RNA甲基化修飾m6A在動物中的研究進展

何波，周小楓，蔣瑤，曹浩男，袁曉龍，張哲，張豪，李加琪

( 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

RNA甲基化修飾具有復(fù)雜性和多樣性，在RNA約150多種化學(xué)修飾中，RNA甲基化修飾形式約占60%以上，各種甲基化修飾在細胞內(nèi)有著不同的生物學(xué)功能[1]。RNA中m6A(N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤)的形成是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移到RNA腺嘌呤的第六位N原子上而得以實現(xiàn)的[2]，如圖1所示，在甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429等的催化作用下形成m6A，另外m6A甲基化形成后的腺嘌呤也能夠在去甲基化酶FTO、ALKBH5等的催化作用下脫去-CH3而實現(xiàn)去甲基化。m6A是真核細胞mRNA上最為常見的一類RNA甲基化修飾[3]，近年來受到廣泛的關(guān)注和研究。本綜述主要介紹和總結(jié)RNA甲基化修飾m6A的相關(guān)研究，簡要闡明m6A修飾的調(diào)控機制以及對動物繁殖、生長發(fā)育等各方面的影響。

圖1 mRNA中m6A甲基化修飾位點[3]

1 m6A的定位分布及基本調(diào)控機制

1.1 m6A的定位分布

m6A是真核生物中最常見和最豐富的mRNA甲基化修飾，據(jù)報道m(xù)6A修飾廣泛存在于酵母、植物、果蠅和哺乳動物等各類真核生物中[4]。在人類細胞和小鼠組織中，通過m6A抗體免疫沉淀結(jié)合高通量測序技術(shù)對m6A的轉(zhuǎn)錄組進行了全面的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m6A定位分布主要在終止密碼子附近、3’UTRs、mRNA外顯子以及蛋白編碼區(qū)域(CDS)[5]。

1.2 m6A的基本調(diào)控機制

RNA中m6A甲基化修飾是由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶以及結(jié)合蛋白質(zhì)的共同調(diào)控，近年來以m6A為主的RNA甲基化修飾研究表明，m6A與基因表達調(diào)控以及RNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切、降解、核轉(zhuǎn)運等方面密切相關(guān)[6-7]。m6A甲基化修飾在細胞內(nèi)由各種修飾酶和結(jié)合蛋白共同作用的動態(tài)可逆的修飾過程如圖2所示，m6A修飾的甲基化與去甲基化過程是由復(fù)雜的酶系統(tǒng)調(diào)控，其中m6A修飾的甲基化是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，將甲基供體SAM提供的甲基轉(zhuǎn)移到RNA分子特定的腺嘌呤上而形成的；m6A修飾的去甲基化同樣需要去甲基化酶的催化作用而脫去甲基；最終m6A甲基化修飾的功能發(fā)揮需要通過與相應(yīng)的功能蛋白識別結(jié)合而得以實現(xiàn)。

1.2.1 m6A的調(diào)控酶系統(tǒng)

m6A甲基化的形成需借助甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用將甲基供體SAM提供的-CH3轉(zhuǎn)移到RNA分子特定的腺嘌呤上，參與形成甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的蛋白主要包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429等，復(fù)合體的其它組分正在陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)；m6A去甲基化需要去甲基化酶蛋白FTO和ALKBH5的作用脫去-CH3而實現(xiàn)[8]。

在動物機體中，各個酶都有著重要的生物學(xué)功能，METTL3主要參與調(diào)控腦組織發(fā)育和精子的發(fā)生[9-10]；METTL14能與METTL3形成一個穩(wěn)定的異二聚體，對METTL3起到協(xié)同作用[11]；WTAP在m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中起調(diào)節(jié)亞基的作用，并在RNA代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]；KIAA1429同樣對甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的其它組分起到協(xié)同作用，也是m6A修飾的關(guān)鍵[13]，但由于KIAA1429的研究較少，KIAA1429對m6A水平的影響詳細機制尚不清楚，目前研究發(fā)現(xiàn)其主要參與調(diào)控胚胎干細胞的自我更新而參與胚胎的發(fā)育過程[14]；FTO和ALKBH5主要與動物肥胖和雄性動物精子的發(fā)生等方面有密切的關(guān)系[15-16]。

