一株抗辣椒瘡痂病菌生防菌株的鑒定及其生防機(jī)制初探

詹夢(mèng)琳　陳長江　羅曉華　胡方平　蔡學(xué)清

摘要：【目的】篩選獲得對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其生防機(jī)制進(jìn)行初步探究，為辣椒瘡痂病的生物防治提供菌株資源和理論依據(jù)。【方法】以課題組構(gòu)建的內(nèi)生細(xì)菌庫中的268株菌株為研究對(duì)象，采用抑菌圈法篩選獲得辣椒瘡痂病菌的拮抗菌株;通過生理生化特性測(cè)定、16S rDNA序列和gyrB基因序列分析明確拮抗菌株的分類地位;通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)拮抗菌株的脂肽類物質(zhì)合成基因?！窘Y(jié)果】從268株內(nèi)生細(xì)菌中篩選獲得189株對(duì)辣椒瘡痂病菌具有不同拮抗效果的菌株，占篩選總菌株數(shù)的70.52%，其中菌株B10（3）對(duì)辣椒瘡痂病菌的抑菌效果最好，培養(yǎng)4 d時(shí)抑菌圈半徑為21.0 mm。綜合菌株B10（3）的生理生化特性測(cè)定、16S rDNA序列和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果，推斷該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliqufaciens）。菌株B10（3）的代謝產(chǎn)物對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用，且能擴(kuò)增出8個(gè)脂肽類物質(zhì)合成基因（ituC、yndG、srfAB、srfAA、yndJ、bmyB、bioA和fenD）的目的條帶。【結(jié)論】解淀粉芽孢桿菌菌株B10（3）對(duì)辣椒瘡痂病菌具有較好的拮抗效果，且具備合成脂肽類物質(zhì)的能力，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 辣椒瘡痂病菌;生防細(xì)菌;解淀粉芽孢桿菌;脂肽類合成基因

中圖分類號(hào)： S436.418.19;S476.19? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）12-2945-07

Abstract：【Objective】Screening out the antagonistic strains against Xanthomonas euvesicatoria，and their biological control mechanism were preliminarily explored， so as to provide strain resources for biological control against X. euvesicatoria. 【Method】There were 268 bacteria strains in endophytic bacteria library constructed by the research group. They were used to screen out the biocontrol bacterial strains against X. euvesicatoriaby inhibition zone method. And classification status of a biocontrol strain was determined by determination of physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA identification and gyrB gene sequence analysis， and PCR amplification was used to detect whether it contained lipopeptide synthesis gene. 【Result】A total of 189 strains were found to inhibit X. euvesicatoria with various levels of effects from 268 endophytic bacteria strains， accounted for 70.52 % of the total selected strains. The strain B10（3） had the best antagonistic effects， and the radius of bacteriostatic zone was 21.0 mm at 4 d of culture. Based on the physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and gyrB genes sequence analysis， the strain was identified as Bacillus amyloliqufaciens. The metabolites of this strain had antagonistic effect on X. euvesicatoria， and it could amplify 8 target bands of lipopeptide synthesis genes（ituC，yndG，srfAB，srfAA，yndJ，bmyB，bioA and fenD）. 【Conclusion】The strain B10（3） of B. amyloliqufaciens has good antagonistic effect on X.euvesicatoriawith the ability to synthesize lipopeptide，it has a good potential application prospect.

Key words： Xanthomonas euvesicatoria; biocontrol bacteria; Bacillus amyloliqufaciens; lipopeptide synthesis gene

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201106-02）; Science and Techno-logy Innovation Project of Fujian Agriculture and Forestry University（KFA17541A）

