外周血CTCs 與前列腺癌臨床特征的相關(guān)性

李 琿，平秦榕，史云強，王春暉，楊 洋，胡禮炳，畢曉方，李 健，鐘一鳴

（昆明市延安醫(yī)院泌尿外科，云南昆明 650051）

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居泌尿系腫瘤第1 位，居男性全身惡性腫瘤第2 位[1]。前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）目前臨床常用的篩查、監(jiān)測前列腺癌的血液學指標，但由于PSA 是組織特異性抗原而非腫瘤特異性抗原，故具有一定的假陽性率，尤其對于PSA 值為4～10 ng/mL 的患者，前列腺癌檢出率僅為25%左右[2-3]。尋找敏感性高、特異性強、無創(chuàng)、檢測成本低、簡便易行的前列腺癌篩查、監(jiān)測的方法已成為研究的熱點。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測是一種采集外周血，檢測外周循環(huán)血中腫瘤細胞的數(shù)量，進而對腫瘤進行篩查、監(jiān)測的方法，具有較好的臨床應(yīng)用前景。本研究通過檢測前列腺癌患者CTCs 數(shù)量，分析CTCs 檢測與前列腺癌臨床特征的相關(guān)性，旨在探討CTCs 檢測在前列腺癌篩查、監(jiān)測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2016 年1 月至2018 年12 月期間昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院泌尿外科收治的110 例前列腺疾?。ㄇ傲邢僭錾蚯傲邢侔┗颊叩呐R床資料。按診斷不同分為兩組，其中57 例前列腺癌患者作為研究組，所有患者均經(jīng)B 超引導下穿刺活檢或（和）術(shù)后病理確診為前列腺癌，腫瘤均為初次發(fā)現(xiàn)，年齡63～79 歲，平均（69.5±7.7）歲；53 例前列腺增生患者作為對照組，術(shù)后病檢均確診為前列腺增生，年齡66～81 歲，平均（71.2±5.4）歲。本研究報醫(yī)院科研部和倫理委員會獲得批準，檢測前所有患者簽署知情同意書。兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.3313，P=0.0929）。

有以下情況者排除[4-6]：（1）既往有腫瘤病史或合并其他系統(tǒng)腫瘤病史者；（2）合并急慢性前列腺炎者；（3）合并嚴重的呼吸、循環(huán)、血液系統(tǒng)疾病者；（4）檢測前3 月內(nèi)口服抗凝藥物、激素類藥物或有創(chuàng)傷、手術(shù)史者。

1.2 檢測方法

醫(yī)用抗凝采血管（抗凝劑為EDTA·K2/EDTA·Na2）采集患者外周血4～6 mL，4℃冷藏、運送，48 h 內(nèi)檢測。利用免疫磁球分離（Anti-EpCAM）及熒光染色法對外周血中的CTC 進行檢測和計數(shù)。采血時機均為手術(shù)或內(nèi)分泌治療、放化療前。

1.2.1 CTCs 的分離（1）取3.75 mL 抗凝血液，加入等體積的清洗液進行稀釋后備用，50 mL 離心管中加入7.5 mL 樣本密度分離液，將稀釋后的血液小心平鋪到分離液液面上方，注意保持兩界面的清晰；（2）室溫下，低速離心機水平轉(zhuǎn)子2 000 rpm，離心20 min；（3）離心后出現(xiàn)明顯的4 層分層，吸棄最上層稀釋血漿層，小心取第二層白膜層置于15 mL 離心管中，加入2 mL 清洗液（滬浦械備20160087 號）重懸細胞；（4）加入Anti-EpCAM 免疫納米磁球30 μL，室溫孵育30 min，每5 min 混勻一次；（5）孵育結(jié)束后將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出。

1.2.2 細胞固定（1）取400 μL 組織固定液重懸樣品，室溫放置10 min；（2）向離心管中加入1mL 清洗液，將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出。

1.2.3 細胞染色（1）加30 μL 染色液A（Anti-CK8，18，19-FITC 熒光抗體）、20 μL 染色液B（DAPI）、10 μL 染色液C（Anti-CD45-PE 熒光抗體），混勻后避光染色15 min；（2）向離心管中加入1 mL 清洗液，將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出；（3）向離心管中加入1 mL 清洗液，將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出。

