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雖然M基因和N基因相對較保守，但2010年底發(fā)現(xiàn)的PEDV變異毒株與經(jīng)典CV777毒株及早些年份分離獲得的毒株相比較，其氨基酸序列已發(fā)生變異，在構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹上也處于不同分支（王隆柏等，2014;胡凌等，2015;宋聰?shù)龋?016）。至今，已有利用PEDV單個基因片段成功建立ELISA抗體檢測方法，并研制出基因工程口服疫苗。姜艷平等（2008）研究表明，以原核表達(dá)的重組N蛋白作為檢測抗原在監(jiān)測PEDV感染及評價疫苗免疫效果方面具有較高的應(yīng)用價值，是代替全病毒作為檢測抗原的良好選擇。向敏等（2013）將編碼PEDV部分S蛋白的保護(hù)性抗原基因（COE）插入載真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP成功構(gòu)建獲得COE核酸疫苗。朱衛(wèi)霞等（2014）應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)PEDV的N蛋白可溶性表達(dá)，并證實(shí)該蛋白具有良好的完全抗原活性。姚作俊等（2017）基于S1蛋白成功建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。朱文姣等（2018）將COE基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-COE，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白能與抗PEDV的陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，即具有良好的免疫原性，作為免疫抗原制備的卵黃抗體具有較高抗體效價?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】M基因和N基因是PEDV疫苗研制及其診斷技術(shù)重要基因，但至今鮮見基于同源重組原理通過真核表達(dá)載體表達(dá)出PEDV M-N雙基因融合蛋白的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于同源重組原理，以PEDV變異毒株為研究對象、pEASY-Blunt M2（pM2）為真核表達(dá)載體，利用無縫拼接技術(shù)構(gòu)建M和N的雙基因質(zhì)粒并在體外表達(dá)出M-N雙基因融合蛋白，明確M-N雙基因融合蛋白的生物活性，為開展PEDV新型疫苗及其診斷技術(shù)研究提供更多的候選蛋白，也為今后開展其他融合蛋白的研究提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

RNA提取試劑盒、pM2真核表達(dá)載體、FastPfu Fly DNA聚合酶、pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit、dNTPs、TransStart? KD Plus DNA聚合酶、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞及EQKLISEEDL融合蛋白純化試劑盒等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;10%分離膠和轉(zhuǎn)印膜購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;羊抗鼠/羊抗兔HRP酶購自武漢博士德生物工程有限公司;BLAB/c小鼠購自福州吳氏實(shí)驗(yàn)動物貿(mào)易有限公司;PEDV陰性血清購自BioNote公司;變異PEDV-FJFQ2014毒株和兔抗高免血清由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

2 結(jié)果與分析

2. 1 M基因和N基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以cDNA為模板，分別進(jìn)行M基因和N基因PCR擴(kuò)增，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖1）顯示，擴(kuò)增獲得的M基因、N基因片段大小約為700和1400 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序得知，擴(kuò)增獲得的M基因、N基因片段大小分別為678和1359 bp，且與原序列的相似性均達(dá)100.0%。

2. 2 pM2-M真核質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

將M基因與pM2真核表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR鑒定M2-M陽性單克隆，結(jié)果獲得約6100 bp的片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序得知，擴(kuò)增獲得的M2-M基因片段大小為6104 bp，且與原序列的相似性為99.4%。

2. 3 pM2-M-N雙基因融合重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

將擴(kuò)增獲得的M2-M基因片段與N基因片段進(jìn)行無縫拼接，然后全部轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR鑒定M-N陽性單克隆，結(jié)果獲得約2000 bp的基因片段（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序得知，M-N雙基因片段大小為2004 bp，且與原序列的相似性為99.3%。

2. 4 融合蛋白SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

在pM2-M-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中，使用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示約在75 kD處檢測到對應(yīng)的目的蛋白條帶（圖4），而在pM2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中未檢測到對應(yīng)的目的蛋白條帶。

2. 5 融合蛋白純化結(jié)果

按EQKLISEEDL融合蛋白純化試劑盒說明對原核表達(dá)的M-N雙基因融合蛋白進(jìn)行純化，其SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，純化的M-N雙基因融合蛋白大小約75 kD（圖5），與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 6 融合蛋白表達(dá)的Western blotting鑒定結(jié)果

Western blotting鑒定結(jié)果表明，pM2-M-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的總蛋白能與變異PEDV兔抗高免血清反應(yīng)，獲得約75 kD的目的蛋白條帶（圖6），而pM2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的總蛋白檢測結(jié)果均呈陰性，進(jìn)一步說明以pM2-M-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞能表達(dá)獲得M-N雙基因融合蛋白，且具有免疫活性。