0 引言

【研究意義】由植物病原菌Xanthomonas euvesicatoria引起的辣椒瘡痂病（即辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)?。┧追Q皰病、三落病，是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的一種辣椒病害，該病害不僅大幅降低辣椒的產(chǎn)量，且嚴(yán)重影響辣椒的果實(shí)品質(zhì)，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失（Jones et al.，2004;龍玲等，2009;陳新等，2011）。目前對(duì)該病害主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治（楊子祥等，2014），但近年來由于化學(xué)防治帶來的農(nóng)藥殘留、病菌抗藥性和環(huán)境污染等問題，使得科研工作者不斷地尋找更安全有效的防治途徑，而生物防治因具有安全、有效和無污染等優(yōu)勢(shì)成為目前的研究熱點(diǎn)（楊海蓮等，2000;楊光偉等，2015）。因此，開展對(duì)辣椒瘡痂病菌拮抗細(xì)菌的篩選及其生防機(jī)制研究，對(duì)保障辣椒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)于茄科作物細(xì)菌性瘡痂病的生物防治已有一些研究報(bào)道，針對(duì)瘡痂病菌的生物防治方法主要有利用生防細(xì)菌（Byrne et al.，2004）、植物根際促生菌（Ji et al.，2005）、噬菌體（Iriarte et al.，2007）和病原h(huán)rp突變菌株（Moss et al.，2007）等。其中，關(guān)于生防細(xì)菌的研究報(bào)道，Byrne等（2004）利用丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）、惡臭假單胞菌（P. putida）和熒光假單胞菌（P. fluorescens）等對(duì)番茄瘡痂病進(jìn)行溫室和大田防治試驗(yàn)，結(jié)果顯示丁香假單胞菌Cit7在田間的防治效果最好，可將病害發(fā)生嚴(yán)重程度降低28.9%;El-Hendawy等（2005）利用水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）對(duì)番茄的種子、葉片、根系和土壤進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)該菌可降低番茄瘡痂病的發(fā)病程度，并對(duì)植株生長有一定促進(jìn)作用;趙聰（2014）通過平板對(duì)峙試驗(yàn)、離體生防試驗(yàn)和溫室盆栽防病試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliqufaciens）Hy-7和Z2-13的脂肽類粗提物對(duì)辣椒瘡痂病菌具有明顯的抑制作用且具有良好生防效果;Chandrasekaran等（2019）通過維生素B6生物合成相關(guān)基因的表達(dá)譜分析和盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）CBR05可作為系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)番茄維生素B6的生物合成，進(jìn)而提高番茄對(duì)瘡痂病菌的抗病性。國內(nèi)關(guān)于篩選辣椒瘡痂病拮抗細(xì)菌及其機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道并不多見?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】辣椒瘡痂病是影響辣椒種植的重要病害之一，近年來由于化學(xué)防治帶來的病菌抗藥性及環(huán)境污染等問題，人們急需尋找新的替代方法，但目前有關(guān)辣椒瘡痂病拮抗菌的報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在本課題組構(gòu)建的內(nèi)生細(xì)菌庫基礎(chǔ)上，通過抑菌圈法篩選辣椒瘡痂病菌的拮抗生防細(xì)菌，繼而對(duì)具有較好抑菌效果的菌株進(jìn)行常規(guī)和分子生物學(xué)鑒定，并探討其拮抗機(jī)制，旨在獲得對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗效果的生防菌株，為辣椒瘡痂病的生物防治提供菌株資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 辣椒瘡痂病菌（X. euvesicatoria）及268株內(nèi)生細(xì)菌菌株（包括解淀粉芽孢桿菌Hy-7）均由福建農(nóng)林大學(xué)植物細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室分離和保存;枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株BS168由福建農(nóng)林大學(xué)植物細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室保存。

1. 1. 2 供試引物 16S rDNA基因通用引物，參照Lane（1991）;gyrB基因引物，參照Yamamoto和Harayama（1995）;脂肽類物質(zhì)合成基因檢測(cè)引物，參照J(rèn)oshi和McSpadden Gardener（2006）。具體見表1。

1. 2 生防菌株篩選

采用抑菌圈法（洪鵬翔等，2007）進(jìn)行篩選。

1. 3 生防菌株鑒定

1. 3. 1 生理生化測(cè)定 以枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株BS168為對(duì)照菌株，革蘭氏染色反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)性測(cè)定、硝酸還原反應(yīng)、耐鹽性測(cè)定、丙二酸鹽和檸檬酸鹽利用測(cè)定、過氧化氫酶測(cè)定、淀粉水解酶測(cè)定、甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)參照方中達(dá)（1998）的方法，V-P試驗(yàn)參照東秀珠和蔡妙英（2001）方法，糖醇類物質(zhì)利用測(cè)定參照Huang等（2012）的方法。

