綿羊血液中布氏桿菌DNA提取方法的比較研究

丁可莉，楊發(fā)龍，張煥容，郭莉，陽愛國，莫茜，袁東波，侯巍*

(1. 西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 611130；2. 四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 611130)

布氏桿菌病(Brucellosis)是由布氏桿菌(Brucella)引起的重要人獸共患傳染病。雖然很多發(fā)達國家已成功清除該病，但在一些發(fā)展中國家，人布氏桿菌病每年的發(fā)病率達千萬分之三，而在一些流行地區(qū)，可高達千分之一以上[1]，全球每年有近50萬人布氏桿菌病新增病例[2]。我國自2000年以來布氏桿菌病的發(fā)病率不斷上升，雖然從2016年開始其發(fā)病率有所回落，但仍處于高位，成為重要的公共衛(wèi)生問題[3]。

人布氏桿菌病均是直接或間接經(jīng)動物傳染。其中，受感染的綿羊是農(nóng)牧區(qū)人感染布氏桿菌最主要的傳染源之一。獸醫(yī)、屠宰工人以及農(nóng)牧民等直接接觸感染綿羊胎兒、胎水、臟器、血液及分泌物等而感染，普通人群也可因消費羊肉制品或生乳制品而感染。因此，控制和清除綿羊布氏桿菌病，對于控制人布氏桿菌病具有重要的意義。

傳統(tǒng)的細菌分離鑒定是布氏桿菌病實驗室診斷的“金標準”。然而其不僅費時費力，而且對實驗室人員造成嚴重的生物安全威脅，不可能作為常規(guī)診斷手段。PCR可以從各種臨床樣本中直接檢測布氏桿菌核酸，無需進行細菌分離培養(yǎng)及鑒定，大大降低了生物安全問題，是一種快速、高度敏感及特異的病原學診斷技術(shù)。國內(nèi)外已建立了多種針對不同靶基因的布氏桿菌特異性PCR方法[4]。

PCR實現(xiàn)其敏感檢測的前提是要從樣本中獲得良好的病原DNA。然而，在很多情況下，由于在樣本中存在一些影響DNA提取的物質(zhì)以及抑制PCR擴增的因子，導致其敏感性大大下降，例如血清蛋白、體細胞成份、多糖以及組織和體液的其他成份[5]。因此，在利用PCR對不同樣本中的布氏桿菌進行檢測時，篩選和優(yōu)化DNA提取方法，是實現(xiàn)后續(xù)PCR敏感和準確檢測的重要前提[6-8]。

本研究對不同方法提取綿羊血液中布氏桿菌基因組DNA的效果，特別是對后續(xù)PCR檢測的影響進行了比較，從而為今后利用PCR等分子檢測手段對綿羊血液中的布氏桿菌的檢測提供方法學上的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

布氏桿菌病活疫苗(S2株)為天康生物股份有限公司產(chǎn)品，每頭份含活菌數(shù)為1.0×1010CFU，80頭份/瓶。

1.2 主要試劑

DNeasy Blood & Tissue Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品；TIANmp Blood DNA Kit為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit為AXYGEN公司產(chǎn)品；乙酸鈉、碘化鈉為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。蛋白酶K、飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、SDS、EDTA均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；PremixTaq、DL2000 DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 含不同濃度布氏桿菌血液樣本的制備

將布氏桿菌活疫苗用8 mL無菌生理鹽水重懸，隨后采用生理鹽水，進行10倍系列稀釋。從3只健康綿羊(布氏桿菌抗體檢測為陰性)采集抗凝血，分別進行以下處理：為盡量不改變血液組分，取 0.1 mL上述不同濃度的菌液，分別加至9.9 mL綿羊抗凝血中，最終制備每1 mL血液含有1×106～1CFU布氏桿菌的綿羊血液樣本。另將0.1 mL生理鹽水加入9.9 mL綿羊全血中，作為陰性對照。

1.4 總DNA提取

分別采用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)、TIANmp Blood DNA Kit (天根)、AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit(AXYGEN)以及酚/氯仿法和碘化鈉法，從上述含有不同濃度布氏桿菌的綿羊全血中提取總DNA。各方法主要過程如下。