圖2 m6A修飾的動態(tài)調(diào)控過程[8]

1.2.2 m6A的功能結(jié)合蛋白

m6A甲基化修飾功能的發(fā)揮需要通過選擇性地與功能性的結(jié)合蛋白結(jié)合而得以實現(xiàn)。其功能性的結(jié)合蛋白主要包括YTHDF家族的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3以及YTHDC家族的YTHDC1等，這些蛋白可特異性結(jié)合在含有m6A修飾的序列上[17]，與mRNA的剪切、翻譯、降解等過程密切相關(guān)[8]，同樣在動物機體中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

YTHDF1與蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)，當(dāng)YTHDF1結(jié)合m6A修飾的mRNA后，與起始轉(zhuǎn)錄因子及核糖體相互作用，核糖體結(jié)合到mRNA上的速度加快，增強mRNA的翻譯效率[18]；YTHDF2相較于YTHDF1對m6A修飾的序列有更強的結(jié)合能力，在細胞中，YTHDF2可選擇性地結(jié)合在mRNA的衰變位點上，進而影響mRNA的半衰期，加速mRNA的降解，影響mRNA的穩(wěn)定性[19]；YTHDF3與YTHDF1能協(xié)同促進mRNA蛋白質(zhì)翻譯合成，并且會影響YTHDF2介導(dǎo)的mRNA降解[20]；YTHDC1定位于細胞核的核斑點，通過結(jié)合mRNA的剪接因子來調(diào)控mRNA選擇性剪接，介導(dǎo)細胞mRNA從細胞核向細胞質(zhì)的輸出而實現(xiàn)核轉(zhuǎn)運，對mRNA的加工和代謝有著重要的作用[21]。

2 m6A在動物中的生物學(xué)功能

2.1 m6A 與干細胞分化

2.1.1 m6A 調(diào)控神經(jīng)干細胞分化

在動物胚胎發(fā)育和出生后腦組織發(fā)育過程中均需要神經(jīng)干細胞的分化及自我更新作用，有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎中敲除Mettl14后會導(dǎo)致神經(jīng)中放射狀膠質(zhì)細胞(radial glia cells，RGCs)周期進程中斷，最終導(dǎo)致腦皮層厚度減小，甚至?xí)霈F(xiàn)出生后死亡的現(xiàn)象。另外，m6A能抑制RGCs中與神經(jīng)發(fā)生、細胞周期和神經(jīng)元分化相關(guān)基因Sox1、Emx2、Cdk9等的表達，在小鼠胚胎中敲除Mettl3后導(dǎo)致RGCs細胞周期延遲，RGCs分化為神經(jīng)元的能力顯著降低[22]。在成年小鼠坐骨神經(jīng)損傷的脊神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)中，許多與再生相關(guān)的基因和蛋白翻譯組分的m6A修飾水平明顯升高，當(dāng)敲除Mettl14和Ythdf1會抑制成年小鼠DRG神經(jīng)節(jié)損傷誘導(dǎo)的蛋白翻譯，外周神經(jīng)系統(tǒng)的功能軸突再生減少，同時特異性敲除成年小鼠Mettl14基因后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)視網(wǎng)膜神經(jīng)元軸突再生明顯減弱，表明m6A是成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)損傷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成和軸突再生的一種重要表觀調(diào)控因素[23]。綜上表明，m6A修飾在哺乳動物大腦神經(jīng)干細胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中有著重要的生物學(xué)功能。

2.1.2 m6A 調(diào)控造血干細胞分化

相關(guān)研究通過m6A抗體免疫沉淀結(jié)合高通量測序技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)m6A在斑馬魚胚胎發(fā)育的內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)換過程(endothelial-to-haematopoietic transition，EHT)中決定著造血干/祖細胞(haematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs)的分化；其調(diào)控過程是m6A通過特異性修飾ETH過程中關(guān)鍵的動脈內(nèi)皮基因Notch1a，使得結(jié)合蛋白YTHDF2對該基因的mRNA進行降解，抑制了調(diào)控EHT過程的Notch信號通路，促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為HSPCs，從而使得EHT過程有序進行；在斑馬魚胚胎中敲除Mettl3后會導(dǎo)致m6A水平顯著降低，動脈內(nèi)皮基因Notch1a的mRNA無法降解使得Notch信號通路持續(xù)激活，導(dǎo)致EHT過程被阻斷，進而阻滯HSPCs的分化[24]，表明m6A在動物造血干細胞分化過程中有著重要的調(diào)控作用。

