抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)幾種除草劑的耐受性檢測(cè)

陳景超　崔海蘭　郭勇　陳萍萍　黃松濤　彭立存　李香菊

摘要：為明確抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)靶標(biāo)除草劑草甘膦及幾種常見(jiàn)除草劑的耐受性水平，在溫室隔離條件下培養(yǎng)ZH10-6及其受體大豆中黃10，分別對(duì)其噴施不同濃度的莖葉處理劑草甘膦、乙羧氟草醚、精喹禾靈、2，4-滴二甲胺鹽和土壤處理劑乙草胺，并對(duì)其藥害癥狀、株高、干重等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)靶標(biāo)除草劑草甘膦具有較高的耐受性，在3 600 g a.i. /hm2處理后28 d，株高、干重與對(duì)照無(wú)顯著差異。而受體大豆中黃10在草甘膦900 g a.i. /hm2處理后14 d全部死亡。ZH10-6對(duì)大豆田常用除草劑乙羧氟草醚、精喹禾靈和乙草胺也有良好的耐受性，耐受性水平與中黃10無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6及其受體大豆中黃10對(duì)2，4-滴二甲胺鹽均表現(xiàn)敏感。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6;草甘膦;常規(guī)除草劑;耐受性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q142文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1003-935X（2020）04-0026-05

Tolerance of Transgenic Glyphosate-Resistant Soybean ZH10-6 to Herbicides

CHEN Jing-chao1，CUI Hai-lan1，GUO Yong2，CHEN Ping-ping1，HUANG Song-tao1，PENG Li-cun1，LI Xiang-ju1

（1.Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agriculture Science，Beijing 100193，China;

2.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：To determine the tolerance of glyphosate-resistant soybean ZH10-6 to conventional herbicides，soybean ZH10-6 and its receptor line soybean ZH10 were sprayed with the foliage-applied herbicides，glyphosate，fluoroglycofen-ethyl，quizalofop-p-ethyl，2，4-D （dimethylamine salt） at different doses and soil disinfectants under isolated culture conditions in the greenhouse. Based on the development of phytotoxicity symptoms and plant height and dry weight determinations，transgenic soybean ZH10-6 was highly tolerant to the target herbicide，glyphosate. Plants treated with glyphosate at 3 600 g a.i./hm2 were similar in height and dry weight to those untreated at 28 days after application. Conversely，all ZH10 plants died 14 days after treatment with 900 g a.i./hm2 glyphosate. Transgenic soybean ZH10-6 was also tolerant to fluoroglycofen-ethyl，quizalofop-p-ethyl and acetochlor，with no

significant difference from ZH10. Both transgenic soybean ZH10-6 and its receptor soybean ZH10 were sensitive to 2，4-D dimethylamine salt.

