羊傳染性膿皰病毒疫苗株和野毒株GIF基因比較分析

張大俊，盧炳州，閆鳴昊，郝軍紅，鄭海學(xué)，劉湘濤，張克山

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046)

羊傳染性膿皰(orf)是副痘病毒屬(parapoxvi-rus)的羊傳染性膿皰病毒(orf virus, ORFV)感染引起的綿羊、山羊和人的人獸共患病[1-2]。典型病理過程最初紅斑、囊泡形成，然后到膿皰，最后形成結(jié)痂斑[3-4]。臨床特征主要表現(xiàn)為嘴唇皮膚上，口腔黏膜和鼻孔周圍出現(xiàn)增殖性并且通常是自限性損傷。哺乳動物的乳頭上偶有發(fā)病，其他部位很少發(fā)現(xiàn)病變[5]。

該病對山羊感染率高，致死率低，但是繼發(fā)或混合感染其他病原后，可導(dǎo)致較高死亡率[6]。ORFV感染可對我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生重大影響[7]。ORFV基因組是全長為135kb的線性雙鏈(ds)DNA[8]，有16個開放閱讀框，G+C的組成約為63%[9]?；蚪M的中心部分含有病毒復(fù)制和病毒形態(tài)發(fā)生變化所必需的高度保守的基因，位于末端的可變基因主要與病毒的毒力和發(fā)病機(jī)制有關(guān)[10]。GIF基因位于ORFV基因組的右端，研究表明這段基因序列的存在可能是病毒與宿主在相互適應(yīng)過程中發(fā)生了基因重組，并在感染后的中晚期表達(dá)[11-12]。通常情況下，GIF以同源二聚體和四聚體的形式與綿羊粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的369KD和IL-2的1.04KD高親和力結(jié)合[13]。由于羊和人兩者的GM-CSF及IL-2受體不同，所以GIF不能與人的GM-CSF和IL2結(jié)合。GIF功能活性表明，其能抑制綿羊GM-CSF的造血活性，并在T細(xì)胞增殖試驗中抑制綿羊IL-2的生物活性。對感染部位局部免疫反應(yīng)的研究表明病毒具有破壞適應(yīng)性免疫反應(yīng)的作用[14]。ORFV二次感染綿羊后，在其淋巴液中均能檢測到GM-CSF和IL-2[15]，這些細(xì)胞因子主要來源于CD4 + T細(xì)胞[14]。GIF通過抑制GM-CSF和IL-2在免疫反應(yīng)中的作用，從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。由于GIF的特殊性以及作為眾多病原體免疫調(diào)節(jié)劑的一部分，不僅可用于確定病毒致病機(jī)制和宿主抗病原體免疫的性質(zhì)，還可作為潛在治療蛋白質(zhì)或肽的模板[16]。上述研究表明GIF基因在ORFV感染宿主的過程中發(fā)揮重要作用[17]。

目前，疫苗接種仍然是ORF防控主要措施[18]。由于ORFV的免疫反應(yīng)主要是依靠細(xì)胞免疫，因此細(xì)胞弱毒疫苗效果較好，但毒株致弱機(jī)制尚不清楚。為此本試驗對ORFV疫苗株和野毒株的GIF基因序列進(jìn)行了比較分析，并進(jìn)行氨基酸序列的推導(dǎo)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較分析。本試驗結(jié)果為闡明ORFV自身編碼的基因GIF在疾病防控中的作用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及主要試劑

疫苗購買于山東泰豐生物制品有限公司；病料于2018年采集于西北地區(qū)某羊場患病羔羊的唇部痂皮。DNA提取試劑盒Dneasy Blood&Tissue kit 購自QIAGEN公司；EXTaqDNA聚合酶、dNTP等購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 引物設(shè)計

依據(jù)引物設(shè)計原則，參考 GenBank中ORF GIF基因的全序列設(shè)計引物如下上游引物為5′GCTCTAGGAAAGATGGCGTG 3′，下游引物為5′GTACTCCTGGCTGAAGAGCG 3′。引物由Thermo Fisher Scientific公司合成。