酚/氯仿法[9]：吸取200 μL抗凝血，加入 500 μL STE、20 μL 10% SDS、20 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，混勻，在60 ℃下水浴2 h。加入500 μL酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)，混勻后10 000 r/min離心4 min。吸上清，加入500 μL氯仿：異戊醇(24∶1)，10 000 r/min離心3 min后取上清液，加入30 μL 5 mol/L 的NaCl，1000 μL在4 ℃預冷的無水乙醇，混勻，冰上靜置10 min， 10 000 r/min離心3 min，棄上清。加入500 μL 70%乙醇，10 000 r/min離心2 min，棄乙醇，風干約30 min，加入50 μL無菌水，渦旋，于-20 ℃儲存。

碘化鈉法[10]：取抗凝血樣品200 μL至2.0 mL EP管中，加入等量去離子水，顛倒混勻20下，室溫靜置2 min；加入400 μL 6 mol/L 碘化鈉溶液，顛倒混勻20下，室溫靜置2 min；加入800 μL在-20 ℃預冷的氯仿異戊醇混合液，上下震蕩混勻，室溫靜置2 min；12 000 r/min離心5 min后將上層的水相部分移至新的EP 管中，并加入0.6 倍體積的異丙醇及0.1倍體積3 mol/L、pH 5.2的醋酸鈉溶液，顛倒混勻，-20 ℃靜置5 min；12 000 r/min離心 5 min后倒掉離心管中的上清溶液，沿著離心管壁緩慢加入1000 μL預冷的70%乙醇，顛倒混勻，后12 000 r/min離心5 min；倒掉 EP 管中的乙醇，室溫靜置 5～10 min，直至離心管壁上無液體存在；在管底加入50 μL去離子水溶解DNA。

3種商品試劑盒的提取方法，均按產(chǎn)品說明書進行。

1.5 不同方法提取DNA的濃度及純度評價

為評價上述5種方法從綿羊全血提取總DNA的濃度、純度及完整性，利用各方法從含有布氏桿菌的綿羊血液樣本提取總DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop One超微量核酸蛋白測定儀測定提取DNA的OD260/OD280值和濃度。同時，各取4 μL DNA，采用1.0%的瓊脂糖進行電泳，以評價各方法提取DNA的完整性。

1.6 引物設計及合成

采用文獻[11]報道的布氏桿菌特異性引物，引物序列見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

引物引物序列(5′→3′)片段大小/bp退火溫度/℃BCSP31 B4TGGCTCGGTTGCCAATATCAABCSP31 B5CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG22359

1.7 不同方法提取布氏桿菌DNA的PCR擴增

為評價5種方法提取DNA的效果以及最終對布氏桿菌PCR檢測的影響。以上述用不同方法提取的、含有不同濃度布氏桿菌的綿羊血液DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；后進行35個94 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s的循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min后結(jié)束反應。PCR反應體系為20 μL：去離子水6 μL，PremixTaq10 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 不同方法的時間及經(jīng)濟成本比較

根據(jù)不同方法所使用試劑及操作過程，對各方法提取綿羊血液DNA的所需時間和成本進行概算和比較。

2 結(jié)果

2.1 不同方法提取的DNA濃度、純度及完整性

采用3種試劑盒、酚/氯仿法及碘化鈉法，從含有布氏桿菌的綿羊全血中提取DNA，通過核酸蛋白測定儀測定濃度及OD260/OD280值，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如表2及圖1。

表2 不同方法提取總DNA的純度和濃度

方法OD260/OD280DNA濃度/(μg/μL)AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit 1.88±0.0382.5±3.3TIANmp Blood DNA Kit1.42±0.0522.0±0.2DNeasy Blood & Tissue Kit1.73±0.0316.7±1.2碘化鈉法1.77±0.0595.9±1.8酚/氯仿法1.86±0.02637±3.0

從表2可知，TIANmp Blood DNA Kit 提取的DNA其OD260/OD280<1.6，表明提取的DNA有酚類或蛋白殘留；DNeasy Blood & Tissue Kit、碘化鈉法、AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit以及酚/氯仿法提取的DNA其OD260/OD280接近1.8左右，表明無明顯的蛋白及RNA污染。從獲取的DNA濃度來看，酚/氯仿法提取的DNA濃度最高，其次為碘化鈉法，而DNeasy Blood & Tissue Kit所得DNA濃度最低。

從圖1可以看出，各方法均得到了完整的總DNA分子，但在DNA濃度上有所差異，并與上述核酸蛋白測定儀測定的結(jié)果相一致。同時表明，酚/氯仿法提取DNA的電泳條帶不整齊，其點樣空處有雜質(zhì)殘留，說明可能含有較多的蛋白質(zhì)、酚類、糖或鹽等小分子雜質(zhì)。