Key words：transgenic soybean ZH10-6;glyphosate;conventional herbicide;tolerance

我國(guó)是大豆（Glycine max）的起源地之一，大豆的脂類(lèi)及蛋白質(zhì)的含量較高，食用方式多種多樣，在我國(guó)居民的飲食結(jié)構(gòu)中占重要的地位[1]。20世紀(jì)90年代，我國(guó)對(duì)大豆的需求量猛增，而國(guó)內(nèi)大豆因成本高、產(chǎn)量低等原因種植面積逐漸縮小，大豆年產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需求，常年依賴(lài)進(jìn)口[2]。國(guó)內(nèi)大豆種植面積不斷縮小以及對(duì)進(jìn)口大豆的高度依賴(lài)對(duì)我國(guó)的糧食安全產(chǎn)生了潛在的威脅。雜草是造成大豆減產(chǎn)和品質(zhì)降低的有害生物之一，人工除草等傳統(tǒng)除草方式提高了大豆的生產(chǎn)成本[3]，而化學(xué)除草劑的使用節(jié)省了除草成本，提高了除草效率。目前大豆田常用的除草劑有二苯醚類(lèi)、苯氧羧酸類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)等除草劑。這些除草劑種類(lèi)較多，作用方式多樣，對(duì)使用技術(shù)要求較高。在應(yīng)用過(guò)程中噴霧質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，或者盲目追求藥效，高量或超量使用除草劑的現(xiàn)象較為常見(jiàn)，這導(dǎo)致田間除草效果差、除草劑藥害等問(wèn)題頻發(fā)[4-5]。草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型、滅生性除草劑，雖然該除草劑具有環(huán)境友好、高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但它對(duì)常規(guī)大豆同樣具有滅殺作用，目前很難應(yīng)用于大豆田。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以使大豆對(duì)特定除草劑產(chǎn)生耐受性，這不僅可以充分利用優(yōu)良除草劑防除大豆田間雜草，提高產(chǎn)量，還能簡(jiǎn)化田間雜草管理，降低成本，增加收益?？钩輨┺D(zhuǎn)基因大豆于1996年開(kāi)始商業(yè)化種植，到2018年全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積為9 590萬(wàn)hm2，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%[6-8]。近年來(lái)，我國(guó)轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究取得了快速發(fā)展，產(chǎn)生了一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的耐除草劑大豆新品種[9-11]。抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)靶標(biāo)除草劑耐受性水平是評(píng)價(jià)其性狀的重要指標(biāo)之一。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因大豆推廣釋放之后可能帶來(lái)的基因漂移等環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)以及雜草抗藥性等問(wèn)題也備受關(guān)注。種植于加拿大的抗除草劑轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）發(fā)生了品種之間的基因漂移，產(chǎn)生了對(duì)草甘膦、草銨膦和咪唑啉類(lèi)除草劑同時(shí)具有抗藥性的油菜自生苗[12]。抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆在美國(guó)等國(guó)家的大面積種植，使草甘膦的使用量及頻率顯著增加，抗草甘膦雜草的問(wèn)題也比較突出[13]。大豆田常規(guī)除草劑在抗草甘膦等轉(zhuǎn)基因大豆田的合理使用可以有效延緩和治理抗性雜草的產(chǎn)生。大豆敏感的除草劑能否有效滅殺轉(zhuǎn)基因大豆，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆雜草化等環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)對(duì)至關(guān)重要。因此，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆對(duì)非靶標(biāo)除草劑的敏感性及其環(huán)境安全評(píng)估與推廣應(yīng)用具有重要的意義。

轉(zhuǎn)G2-EPSPS和GAT基因抗草甘膦大豆ZH10-6是我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆材料，但該品種對(duì)靶標(biāo)及非靶標(biāo)除草劑的耐受性水平的相關(guān)報(bào)道較少。本研究在溫室隔離條件下檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6及其受體大豆中黃10對(duì)靶標(biāo)除草劑草甘膦以及乙草胺等非靶標(biāo)除草劑的耐受性水平，為轉(zhuǎn)G2-EPSPS和GAT基因抗草甘膦大豆ZH10-6的商業(yè)化應(yīng)用及環(huán)境安全評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的大豆材料分別為轉(zhuǎn)G2-EPSPS和GAT雙價(jià)基因大豆ZH10-6及其非轉(zhuǎn)基因受體大豆中黃10。ZH10-6是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)法，將含有G2-EPSPS和GAT基因表達(dá)框的載體轉(zhuǎn)化大豆品種中黃10，獲得的耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆新品系。2種供試大豆均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，種子質(zhì)量均不低于GB 4404.2—2010《糧食作物種子 豆類(lèi)》二級(jí)豆類(lèi)種子標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 供試藥劑

靶標(biāo)除草劑為草甘膦;非靶標(biāo)除草劑包括大豆田常用的土壤處理劑（乙草胺）、莖葉處理劑（乙羧氟草醚、精喹禾靈）以及大豆敏感的除草劑（2，4-滴二甲胺鹽）。除草劑劑型和生產(chǎn)廠家分別是：41%草甘膦異丙胺鹽水劑，德國(guó)拜耳公司;90%乙草胺乳油，南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司;15%乙羧氟草醚乳油，遼寧省沈陽(yáng)市和田化工有限公司;5%精喹禾靈乳油，中農(nóng)立華（天津）農(nóng)用化學(xué)品有限公司;720 g/L 2，4-滴二甲胺鹽水劑，江蘇永泰豐作物科學(xué)有限公司。