1. 3. 2 16S rDNA序列和gyrB基因序列分析 參照Lane（1991）的方法進(jìn)行16S rDNA基因鑒定;參照Yamamoto和Harayama（1995）的方法進(jìn)行g(shù)yrB基因分析。以供試菌株的總DNA為模板，分別用16S rDNA的通用引物和gyrB基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在凝膠成像儀下觀察擴(kuò)增結(jié)果，將條帶大小正確的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析。選取同源性最近的序列及相關(guān)的模式菌株序列，用MEGA 7.0進(jìn)行比對(duì)分析，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用最大似然法（Maximum-likelihood，ML）構(gòu)建gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 4 生防菌株的生防機(jī)制測(cè)定

1. 4. 1 生防菌株代謝產(chǎn)物對(duì)辣椒瘡痂病菌的拮抗作用 采用牛津杯法（許英梅等，2018）進(jìn)行測(cè)定。

1. 4. 2 脂肽類物質(zhì)合成基因檢測(cè) 以解淀粉芽孢桿菌菌株Hy-7為陽性對(duì)照（楊瑞先等，2013），參照J(rèn)oshi和McSpadden Gardener（2006）的方法，通過脂肽類物質(zhì)合成基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2. 1 辣椒瘡痂病菌生防菌株篩選結(jié)果

2. 1. 1 生防菌株對(duì)辣椒瘡痂病菌的抑制作用 通過抑菌圈法篩選對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用的菌株，結(jié)果表明，從供試的268株細(xì)菌菌株中獲得189株對(duì)辣椒瘡痂病菌具有不同拮抗效果的菌株，占篩選總菌株數(shù)的70.52%，無拮抗效果的菌株79株，占篩選總菌株數(shù)的29.48%。其中抑菌圈半徑（r）≥20 mm的菌株14株，占篩選總菌株數(shù)的5.22%，抑菌圈半徑在5～20 mm的菌株138株，占篩選總菌株數(shù)的51.49%。

對(duì)抑菌圈半徑≥20 mm的14株菌株進(jìn)一步復(fù)篩（生防細(xì)菌懸浮液OD600≈0.9，病原菌懸浮液OD600≈1.5），結(jié)果（表2和圖1）顯示，供試菌株的抑菌圈半徑隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增大，當(dāng)培養(yǎng)4 d時(shí)，菌株B10（3）的抑菌圈半徑最大，為21.0 mm。因此，選取菌株B10（3）進(jìn)行鑒定并初步探討其生防機(jī)理。

2. 2 生防菌株鑒定結(jié)果

2. 2. 1 生理生化測(cè)定 由表3可知，菌株B10（3）為革蘭氏陽性菌，具有運(yùn)動(dòng)性，能利用海藻糖、麥芽糖、甜醇、山梨醇、甘露醇、丙三醇、丙二酸鹽和檸檬酸鹽，硝酸還原反應(yīng)、淀粉水解酶測(cè)定、過氧化氫酶測(cè)定和V-P試驗(yàn)為陽性，甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)為陰性，耐鹽性7%。菌株B10（3）的生理生化測(cè)定結(jié)果除耐鹽性外均與對(duì)照菌株BS168一致，推測(cè)菌株B10（3）屬于芽孢桿菌屬。

2. 2. 2 16S rDNA序列和gyrB基因序列分析 對(duì)供試菌株B10（3）的16S rDNA基因和gyrB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定分析，獲得供試菌株的16S rDNA基因和gyrB基因的核苷酸序列長度分別為1506和1206 bp，與目標(biāo)條帶大小一致。將供試菌株的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行在線同源性比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株與解淀粉芽孢桿菌的相似性在99%以上。利用MEGA 7.0分別采用NJ法和ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2和圖3）顯示，菌株B10（3）與芽孢桿菌屬的B. amyloliqufaciens聚成一支，推斷該菌株為解淀粉芽孢桿菌屬（B. amyloliqufaciens）。