2.1.3 m6A調(diào)控胚胎干細胞分化

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在小鼠早期胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)中大部分基因轉(zhuǎn)錄組都存在m6A修飾，當(dāng)特異性敲除小鼠ESCs的Mettl3基因后能顯著降低m6A修飾水平和ESCs的分化以及自我更新能力[25]。另一項類似的研究中，小鼠胚胎干細胞中Mettl3或Mettl14基因特異性敲除會導(dǎo)致ESCs中m6A修飾水平顯著降低，表明m6A修飾的形成需要這兩種蛋白；為了研究這兩種蛋白METTL3和METTL14在ESCs中的分子生物學(xué)功能，采用RNA免疫沉淀技術(shù)和高通量測序技術(shù)結(jié)合，繪制基因表達圖譜以及對m6A修飾進行定位。首先，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Mettl3或Mettl14基因缺失時，超過70%的ESCs中的mRNA的m6A水平顯著降低；其次，Mettl3或Mettl14的缺失也會導(dǎo)致小鼠ESCs分化相關(guān)基因表達降低，小鼠ESCs自我更新能力降低，表明Mettl3或Mettl14介導(dǎo)的m6A修飾有助于維持小鼠ESCs的分化；最后，對測序結(jié)果的分析還發(fā)現(xiàn)ESCs中編碼發(fā)育調(diào)節(jié)因子的mRNA中高度富集m6A，當(dāng)Mettl3和Mettl14基因缺失時，部分發(fā)育調(diào)節(jié)因子mRNA穩(wěn)定性增強，表明m6A修飾會選擇性地破壞了ESCs中發(fā)育調(diào)因子mRNAs的穩(wěn)定性[26]。另外，在小鼠的研究上還發(fā)現(xiàn)，甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中KIAA1429在小鼠ESCs自我更新中也具有重要作用，Kiaa1429基因被特異性敲除后會影響ESCs的細胞活力，同時會導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯，胚胎在小鼠出生前出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象[14]。綜合以上研究結(jié)果表明，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、KIAA1429在維持ESCs分化、自我更新以及胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

2.2 m6 A與動物繁殖

2.2.1 m6A調(diào)控動物精子發(fā)生

研究表明通過特異性敲除小鼠生殖細胞中Mettl3基因，發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)基因選擇性剪接的Mettl3缺失會導(dǎo)致精子發(fā)生過程中相關(guān)基因的表達模式紊亂、精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂嚴重缺陷、精子發(fā)生受阻，最終導(dǎo)致不育[9]。在另外一項研究中，特異性敲除小鼠生殖細胞中Mettl3和Mettl14基因同樣會導(dǎo)致m6A水平下降，引起精原干細胞增殖和分化相關(guān)基因的表達失調(diào)，最終導(dǎo)致精子發(fā)生受阻[27]。在雄性小鼠睪丸中，m6A去甲基化酶ALKBH5的表達水平最高，敲除Alkbh5后會導(dǎo)致m6A水平上升，睪丸體積變小、精子形態(tài)異常以及出現(xiàn)一系列的生殖功能障礙[16]。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，YTHDC2調(diào)控生殖細胞從增殖向分化的轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)錄組分析進一步發(fā)現(xiàn)，Ythdc2基因的缺失還會導(dǎo)致正常有絲分裂細胞相關(guān)基因表達的上調(diào)，而減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達下調(diào)[28]。綜上研究結(jié)果表明，m6A 甲基化修飾的動態(tài)調(diào)控過程與精子發(fā)育發(fā)生密切相關(guān)，各調(diào)控酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能。