1.2.4 CTCs 的計數(shù) 向離心管中加入30 μL 清洗液重懸磁球-細胞混合物，混勻后將溶液均勻涂于防脫載玻片上，Leica DM4 B&DM6 B Life Science Research 自動掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)，按照相應(yīng)程序進行CTCs 計數(shù)與統(tǒng)計。

1.2.5 判定標準（1）當細胞核DAPI 染色（藍色熒光）為陽性，Anti-CK8，18，19-FITC（綠色熒光）為陽性、細胞大小＞8 μm，可判斷為循環(huán)腫瘤細胞；（2）熒光符合循環(huán)腫瘤細胞判斷標準，但其大?。? μm 時判為陰性；（3）熒光及大小符合上述第1 條要求，但其明顯不具有細胞形態(tài)時判為陰性；（4）CTCs 陽性標準：外周血中CTCs≥5個/3.75 m 血樣。

1.3 觀察指標

統(tǒng)計并分析研究組與對照組CTCs 陽性率的差異。根據(jù)CTCs 計數(shù)結(jié)果，將研究組57 例進一步分為CTCs 陽性組和CTCs 陰性組，對比2 組PSA、Gleason 評分、病理分期≥T3a 發(fā)生率、骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率等指標的差異。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有計量資料符合正態(tài)分布，以（）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組CTCs 計數(shù)結(jié)果比較

免疫磁球分離及熒光染色法處理后可見CD45-、DAPI+、細胞角蛋白19+的CTCs（藍色熒光為細胞核DAPI 染色陽性；綠色熒光為Anti-CK19-FITC 陽性），見圖1。CTCs 計數(shù)顯示，研究組CTCs 平均數(shù)量[（7.4±1.5）個]顯著高于對照組[（2.1±0.9）個]，差異具有統(tǒng)計學意義（t=22.2616，P＜0.0001）。研究組CTCs 陽性率61.4%（35/57）顯著高于對照組5.7%（3/53），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=35.3157，P＜0.0001）見圖1。

圖1 CTCs 陽性（CD45-、DAPI+、Anti-CK19-FITC+）Fit.1 CTCs positive（CD45-，DAPI+，Anti-CK19-FITC+）

2.2 CTCs 陽性組與陰性組比較

根據(jù)CTCs 計數(shù)結(jié)果將研究組57 例前列腺癌分為CTCs 陽性組35 例（CTCs≥5 個/3.75 m）和CTCs 陰性組22 例（CTCs＜5 個/3.75 m）。CTCs 陽性組PSA 值[（35.4±15.7）ng/mL]高于CTCs 陰性組[（17.5±10.6）ng/mL]；CTCs 陽性組Gleason 評分[（8.1±1.3）]高于CTCs 陰性組[（7.2±1.1）]；CTCs 陽性組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率[34.3%（12/35）]高于CTCs 陰性組[9.1%（2/22）]，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CTCs 陽性組的病理分期≥T3a 發(fā)生率[29.2%（7/24）]低于CTCs 陰性組[30.3%（10/33）]大于CTCs 陰性組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 CTCs 陽性組與陰性組比較Tab.1 Comparison of CTCs between positive group and negative group

3 討論

近年來，隨著我國人口老齡化的加劇，以及生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國前列腺癌的發(fā)病率呈快速增長趨勢，70 歲以上老年男性的前列腺癌發(fā)病率已躍居男性泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率第1位，對老年男性的健康造成了極大的威脅[4]。由于前列腺癌具有發(fā)病隱匿、早期診斷率低的特點，大部分患者就診時已進展至中晚期，治療難度大、成本高，嚴重危害男性的健康。腫瘤標志物的研究給前列腺癌的早期診斷帶來了希望，有些檢測腫瘤標記物的技術(shù)已經(jīng)用于臨床。PSA 是目前唯一公認的可用于前列腺癌篩查、早期診斷的前列腺癌標志物，但易受炎癥、射精、直腸指診和導尿操作的影響，而出現(xiàn)假陽性。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，部分腫瘤細胞脫落后進入外周血，隨血液循環(huán)遷移、侵襲，進而為轉(zhuǎn)移病灶的形成提供了基礎(chǔ)。循環(huán)腫瘤細胞CTCs 是指從原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤病灶脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，與原發(fā)腫瘤細胞有類似的抗原和遺傳特性[5]。大量研究顯示[6]，CTCs 檢測具有非侵入性和實時監(jiān)測的優(yōu)點，有利于早期發(fā)現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移病灶，可用于篩選進展風險較高的患者，以便及早采取針對性治療。目前對CTCs 的檢測分析過程主要包括富集、分選、鑒定和分析等過程，相關(guān)技術(shù)主要包括免疫磁珠濃集、密度梯度離心、過濾分離、RT－PCR、免疫學方法、流式細胞分析、CTCs 芯片等。