2. 3 生防菌株脂肽類合成基因擴(kuò)增結(jié)果

牛津杯法測(cè)定結(jié)果表明，生防菌株B10（3）的代謝產(chǎn)物對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用，接種后2 d，菌株B10（3）代謝產(chǎn)物的抑菌圈半徑約為5.0 mm。進(jìn)一步通過脂肽類合成基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)菌株B10（3）是否具備合成脂肽類物質(zhì)的能力。以解淀粉芽孢桿菌菌株Hy-7為陽性對(duì)照，脂肽類合成基因ituC（575 bp）、yndG（372 bp）、srfAB（308 bp）、srfAA（273 bp）、yndJ（212 bp）、bmyB（395 bp）、bioA（210 bp）和fenD（293 bp）的特異性引物擴(kuò)增結(jié)果（圖4）顯示，菌株B10（3）均可擴(kuò)增到對(duì)應(yīng)的基因片段，由此推斷該菌株具備合成脂肽類物質(zhì)的能力。

3 討論

植物內(nèi)生細(xì)菌具有穩(wěn)定性高、生物作用時(shí)效性長、可作為外源基因載體等優(yōu)點(diǎn)（楊海蓮等，2000;蔡學(xué)清等，2012），是一類具有巨大潛力的植物病害生防資源菌。近年的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細(xì)菌的種類主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）等（喻江等，2015），其中，芽孢桿菌屬的細(xì)菌具有生長繁殖速度快、耐熱性及抗逆性等優(yōu)點(diǎn)，是一種相對(duì)理想的生防細(xì)菌（朱玥妍等，2012）。本研究篩選獲得的植物內(nèi)生生防細(xì)菌B10（3）為解淀粉芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌是目前作為生防芽孢桿菌進(jìn)行研究和開發(fā)的主要菌種之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。

已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌對(duì)柑橘潰瘍病、西瓜細(xì)菌性果斑病、辣椒瘡痂病、花生白絹病和黃瓜枯萎病等多種植物病害均具有良好的防治效果（孫燕霞等，2010;趙聰，2014; 陸燕等，2016 ），其主要抑菌活性物質(zhì)有抑菌蛋白、脂肽類物質(zhì)和聚酮化合物等（吳一晶等，2012），其中脂肽類抗生素包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和豐原素（Fengycin）等（Koumoutsi et al.，2004）。Grady等（2019）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌9D-6產(chǎn)生的表面活性素、Medeot等（2019）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌MEP218產(chǎn)生的豐原素均對(duì)瘡痂病菌具有明顯的抑制作用，但Hossain等（2015）研究發(fā)現(xiàn)srfAA基因控制合成的表面活性素并不是解淀粉芽孢桿菌菌株AP193起拮抗作用的脂肽類物質(zhì)，說明并非所有種類的脂肽類物質(zhì)均具有良好的拮抗效果。本研究通過牛津杯法證明菌株B10（3）的代謝產(chǎn)物對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗作用，且可擴(kuò)增獲得8種脂肽類物質(zhì)合成基因的特異性條帶，其中包括控制合成表面活性素、伊枯草菌素和豐原素等的相關(guān)基因，表明該菌株可能通過合成脂肽類物質(zhì)抑制辣椒瘡痂病菌的生長，但具體是哪類物質(zhì)、或是其中一種或幾種物質(zhì)協(xié)同作用，需進(jìn)一步探究。

目前對(duì)辣椒瘡痂病具有較好防效的解淀粉芽孢桿菌菌株報(bào)道依舊很少，篩選以獲得對(duì)辣椒瘡痂病具有防效的生防細(xì)菌是實(shí)現(xiàn)該病害生物防治的前提。本研究篩選獲得的菌株B10（3）具有較好的抑菌作用，有望為辣椒瘡痂病的生物防治提供菌種資源，但有研究表明，室內(nèi)平板的拮抗作用與田間的防效并非都成正相關(guān)（Nagendra et al.，2019），因而本研究獲得的菌株B10（3）對(duì)于辣椒瘡痂病的溫室及大田防治效果尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究在課題組構(gòu)建的植物內(nèi)生細(xì)菌庫中通過抑菌圈法篩選獲得1株對(duì)辣椒瘡痂病菌具有拮抗效果的生防菌株B10（3），通過革蘭氏染色、生理生化測(cè)定和分子生物學(xué)方法將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌，該菌株可擴(kuò)增到8個(gè)脂肽類物質(zhì)合成基因目的條帶，具備合成脂肽類物質(zhì)的能力，具有良好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）