1.3 大豆培養(yǎng)與藥劑處理

泥炭土（丹麥品氏）與有機(jī)肥（凱茵，有機(jī)質(zhì)含量≥15%，N、P、K總含量≥0.88%，pH值7～7.5）按照體積比3 ∶1混合均勻，定量裝入塑料花盆中，挑選健康飽滿(mǎn)、大小一致上述大豆種子播種。其中，莖葉處理的大豆播種20粒/盆，發(fā)芽后保留生長(zhǎng)一致的大豆15株/盆，土壤處理的大豆播種15株/盆。所有大豆在具備補(bǔ)光燈的日光常溫（25～35 ℃）溫室下培養(yǎng)。

大豆播種后第2天，噴施土壤處理劑乙草胺（1 350 g a.i./hm2）及清水對(duì)照;在大豆生長(zhǎng)至3張三出復(fù)葉期噴施其余莖葉處理劑，除清水對(duì)照外，靶標(biāo)除草劑草甘膦設(shè)置3個(gè)劑量處理（900、1 800、3 600 g a.i./hm2），非靶標(biāo)除草劑均設(shè)置1個(gè)劑量處理，接近推薦劑量的上限值（乙羧氟草醚105 g a.i./hm2、精喹禾靈60 g a.i./hm2、2，4-滴二甲胺鹽567 g a.i./hm2）。使用ASS-4型行走式噴霧塔（Tee Jet 8002扇形噴頭）進(jìn)行噴霧處理，噴霧壓力0.275 MPa，莖葉處理噴液量450 L/hm2，土壤處理噴液量600 L/hm2。所有處理均設(shè)置4次重復(fù)。

1.4 調(diào)查與記錄

分別在用藥后1周、2周和4周調(diào)查和記錄大豆成活率（土壤處理劑第1周記錄發(fā)芽率）和藥害等級(jí)。除草劑藥害癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)具體如表1所示。

藥后2周和4周調(diào)查和記錄大豆株高，并在施藥后28 d剪取大豆地上組織，隨后在80 ℃烘箱烘干72 h并稱(chēng)量干重。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別比較轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6和受體大豆中黃10在草甘膦不同劑量處理下株高及干重等方面的差異;或不同非靶標(biāo)除草劑處理下ZH10-6和受體大豆中黃10在株高及干重等方面的差異。判斷2種大豆對(duì)受試除草劑的耐受水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZH10-6對(duì)草甘膦的耐受性

ZH10-6對(duì)草甘膦表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，900、1 800 g a.i./hm2草甘膦處理后7 d，ZH10-6無(wú)明顯癥狀，3 600 g a.i./hm2劑量處理下，ZH10-6 少數(shù)葉片出現(xiàn)黃褐色斑點(diǎn)，隨后藥害癥狀逐漸緩解。而受體大豆中黃10在各劑量處理后7 d便出現(xiàn)明顯的癥狀，葉片嚴(yán)重黃化、枯萎、植株矮小;藥后14 d，3個(gè)劑量處理下中黃10植株全部死亡。草甘膦處理后14、28 d，轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6各處理株高與對(duì)照比較無(wú)顯著差異（表2）。

2.2 ZH10-6對(duì)幾種非靶標(biāo)除草劑的耐受性

轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)土壤處理除草劑乙草胺表現(xiàn)出較好的耐受性，試驗(yàn)劑量處理后7 d，ZH10-6與受體中黃10的發(fā)芽率一致，并均表現(xiàn)出一定的藥害癥狀，主要表現(xiàn)為葉片卷曲、皺縮，藥害癥狀可達(dá)到2～3級(jí)，隨后藥害癥狀逐漸緩解。處理后14 d，乙草胺處理的2種大豆株高低于對(duì)照，但28 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，乙草胺處理的2種大豆株高、單株干重與對(duì)照一致（表3）。

轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)莖葉處理除草劑乙羧氟草醚表現(xiàn)出良好的耐受性，處理后植株成苗率均為100%，但初期也有藥害癥狀，表現(xiàn)為葉片輕微皺縮，有黃褐色斑點(diǎn)，癥狀級(jí)別1～2級(jí);受體中黃10也表現(xiàn)出相同的癥狀，隨后藥害癥狀逐漸緩解消除。用乙羧氟草醚處理后14、28 d，大豆長(zhǎng)勢(shì)與不噴藥處理一致，株高與空白對(duì)照差異不顯著（表4）。ZH10-6和中黃10對(duì)莖葉處理除草劑精喹禾靈表現(xiàn)出良好的耐受性，處理后7 d，2種大豆的大部分植株無(wú)明顯藥害癥狀，成苗率均為100%;處理后14、28 d，大豆株高與干重與空白對(duì)照差異不顯著（表4）。ZH10-6和中黃10對(duì)莖葉處理除草劑2，4-滴二甲胺鹽不具有耐受性，在噴施劑量下，植株全部死亡（表4）。

3 討論

溫室試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)草甘膦具有較高的耐受性，噴施草甘膦推薦中劑量的4倍量3 600 g a.i./hm2后28 d，株高和干重與清水對(duì)照相比無(wú)顯著差異。GUO等也初步研究了ZH10-6對(duì)草甘膦的耐受性水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)900～3 600 g a.i./ hm2草甘膦處理后1周，ZH10-6 植株未出現(xiàn)新葉黃化、葉綠素含量下降的現(xiàn)象[14]，該結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。于惠林等研究了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆GE-J16對(duì)草甘膦的耐受性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆噴施450～3 600 g a.i./hm2 不同劑量的草甘膦對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有不良影響，產(chǎn)量高于人工除草處理[15]。獲得轉(zhuǎn)基因安全證書(shū)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01也有相似的耐受性，在1～4倍田間劑量的草甘膦處理下，轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的生長(zhǎng)沒(méi)有受到顯著影響[16]。具有多抗性的抗除草劑大豆356043對(duì)草甘膦也有較高的耐受性，安全使用劑量為922～2 460 g a.i./hm2[16]。有研究表明，我國(guó)大豆田常見(jiàn)雜草在草甘膦900 g a.i./hm2劑量處理下便會(huì)產(chǎn)生較好的防除效果[15-16]，而本研究證實(shí)ZH10-6在4倍于該劑量處理下，株高與干重指標(biāo)與清水對(duì)照無(wú)差異，因此推薦劑量的草甘膦可安全應(yīng)用于該品系大豆田防除雜草。此外，草甘膦屬于莖葉處理劑，噴藥時(shí)應(yīng)當(dāng)綜合考慮大豆與雜草的生長(zhǎng)時(shí)期，選擇最佳施藥時(shí)間。

轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的大面積種植引起了靶標(biāo)除草劑使用面積與頻次的顯著升高，雜草抗藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重[13]。另外，基因漂移等生態(tài)問(wèn)題也在國(guó)外轉(zhuǎn)基因作物田中發(fā)現(xiàn)[12]。因此，大豆田常規(guī)除草劑在轉(zhuǎn)基因作物田的安全應(yīng)用，對(duì)于抗性雜草的防除和轉(zhuǎn)基因作物的長(zhǎng)期應(yīng)用都有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6與對(duì)應(yīng)受體在乙草胺1 350 g a.i./hm2處理下均出現(xiàn)了葉片卷曲、皺縮的癥狀，這與其他研究中乙草胺處理的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆356043癥狀[17]類(lèi)似。輕微的藥害癥狀在乙羧氟草醚、精喹禾靈處理之后也有一定的表現(xiàn)，但隨著大豆的生長(zhǎng)逐漸緩解消除。本研究結(jié)果證明，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)幾種大豆田常規(guī)除草劑敏感性無(wú)變化。因此，可以在控制成本的前提下，與草甘膦輪換使用，延緩抗性雜草的產(chǎn)生。此外，轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆ZH10-6與受體大豆中黃10對(duì)2，4-滴二甲胺鹽具有相同的敏感性，這為該轉(zhuǎn)基因大豆可能存在的雜草化風(fēng)險(xiǎn)提供了防控的依據(jù)?？共莞熟⑥D(zhuǎn)基因大豆ZH10-6對(duì)幾種大豆田常規(guī)除草劑的敏感性與受體大豆中黃10無(wú)顯著差異，對(duì)敏感除草劑2，4-滴二甲胺鹽也沒(méi)有產(chǎn)生耐受性變化，研究結(jié)果為轉(zhuǎn)化體的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供了數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙團(tuán)結(jié)，蓋鈞鎰. 栽培大豆起源與演化研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（7）：954-962.