1.3 DNA的提取

按照Dneasy Blood&Tissue kit 試劑盒分別抽提疫苗和病料核酸。

1.4 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系(50 μL)為：5×PCRbuffer 10 μL，primerstar酶0.5 μL，模板1 μL，P1、P2各1 μL，dNTP 5 μL，補(bǔ)加超純水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min ；94 ℃ 變性 50 s，56.5 ℃退火50s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 序列測定及比較分析

經(jīng)電泳檢測片段大小合適的擴(kuò)增產(chǎn)物附上下游引物送出測序。利用DNAStart軟件中 MegAlign程序?qū)y序確證的野毒株與疫苗株GIF基因序列進(jìn)行比對，分析其在核苷酸和氨基酸水平的變異情況。將測定的序列與NCBI上已公布的ORFV GIF基因序列(表1)進(jìn)行比對分析。

1.6 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

運(yùn)用Expassy在線工具包中的ProtParam分析ORFV疫苗株和野毒株編碼的GIF蛋白的氨基酸組成及各種理化性質(zhì)。

1.7 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及功能分析

用DNAStar中Protean程序?qū)RFV疫苗株和野毒株編碼的GIF蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。用Expasy在線工具包中的Signal IP進(jìn)行信號肽預(yù)測，用 TMHMM2.0中的SOSU進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測。根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性分析，表面可能性分析以及抗原指數(shù)分析結(jié)果綜合氨基酸的帶電量等情況，分析兩蛋白可能的抗原優(yōu)勢表位。

1.8 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

將疫苗株與野毒株的GIF基因推導(dǎo)的氨基酸序列提交至Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，建立模型并進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GIF基因擴(kuò)增

以提取的病毒DNA為模板，用設(shè)計的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到約798 bp大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 序列測定與分析

符合預(yù)期結(jié)果的片段經(jīng)測序得到大小為798bp的GIF基因序列。將野毒株與疫苗株的GIF基因序列進(jìn)行比較，兩者的核苷酸序列同源性為 94.3%，差異主要為單個堿基的突變，集中在CT堿基的替換。其他有少量其他堿基的突變，且野毒株大小長度比疫苗株少3bp。2個毒株GIF的氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)相似性為92.5%，氨基酸在第11位(Phe→Leu)、30位(Met→Thr)、46位(Val→Ile)、56位(Asn→Ser)、73位(Gly→Asp)、74位(Val→Arg)、77位(Gly→Ala)、85位(Val→Met)、86位(Pro→Ala)、94位(Ser→Met)、112位(Asp→Tyr)、115位(Thr→Ser)、120位(Val→Ala)、170位(Asp→Val)、173位(Asn→His)、175位(Ser→Gly)、194位(Leu→Gin)、202位(Thr→His)、234位(Ser→Cys)、258位(Glu→Lys)發(fā)生了變異。這些氨基酸的突變是否能夠引起結(jié)構(gòu)的變化，來進(jìn)一步影響其蛋白功能的發(fā)揮，還需作進(jìn)一步的分析。

本次測定的ORFV野毒株與疫苗株的GIF基因序列與GenBank公布的其他毒株(表1)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)本次測定的ORFV野毒株GIF的核苷酸序列與其他毒株的相似性為88.3%～99.2%，其中與2013年公布的ORFV中國新疆石河子株GIF(KF726847.1)相似度最高，相似性為99.2%。而本次測定的ORFV疫苗株GIF基因序列與其他毒株的相似性為88.8%～99.0%。其中2011公布的ORFV芬蘭野毒株株GIF(JF773686.1)與本次測定的ORFV疫苗株GIF序列相似性最為接近為99.0%(圖1)。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，本次測定的ORFV野毒株GIF與2013 年公布的中國新疆石河子株GIF(KF726847.1)較為接近(圖2)。從進(jìn)化樹中選取2012年公布的中國新疆株GIF(KF666567.1)、2017年公布的中國安徽株(MF489147.1)與本次測得的疫苗株進(jìn)行深入比較。將這兩個野毒株GIF分別與疫苗株GIF的氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)，中國安徽株(MF489147.1)與疫苗株有15處變異，中國新疆株(KF666567.1)疫苗株有14處變異，且它們在第30位(Met→Thr)、56位(Asn→Ser)74位(Val→Arg)、85位(Val→Met)、86位(Pro→Ala)、115位(Thr→Ser)、120位(Val→Ala)、170位(Asp→Val)、234位(Ser→Cys)發(fā)生同樣的變異。