2.2.2 m6A調(diào)控動物卵母細胞成熟

卵母細胞減數(shù)分裂是一個較為復(fù)雜過程，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在豬卵母細胞減數(shù)分裂過程中m6A總體水平顯著升高，同時m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3和WTAP和去甲基化酶FTO表達水平均有升高，在體外分別用甲基供體苷氨酸三甲內(nèi)鹽，俗稱甜菜堿和甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸處理卵母細胞，發(fā)現(xiàn)甲基供體處理的卵母細胞的m6A水平顯著升高，但不影響減數(shù)分裂過程和卵母細胞發(fā)育；而甲基化抑制劑處理的卵母細胞后導(dǎo)致減數(shù)分裂過程中m6A甲基化水平降低，且細胞內(nèi)紡錘體和染色體的缺陷發(fā)生率顯著增加，卵母細胞發(fā)育不完全，表明m6A甲基化修飾的水平降低會損害減數(shù)分裂過程卵母細胞的發(fā)育能力，阻礙其成熟[29]。YTHDF2能與m6A修飾的mRNA結(jié)合并使其降解，在小鼠上發(fā)現(xiàn)Ythdf2基因的高表達能促進減數(shù)分裂過程中卵母細胞的發(fā)育成熟，Ythdf2基因缺失的小鼠會出現(xiàn)不孕不育現(xiàn)象，表明m6A結(jié)合蛋白YTHDF2是哺乳動物卵母細胞和早期受精卵發(fā)育的決定因素[30]。

2.3 m6 A與動物生長發(fā)育

2.3.1 m6A調(diào)控動物能量代謝及脂肪沉積

在豬脂肪細胞中過表達和特異性敲除Fto和Mettl3基因，發(fā)現(xiàn)FTO表達水平與m6A水平呈負相關(guān)，與脂肪形成呈正相關(guān)，而METTL3表達水平與m6A水平呈正相關(guān)，與脂肪形成呈負相關(guān)[31]。FTO功能性缺失的小鼠出生后會出現(xiàn)能量消耗增加、生長遲緩、體型偏瘦，同時還會引起嚴重的生長遲緩和畸形[32]；在小鼠上研究還發(fā)現(xiàn)，肥胖相關(guān)基因Irx3是Fto的功能靶點，兩者可以相互作用，增加動物機體的脂肪沉積，從而導(dǎo)致動物出現(xiàn)肥胖現(xiàn)象，F(xiàn)to和Irx3缺失的小鼠，脂肪沉積減少和能量代謝率增加，從而表現(xiàn)出體重嚴重下降和體型出現(xiàn)異常等情況[33]。綜上，這些結(jié)果揭示了m6A在動物能量代謝、脂肪沉積形成等方面有著重要的作用。

2.3.2 m6A調(diào)控動物肌肉生長

相關(guān)研究采用m6A抗體免疫共沉淀結(jié)合高通量測序技術(shù)，將野豬、長白豬和榮昌豬三個不同品種的肌肉組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，繪制出了m6A全轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m6A在肌肉組織中廣泛分布，m6A主要富集于相關(guān)基因的終止密碼子、3′UTR和蛋白編碼區(qū)。另外，該研究通過m6A-IP數(shù)據(jù)顯示，發(fā)現(xiàn)在cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB和鋅指蛋白ZNF相關(guān)基因的終止密碼子周圍均有一個清晰的m6A峰，說明m6A在此富集；Creb最早被發(fā)現(xiàn)為細胞代謝調(diào)節(jié)cAMP反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是重要的調(diào)控生長抑素的基因，ZNF也一直被認為是最重要的真核轉(zhuǎn)錄因子之一，對基因的調(diào)控起重要作用。該研究中發(fā)現(xiàn)還有大量含有m6A修飾的基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，表明m6A修飾可能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[34]。

2.3.3 m6A調(diào)控動物腦組織發(fā)育

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在小鼠小腦發(fā)育過程中廣泛存在m6A修飾，并進一步研究揭示了小鼠出生后腦組織四個發(fā)育進程中m6A甲基化修飾的不同特征。在小鼠出生后的7-60天里，mRNA的m6A水平表現(xiàn)出明顯的變化，各種修飾酶METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、FTO在小鼠小腦中的時間和空間上均出現(xiàn)特異性表達；Alkbh5基因缺失會擾亂不同細胞中決定性基因m6A修飾的平衡，導(dǎo)致小腦細胞增殖和分化異常[35]；另一項研究發(fā)現(xiàn)在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中，METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性滅活會引起大腦發(fā)育出現(xiàn)嚴重缺陷現(xiàn)象，小腦中m6A修飾水平明顯下降，Mettl3基因特異性敲除會導(dǎo)致在小腦外顆粒層中的顆粒細胞(cerebellar granulosa cells，CGCs)凋亡明顯增加，進而影響小腦發(fā)育不完全，進一步分析結(jié)果表明，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3介導(dǎo)的m6A通過調(diào)控與小腦發(fā)育和凋亡相關(guān)基因的mRNA穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)突觸相關(guān)基因mRNA的選擇性剪接來參與小腦的發(fā)育[10]。綜上，這些結(jié)果共同揭示了甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶介導(dǎo)的m6A在調(diào)節(jié)哺乳動物腦組織發(fā)育中具有重要作用。