[2]曹永強(qiáng)，王昌陵，王文斌，等. 國(guó)內(nèi)外大豆產(chǎn)業(yè)、科技現(xiàn)狀淺析與我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展思考 [J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，6：44-48.

[3]陳 娟，馬國(guó)勝，高智謀. 大豆田主要雜草的綜合防除及除草劑安全合理施用技術(shù) [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30（2）：254-256.

[4]黃春艷，陳鐵保，王 宇，等. 28種除草劑對(duì)大豆的安全性及藥害研究初報(bào) [J]. 植物保護(hù)，2003，29（1）：31-34.

[5]付文剛，郭 麗. 大豆田化學(xué)除草劑藥害產(chǎn)生原因及緩解途徑 [J]. 大豆科技，2011，5：57-59.

[6]楊樹(shù)果. 全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展演變與趨勢(shì) [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，25（9）：13-26.

[7]于 滔，曹士亮，張建國(guó)，等. 全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植概況（1996—2018年） [J]. 中國(guó)種業(yè)，2020，1：13-16.

[8]Clive J. Global status of commercialized biotech/GM crops 2018：biotech crop continue to help meet the challenges of increased population and climate change[M]. New York：International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，2018.

[9]杜建中，郝曜山，王亦學(xué)，等. 我國(guó)轉(zhuǎn)基因主糧作物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展、存在問(wèn)題及對(duì)策 [J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2016，6（3）：159-168.

[10]余 露. 192個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品種擬獲批安全證書(shū) [J]. 農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2020，2：13.

[11]李昊陽(yáng)，劉 義，李 娜，等. 轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的荒地生存競(jìng)爭(zhēng)能力[J]. 雜草學(xué)報(bào)，2018，36（3）：13-18.

[12]Hall L，Topinka K，Huffman J，et al. Pollen flow between herbicide-resistant Brassica napus is the cause of multiple-resistant B. napus volunteers1 [J]. Weed Science，2000，48（6）：688-94.

[13]Heap I. The international survey of herbicide resistant weeds[EB/OL]. [2020-10-20]. http：//www.weedscience.org.

[14]Guo B，Guo Y，Hong H，et al. Co-expression of G2-EPSPS and glyphosate acetyltransferase GAT genes conferring high tolerance to glyphosate in soybean[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6：847.

[15]于惠林，賈 芳，全宗華，等. 施用草甘膦對(duì)轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆田雜草防除、大豆安全性及雜草發(fā)生的影響 [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，53（6）：1166-1177.

[16]李 娜，曹越平. 轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01對(duì)草甘膦的抗性及草甘膦除草效果研究 [J]. 大豆科學(xué)，2018，37（3）：408-414.

[17]曹洪玉，李香菊，劉士陽(yáng)，等. 抗除草劑大豆356043對(duì)幾種除草劑的耐受性評(píng)價(jià) [J]. 雜草科學(xué)，2011，29（2）：32-35.

收稿日期：2020-12-28

基金項(xiàng)目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2019ZX08013002-005）。

作者簡(jiǎn)介：陳景超（1985—），男，山東濰坊人，博士，副研究員，主要從事雜草抗藥性及轉(zhuǎn)基因大豆環(huán)境安全研究。E-mail： chenjingchao@caas.cn。

通信作者：李香菊，博士，研究員，主要從事雜草治理研究。E-mail： xjli@ippcaas.cn。