表1 ORFV GIF基因序列信息

序號毒株名稱登陸號國家年份宿主1ORFV 野毒株(本研究使用)未上傳中國甘肅2018山羊2ORFV 疫苗株(本研究使用)未上傳中國甘肅2018山羊3芬蘭07.798R株JF773680.1芬蘭2011馴鹿4芬蘭07.808R株JF773686.1芬蘭2011馴鹿5中國新疆2株KF666566.1中國新疆2013山羊6中國新疆1株KF666567.1中國新疆2012山羊7中國石河子3株KF726847.1中國石河子2013山羊8中國河北1株KJ610834.1中國河北2010山羊9中國河北株KJ610835.1中國河北2010山羊10美國阿拉斯加北美山羊2006-29株 KM057383.1美國2006北美山羊11美國阿拉斯加北美馴鹿2012-137株 KM057394.1美國2012北美馴鹿12阿根廷sCh97株KP244331.1阿根廷1997羊13中國安徽AH1505株MF489141.1中國安徽2015山羊14中國安徽AH1610株MF489144.1中國安徽2016山羊15中國安徽AH1612株MF489145.1中國安徽2016山羊16中國安徽AH1704株MF489147.1中國安徽2017山羊17中國安徽AH-GY13株MF770655.1中國安徽2013山羊18印度阿薩姆邦2014株MF414636.1印度2014山羊19印度查爾邦MUK59/05株DQ922634.1印度2007山羊20印度比卡內(nèi)爾09株GU460372.1印度2008駱駝

2.3 蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能分析

2.3.1 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

把ORFV疫苗株與本次野毒株的GIF及2012年公布的中國新疆株GIF(KF666567.1)、2017年公布的中國安徽株(MF489147.1)蛋白氨基酸序列提交到在線工具Eexpasy進(jìn)行分析，結(jié)果顯示疫苗株和3個野毒株GIF蛋白的相對分子質(zhì)量分別為29 805.12、29 739.93、29 963.36、30 306.61，理論等電點分別為7.61、6.06、6.54、6.35?？偲骄杷笖?shù)、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、半衰期等理化性質(zhì)上均有相似的特征。疫苗株與三個野毒株GIF蛋白均為親水性不穩(wěn)定蛋白，四者的總平均疏水指數(shù)分別為-0.220、-0.177、-0.173、-0.195，不穩(wěn)定指數(shù)分別為48.15和45.40、48.09、47.94。

圖1 ORVF不同毒株編碼的 GIF基因核苷酸水平同源性分析

圖2 不同毒株 ORVF GIF基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.2 高級結(jié)構(gòu)及功能分析

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，ORFV疫苗株與野毒株編碼的 GIF蛋白的二級結(jié)構(gòu)都以α螺旋為主，其他如 β折疊、 轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)分布較少且分散(圖3)。疫苗株GIF蛋白在1-100aa區(qū)段的α螺旋數(shù)目比本次測得野毒株GIF蛋白在1-100aa區(qū)段的α螺旋數(shù)目要多，與國內(nèi)其他兩支野毒株的數(shù)目一樣，但分布有區(qū)別。三個野毒株GIF蛋白在區(qū)段40-120aa β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)分布密集，而疫苗株在該區(qū)段的β轉(zhuǎn)角數(shù)目分布稀少。利用TMHMM2.0工具包分析預(yù)測跨膜區(qū)可知疫苗株和三個野毒株的GIF蛋白的預(yù)測結(jié)果均無跨膜區(qū)(圖4)。用 SignalIP進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果均表明有信號肽的可能性極小，幾乎為零。推導(dǎo)的氨基酸序列提交在線工具Swiss-Model分析得到三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖5)，可以看出疫苗株和三個野毒株GIF蛋白的三維結(jié)構(gòu)在N、C兩端并無明顯差異，但在氨基酸序列238-256位無規(guī)則卷曲區(qū)域三個野毒株均比疫苗株的卷曲程度大。