2. 7 融合蛋白免疫活性的ELISA檢測結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果（圖7）表明，純化的M-N雙基因融合蛋白與PRRSV陽性血清、PRV陽性血清、CSFV陽性血清、PCV2陽性血清及TGEV陽性血清的OD490均小于PEDV陰性血清的OD490，呈陰性，未發(fā)生交叉反應(yīng);而與PEDV陽性血清的OD490為1.354，說明純化的M-N雙基因融合蛋白能與PEDV陽性血清反應(yīng)，即具有免疫活性。

2. 8 融合蛋白免疫小鼠的抗體檢測結(jié)果

以純化的M-N雙基因融合蛋白免疫小鼠后未出現(xiàn)異常臨床癥狀。由圖8可看出，二次免疫第1 d在小鼠血清中已能檢測到特異性抗體，隨后小鼠血清抗體水平逐漸升高，至二次免疫第28 d其血清抗體水平達(dá)最高值，OD490為1.771;而陰性對照小鼠血清未檢測到相應(yīng)的抗體，表明注射純化的M-N雙基因融合蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體。

3 討論

鑒于基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，有目的地將兩段或多段編碼功能蛋白的基因首尾拼接在一起，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)后所獲得的蛋白產(chǎn)物稱為融合蛋白。當(dāng)前，融合蛋白在雙功能酶（多功能酶）、定向藥物、溶栓劑及抗菌肽等方面已得到廣泛應(yīng)用。郭建強(qiáng)等（2009）利用pStar、pShuttle-CMV和pGEM-T Easy Vector等3個載體，成功構(gòu)建出Ad-M1-HA重組腺病毒載體，并在293T細(xì)胞中表達(dá)出具有免疫原性的融合蛋白。黃小波等（2012）利用pVAX載體構(gòu)建了TGEV的pVAX-S-N真核重組質(zhì)粒，以其免疫小鼠也能產(chǎn)生特異性抗體，為TGEV基因工程疫苗研究打下了基礎(chǔ)。鑒于M蛋白和N蛋白在PEDV復(fù)制及產(chǎn)生免疫功能過程中發(fā)揮的重要作用，且至今未見表達(dá)變異PEDV毒株M-N雙基因融合蛋白的相關(guān)研究報道。因此，開展M-N雙基因融合蛋白研究可為開展PEDV新型疫苗及其診斷技術(shù)研究提供更多的候選蛋白，同時為開展其他融合蛋白的研究提供技術(shù)借鑒。

有關(guān)PEDV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的研究，姜艷平等（2008）、向敏等（2013）、朱衛(wèi)霞等（2014）、姚作俊等（2017）已成功表達(dá)出單個N蛋白和截斷的S蛋白，并建立了針對N蛋白或S蛋白的ELISA抗體檢測方法。王隆柏等（2018）利用pE2原核表達(dá)載體在Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)出PEDV的M-N融合雙基因蛋白，并證實(shí)其具有免疫活性，但該融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，因此溶解純化相對較困難。本研究選用pM2真核表達(dá)載體，利用同源重組和無縫拼接技術(shù)，將PEDV的M基因和N基因進(jìn)行融合，通過增強(qiáng)型CMV啟動子高效表達(dá)目的基因，轉(zhuǎn)化Trans 1-T1感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pM2-M-N重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞表達(dá)出M-N雙基因融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在293T細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液中均能檢測到M-N雙基因融合蛋白，易于收集和純化，且具有免疫活性。

本研究結(jié)果表明，以pM2-M-N雙基因融合重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)獲得的M-N雙基因融合蛋白具有良好免疫活性，且能誘導(dǎo)BLAB/c小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的特異性免疫抗體。通過真核系統(tǒng)表達(dá)獲得的蛋白，較利用原核載體表達(dá)出的蛋白具有天然活性，更適用于免疫功能研究。可見，M-N雙基因融合蛋白的成功表達(dá)為后期開展變異PEDV基因工程疫苗及其診斷技術(shù)研究提供更多的候選蛋白。此外，在基因連接和載體構(gòu)建方面，pM2真核表達(dá)載體兩端偶聯(lián)有拓?fù)洚悩?gòu)酶，此酶具有限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能，構(gòu)建重組質(zhì)粒時只需將真核表達(dá)載體與特異性基因片段在25 ℃下孵育5～10 min即可獲得連接產(chǎn)物，與常規(guī)真核表達(dá)方法相比，具有反應(yīng)時間短、操作簡單的特點(diǎn)，為其他病毒直接融合相鄰雙基因載體的構(gòu)建提供了技術(shù)借鑒。

4 結(jié)論

通過pM2真核表達(dá)載體能構(gòu)建獲得變異PEDV毒株的pM2-M-N融合雙基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可表達(dá)出具有良好免疫活性的M-N雙基因融合蛋白，為后期開展變異PEDV基因工程疫苗及其診斷技術(shù)研究提供更多的候選蛋白。

參考文獻(xiàn)：

郭建強(qiáng)，姚立紅，陳愛珺，徐一，賈潤清，薄洪，董婕，周劍芳，舒躍龍，張智清. 2009. 共表達(dá)甲型流感病毒M1和HA雙基因的重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定[J]. 病毒學(xué)報，25（2）：107-112. [Guo J Q，Yao L H，Chen A J，Xu Y，Jia R Q，Bo H，Dong J，Zhou J F，Shu Y L，Zhang Z Q. 2009. Construction of recombinant adenovirus co-expressing M1 and HA genes of influenza virus type A[J]. Chinese Journal of Virology，25（2）：107-112.]