3 結(jié)語與展望

首先，RNA中m6A修飾是一個由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及結(jié)合蛋白共同調(diào)控的動態(tài)過程，整個過程由于存在多種甲基化修飾酶和結(jié)合蛋白而使得其調(diào)控機制和調(diào)控過程極為復(fù)雜。例如在m6A復(fù)雜的調(diào)控酶系統(tǒng)中，RNA甲基轉(zhuǎn)移酶是一個包含多個組分的酶復(fù)合體，盡管隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物其它組分在陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但可能還存在更多的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶或是去甲基化酶，需要進一步的研究挖掘，才可以更清晰地闡述m6A甲基化修飾的調(diào)控機制；另外m6A修飾不僅在動物繁殖、生長發(fā)育方面有著不言而喻的重要性，而且在調(diào)節(jié)動物生物節(jié)律方面以及機體的一系列病理效應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用[8]，這也是未來在RNA分子水平方面的研究方向。

其次，目前RNA甲基化修飾的研究在人類中較多，雖然近年來越來越多的研究表明，RNA甲基化修飾在調(diào)控動物繁殖、生長發(fā)育方面有著重要的作用，但只是以小鼠為基礎(chǔ)模型的研究，在一些重要的畜牧生產(chǎn)動物，如豬、牛、羊、雞上的研究均相對較少，所以在這些重要的畜牧生產(chǎn)動物方面是值得去思考和進一步研究的。一方面，RNA甲基化修飾是否會對這些畜牧生產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能和繁殖性能產(chǎn)生同樣的影響等；另一方面，既然RNA甲基化修飾的過程受到甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶共同作用，那么對于m6A甲基化修飾的化學(xué)干預(yù)與調(diào)控的小分子藥物的研發(fā)便是未來的研究方向，這些藥物作為一種抑制劑或促進劑靶向作用于相應(yīng)的酶，從而改變RNA甲基化修飾水平，應(yīng)用于動物疾病預(yù)防與治療等方面，目前已有相關(guān)研究報道了RNA去甲基化酶FTO的靶向抑制劑[8]；同樣，m6A甲基化修飾的功能發(fā)揮需要借助結(jié)合蛋白的作用，這些結(jié)合蛋白的合成必定受到相關(guān)分子路徑的調(diào)控作用，研究并闡明這些功能結(jié)合蛋白的分子調(diào)控機制，也可以有效地改變RNA甲基化修飾的對于動物機體的作用，這也是未來一個重要的研究方向。

最后，在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)中，提高動物的生產(chǎn)性能和繁殖性能對于提高經(jīng)濟效益極為重要，提高動物生產(chǎn)性能和繁殖性能也是養(yǎng)殖生產(chǎn)的最終目的。因此就可以從RNA甲基化修飾的分子調(diào)控機制研究入手，更加清楚地闡述在畜牧生產(chǎn)動物上的分子調(diào)控機制，進而通過有效的手段改變RNA分子甲基化修飾的水平來減少對于畜牧生產(chǎn)動物產(chǎn)生的負面影響，更好發(fā)揮動物的優(yōu)良的生產(chǎn)性能和繁殖性能，最終達到提高畜禽動物的產(chǎn)蛋率、產(chǎn)肉率、受胎率、產(chǎn)仔數(shù)，產(chǎn)肉率、產(chǎn)奶量等目的；同時也可以對RNA甲基化修飾在不同品種動物之間表現(xiàn)出的差異性進行研究，找出不同品種之間的存在的差異，在實際生產(chǎn)中更好地進行畜禽的選種育種工作，選擇更加優(yōu)良的品種進行養(yǎng)殖生產(chǎn)，在提高經(jīng)濟效益的同時，對于推動整個畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)、健康、高效發(fā)展有著重要意義。