有研究表明，檢測前列腺癌CTCs 的技術(shù)敏感性有限，但有很高的特異性，并且CTCs 數(shù)量與前列腺癌的分級和臨床分期顯著相關(guān)[7]。據(jù)文獻報道[8-9]，CTCs 計數(shù)可作為對已發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者判斷療效和預后的指標。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已經(jīng)批準將CTCs 計數(shù)作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的預后評價指標[10]。但由于外周血中的CTCs 相當稀少，血液中約每106～107個白細可能僅有1 個CTCs[11]。因此，CTCs 的檢測需要細胞富集、結(jié)合細胞表面及內(nèi)部標志物的多種技術(shù)。此外，由于腫瘤存在異質(zhì)性，腫瘤細胞的特性和標志物也不盡相同，這就給CTCs 的捕獲及標記帶來較大的困難。因此，有必要進一步開展CTCs 研究，通過CTCs 檢測技術(shù)的改進和設(shè)備的更新來進一步提高前列腺癌篩查、監(jiān)測的準確性。

隨著近年來分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，CTCs 富集和檢測技術(shù)取得突破性進展，CTCs 檢測的應(yīng)用價值逐漸受到關(guān)注。本研究采用Cell Identify CTCs 檢測試劑盒對前列腺癌CTCs 進行分離、富集、固定、染色和計數(shù)，Anti-EpCAM免疫納米磁球表面的抗體能與前列腺癌患者外周血中的CTCs 表面EpCAM 抗原發(fā)生特異性的結(jié)合，通過磁分離技術(shù)可實現(xiàn)CTCs 的分離和富集。在免疫磁球完成了對CTCs 的分離和富集后，添加熒光試劑以識別并對CTCs 計數(shù)。將樣本、試劑混合染色后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察進行鑒定，將具有Ep-CAM+、DAPI+、細胞角蛋白8、18 及/19+的細胞歸類為前列腺癌CTCs，從而實現(xiàn)對腫瘤患者外周血中的CTCs 的計數(shù)。研究結(jié)果顯示，研究組CTCs 平均數(shù)量（7.4±1.5）個顯著高于對照組（2.1±0.9）個，研 究 組CTCs 陽 性 率61.4%（35/57）顯著高于對照組5.7%（3/53）（P ＜0.05）。表明該方法檢測前列腺癌患者CTCs 具有較好的可行性和有效性，CTCs 數(shù)量與前列腺癌的發(fā)病風險呈正相關(guān)性，前列腺癌患者的CTCs 陽性率顯著高于良性前列腺增生，CTCs 陽性可作為篩查、監(jiān)測前列腺癌的一項輔助依據(jù)。此外，CTCs 陽性組患者PSA 值[（35.4±15.7）ng/mL 與（17.5±10.6）ng/mL]、Gleason 評 分[（8.1 ±1.3）與（7.2±1.1）]和骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率[34.3%（12/35）與9.1%（2/22）]均顯著高于CTCs 陰性組（P ＜0.05）。表明CTCs 陽性與前列腺癌PSA 值、Gleason 評分和骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率有明顯相關(guān)性，在前列腺癌輔助診斷、療效監(jiān)測和預后風險評估中具有較好的臨床價值。

盡管目前尚無一種檢測方法能完全替代PSA聯(lián)合DRE、病理學活檢在前列腺癌篩查和診斷中的作用，但多種檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用有望為前列腺癌的早期診斷、復發(fā)和轉(zhuǎn)移監(jiān)測帶來新的突破。CTCs 檢測作為一種新型的體液活檢技術(shù)，具有簡便、無創(chuàng)、可靠的優(yōu)點，可作為一項輔助診斷技術(shù)應(yīng)用于前列腺癌的篩查和病情監(jiān)測、預后風險評估，具有較好的潛在臨床應(yīng)用價值。