胡凌，王印，楊澤曉，姚學(xué)萍，林星宇，李桂黎，彭善珍，陳平，鄔旭龍. 2015. 7株豬流行性腹瀉病毒M基因的克隆與分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，35（8）：1404-1408. [Hu L，Wang Y，Yang Z X，Yao X P，Lin X Y，Li G L，Peng S Z，Chen P，Wu X L. 2015. Cloning and sequence analysis of M gene of seven strain porcine epidemic dirrhea viruses[J]. Chinese Journal of Veterinary Sciences，35（9）：1404-1408.]

黃小波，李春松，楊恒，曹三杰，文心田，廖曉丹，張鑫淼. 2012. 攜帶豬傳染性胃腸炎病毒S/N融合雙基因的減毒沙門氏菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，43（8）：1273-1280. [Huang X B，Li C S，Yang H，Cao S J，Wen X T，Liao X D，Zhang X M. 2012. Construction and identification of attenuuuated Salmonella typhimutium harbouring S/N double fusion genes of porcine transmissible gastroen-teritis virus[J]. Acta Veterinaria et Zoorechnica Sinica，43（8）：1273-1280.]

姜艷平，葛俊偉，汪淼，劉兆磊，裴敦國，韓梓峰，李一經(jīng). 2008. 豬流行性腹瀉病毒重組核蛋白作為檢測抗原的初步應(yīng)用[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，30（8）：587-591. [Jiang Y P，Ge J W，Wang M，Liu Z L，Pei D G，Han Z F，Li Y J. 2008. Preliminary application of the recombinant nucleocapsid protein of porcine epidemic diarrhea virus LJB/03 as detecting antigen in diagnostic assays[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，30（8）：587-591.]

祁光宇，劉斌，趙興緒. 2018. 豬流行性腹瀉病毒HB2015分離株N基因表達(dá)及單克隆抗體的制備[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，34（1）：76-80. [Qi G Y，Liu B，Zhao X X. 2018. Expre-ssion of N gene of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） HB2015 strain and preparation of monoclonal antibodies against PEDV[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（1）：76-80.]

宋聰，劉寧，李美荃，石於友，李華春，高林，楊榮麗，姚俊. 2016. 豬流行性腹瀉病毒云南流行毒株N基因序列分析[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，37（5）：15-19. [Song C，Liu N，Li M Q，Shi Y Y，Li H C，Gao L，Yang R L，Yao J. 2016. Sequence analysis of N gene of porcine epidemic diarrhea virus epidemic strains in Yunnan Province[J]. Progress in Veterinary Medicine，37（5）：15-19.]

王隆柏，林裕勝，車勇良，吳學(xué)敏，陳如敬，邵良平，周倫江. 2014. 豬流行性腹瀉病毒S、N和ORF3基因的遺傳變異分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，45（11）：1830-1836. [Wang L B，Lin Y S，Che Y L，Wu X M，Chen R J，Shao L P，Zhou L J. 2014. Genetic variation analysis of S，N and ORF3 genes of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Acta Veterinariaet Zoorechnica Sinica，45（11）：1830-1836.]

王隆柏，王晨燕，吳學(xué)敏，陳秋勇，車勇良，陳如敬，周倫江. 2018. 變異豬流行性腹瀉病毒M和N融合雙基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物免疫原性分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，49（6）：1249-1255. [Wang L B，Wang C Y，Wu X M，Chen Q Y，Che Y L，Chen R J，Zhou L J. 2018. Prokaryotic expression and immunogenic analysis of the combined M and N fusion genes for variant porcine epidemic diarrhea virus[J]. Acta Veterinaria et Zoorechnica Sinica，49（6）：1249-1255.]

向敏，張潔，高其雙，盧順，陳志華，黃海軍，陶弼菲，彭霞，占才耀，夏瑜，童偉文，華娟，王連芳. 2013. 豬流行性腹瀉病毒COE核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，33（11）：1627-1630. [Xiang M，Zhang J，Gao Q S，Lu S，Chen Z H，Huang H J，Tao B F，Peng X，Zhan C Y，Xia Y，Tong W W，Hua J，Wang L F. 2013. Construction of DNA vaccine of porcine epidemic dirarrhea COE and its immunogenicity in mice[J]. Chinese Journal of Veterinary Sciences，33（11）：1627-1630.]