A.α螺旋區(qū)段；B.β折疊區(qū)段；T.轉(zhuǎn)角區(qū)域；C.無規(guī)則卷曲區(qū)域

A.疫苗株；B.野毒株；C新疆株；D安徽株

圖4 ORFV GIF蛋白跨膜區(qū)

A.疫苗株；B.野毒株；C新疆株；D安徽株

3 討論

ORFV感染機(jī)體后，首先刺激機(jī)體啟動免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致各種先天免疫細(xì)胞誘導(dǎo)趨化因子和細(xì)胞因子的分泌，從而抵抗病毒的侵襲[19]。在與不同宿主的作用中，ORFV通過自身編碼的毒力因子，進(jìn)化出了一種免疫逃避的策略。多年來，ORFV與宿主免疫系統(tǒng)相互作用一直是研究的熱點[20]。ORFV的開放閱讀框ORF117基因，即GIF基因是在病毒感染的中晚期表達(dá)，編碼的毒力蛋白能夠抑制宿主免疫活性[16]。研究證實GIF缺失基因的病毒重組體在復(fù)制后很難進(jìn)行組裝，但其具體的分子機(jī)理并不清楚[21]。GIF是一種特異性的雙重細(xì)胞因子結(jié)合蛋白，能夠與GM-CSF、IL-2結(jié)合,并抑制二者活性，且僅有副痘病毒屬成員才編碼GIF基因[22]。鑒于GIF基因在ORFV致病中的重要作用，GIF基因的變異可能導(dǎo)致其致病的減弱，是開發(fā)弱毒疫苗的主要靶向基因。

本試驗對ORFV的GIF疫苗株和野毒株基因序列進(jìn)行生物學(xué)信息比較分析，結(jié)果顯示疫苗株和野毒株基因克隆的GIF基因組全長各為798 bp、795bp，各編碼265、264個氨基酸。ORFV的GIF疫苗株和野毒株核酸相似性分析結(jié)果顯示為94.3%，差異主要為單個堿基的突變，集中在CT堿基的替換。兩者的氨基酸序列相似性進(jìn)行推導(dǎo)的結(jié)果氨基酸位點有20處發(fā)生了變異，同時把疫苗株與中國安徽株(MF489147.1)、中國新疆株(KF666567.1)進(jìn)行比較也分別有15、14處變異，并且它們有9處發(fā)生同樣的變異。這些氨基酸位點的變異導(dǎo)致野毒株和疫苗株在40-130、150-189、200-260位點氨基酸殘基形成α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲的概率的變化。ORFV的GIF疫苗株和野毒株基因都無跨膜區(qū)，親水性區(qū)域相同且有信號肽的可能性較小。在理論等電點方面疫苗株比野毒株的都大，但3個野毒株的很接近，它們相對分子質(zhì)量方面也有差異。預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中疫苗株比本次克隆的野毒株少出9個β折疊區(qū)段，多6個無規(guī)則卷曲區(qū)域。疫苗株與另外兩個野毒株相比也符合這一趨勢，但在數(shù)目上沒有那么大的差別，這些變化與氨基酸位點突變密切相關(guān)。氨基酸殘基的改變導(dǎo)致其編碼蛋白親水性發(fā)生變化，也可能使B細(xì)胞表位產(chǎn)生差異。由于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊的化學(xué)鍵能較高，能較牢固的固定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，且經(jīng)常處于蛋白質(zhì)內(nèi)部[23]，因此這些變化說明羊傳染性膿皰病毒毒力的強(qiáng)弱可能和這類氨基酸位點突變有關(guān)。預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)有一定的區(qū)別，應(yīng)該是一、二級結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致三級結(jié)構(gòu)的差異。

本研究通過對ORFV疫苗株與野毒株GIF基因進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了二者在一、二、三級結(jié)構(gòu)的差異。本結(jié)果為進(jìn)一步研究GIF蛋白功能提供了新線索，同時闡明ORFV自身編碼的基因GIF在疾病防控中的作用提供了參考依據(jù)。