楊曉宇，徐雷，殷鑫歡，張繼宗，徐志文，朱玲. 2018. 豬非典型性瘟病毒與豬流行性腹瀉病毒雙重PCR方法的建立與應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，34（5）：1081-1086. [Yang X Y，Xu L，Yin X H，Zhang J Z，Xu Z W，Zhu L. 2018. Establishment and application of double PCR method between atypical porcine pestivirus and porcine epidemic diarrhea virus[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（5）：1081-1086.]

姚作俊，郝達(dá)仁，白云，顏國華，王海敏，宋勤葉，李潭清. 2017. 檢測豬流行性腹瀉病毒S1蛋白抗體的間接ELISA方法[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，48（6）：1085-1091. [Yao Z J，Hao D R，Bai Y，Yan G H，Wang H M，Song Q Y，Li T Q. 2017. Indirect ELISA for detecting antibody to porcine epidemic diarrhea virus S1 protein[J]. Acta Veterinaria et Zoorechnica Sinica，48（6）：1085-1091.]

朱衛(wèi)霞，袁萬哲，李麗敏，宋勤葉，孫泰然，李潭清. 2014. 截短豬流行性腹瀉病毒N蛋白的可溶性表達(dá)及其抗原活性[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，45（9）：1561-1566. [Zhu W X，Yuan W Z，Li L M，Song Q Y，Sun T R，Li T Q. 2014. Prokaryotic soluble expression of trunked N protein of procine epidemic diarrhea virus and its antigenic activity[J]. Acta Veterinaria et Zoorechnica Sinica，45（9）：1561-1566.]

朱文姣，常琛，朱玉虎，周國麗，尹志安，楊國慶，劉慧敏. 2018. 豬流行性腹瀉病毒coe基因的克隆表達(dá)及卵黃抗體的制備[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，52（4）：560-565. [Zhu W J，Chang C，Zhu Y H，Zhou G L，Yin Z A，Yang G Q，Liu H M. 2018. Clone and expression of coe gene and preparation of egg yolk antibody against COE of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Journal of Henan Agricultural University，52（4）：560-565.]

Brian D A，Baric R S. 2005. Coronavirus genome structure and replication[J]. Current Topics in Microbiology and Immunolgoy，287：1-30.

Chang S H，Bae J L，Kang T J，Kim J，Chung G H，Lim C W，Laude H，Yang M S，Jang Y S. 2002. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Molecules and Cells，14（2）：295-299.

Gao S Y，Zha E H，Li B X，Qiao X Y，Tan L J，Ge J W，Li Y J. 2007. High-level prokaryotic expression of envelope exterior of membrane protein of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Veterinary Microbiology，123（1-3）：187-193.

Huang Y W，Dickerman A W，Pi?eyro P，Li L，F(xiàn)ang L，Kiehne R，Opriessnig T，Meng X J. 2013. Origin，evolution，and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States[J]. mBio，4（5）：e00737-13. doi：10.1128/mBio.00737-13.

Li J Q，Liu J X，Lan X，Cheng J，Wu R，Lou Z Z，Yin X P，Li X R，Li B Y，Yang B，Li Z Y. 2009. Cloning the structure genes and expression the N gene of porcine epide-mic diarrhea virus DX[J]. Virologica Sinica，24（3）：179-186.

Mariela D，Laude H. 1994. Sequuence of the spike srotein of the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Journal of Gene-ral Virology，75（5）：1195-1200.

Pasick J，Berhane Y，Ojkic D，Maxie G，Embury-Hyatt C，Swekla K，Handel K，F(xiàn)airles J，Alexandersen S. 2014. Investigation into the role of potentially contaminated feed as a source of the first-detected outbreaks of porcine epidemic diarrhea in Canada[J]. Transboundary and Emer-ging Diseases，61（5）：397-410.

Sun D B，Wang X Y，Wei S，Chen J F，F(xiàn)eng L. 2016. Epidemiology and vaccine of porcine epdemic diarrhea virus in China：A mini-review[J]. The Journal of Veterinary Medical Science，78（3）：355-363.

Vlasova A N，Marthaler D，Wang Q H，Culhane M R，Rossow K D，Rovira A，Collins J，Saif L J. 2014. Distinct characteristics and complexevolution of PEDV strains，North America，May 2013-February 2014[J]. Emerging Infectious Diseases，20（10）：1620-1628.

Yeo S G，Hernandez M，Krell P J，Nagy E E. 2003. Cloning and sequence analysis of the spike gen of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99[J].Virus Genes，26（3）：239-246.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）