2.2 不同提取方法對PCR檢測的影響

將不同濃度的布氏桿菌加入到綿羊血液中，并采用5種方法分別提取DNA，并作為模板，用布氏桿菌特異性PCR進行擴增，結(jié)果如圖2。

M. DNA分子質(zhì)量標準DL2000; 1. AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit；2. TIANmp Blood DNA Kit;3. DNeasy Blood & Tissue Kit；4.碘化鈉法；5.酚氯仿法

圖1 不同方法提取綿羊血液DNA的電泳分析

M. DNA分子量標準；N. 無模板對照;1～7. 每mL含1×106～1 CFU布氏桿菌的綿羊全血總DNA

圖2 不同DNA提取方法對布氏桿菌特異性PCR檢測的影響

以3種商品化試劑盒及碘化鈉法提取的DNA作為PCR模板，采用布氏桿菌特異性PCR可檢測到每mL綿羊血液中低至10 CFU的布氏桿菌，而采用酚/氯仿法提取的DNA為模板，PCR僅能從每mL含有1×106CFU布氏桿菌的綿羊血液獲得陽性擴增。

2.3 成本及時間效率概算

為進一步評價各方法提取DNA的時間效率以及經(jīng)濟成本，對各方法提取一個樣本所需時間和經(jīng)濟成本進行概算，如表2。從所需時間上看，3種試劑盒所需時間相當且最短，而酚氯仿法所需時間最長近3 h，碘化鈉法所需時間為56 min。從提取的經(jīng)濟成本進行估算，DNeasy Blood & Tissue Kit成本最高，每個樣本提取成本約35元，其次是AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit和TIANmp Blood DNA Kit，而酚氯仿法和碘化鈉法成本最低，僅約為1元。

3 討論

布氏桿菌病作為重要的人獸共患病，準確、快速的診斷是對其進行綜合防控的關(guān)鍵。目前常用的SAT、RBT以及ELISA等血清學方法雖然是對該病進行診斷和流行病學調(diào)查的重要手段，但血清學方法作為間接診斷手段，檢測結(jié)果不僅受感染階段的影響，同時無法反映出感染的狀態(tài)，而病原學檢測可以為疾病的診斷提供直接證據(jù)。

表3 不同提取方法所需時間及經(jīng)濟成本概算

方法提取時間/min成本概算/元AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit 389TIANmp Blood DNA Kit387DNeasy Blood & Tissue Kit4035碘化鈉法561酚氯仿法1801

布氏桿菌感染動物后，經(jīng)急性期感染，其菌體往往潛伏在淋巴結(jié)等組織，從而可進入血液等體液[12-13]。血液是對布氏桿菌病進行病原學診斷和流行病學調(diào)查的重要樣本之一，與淋巴結(jié)等其他組織樣本相比，采集方便，更具有可行性。此外，傳統(tǒng)的布氏桿菌的分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)不僅因生物安全等原因缺乏可操作性，而且從血液中進行分離培養(yǎng)時，其敏感性遠小于PCR等分子檢測方法[14]。

雖然對血液中布氏桿菌DNA進行分子檢測是對布氏桿菌病診斷和流行病學調(diào)查的有用方法，然而不同報道中采用PCR對血液中布氏桿菌的檢測效果并不一致[14-16]。其重要原因之一是由于血液中往往存在更多PCR擴增抑制物(如抗凝劑以及血紅蛋白等)[16]，因此，篩選使用良好DNA提取方法對于后續(xù)PCR檢測效果至關(guān)重要。

本研究對3種試劑盒以及酚/氯仿法和碘化鈉法提取綿羊全血中布氏桿菌DNA的效果和對PCR檢測的影響進行了比較。其中，酚/氯仿法作為經(jīng)典的DNA提取方法，主要是利用十二烷基磺酸鈉、蛋白酶K、飽和苯酚和氯仿等成分有效地裂解細胞膜、去除蛋白質(zhì)從而獲得DNA。本研究結(jié)果表明，采用酚/氯仿法從綿羊血液提取總DNA，其得率(濃度)遠高于其他方法，而且蛋白及RNA的污染較少，但采用該方法提取DNA時，利用PCR對綿羊血液布氏桿菌的檢測下限僅為1×106CFU/mL，遠低于其他4種方法，分析其主要原因是由于該方法無法有效去除血液中的PCR抑制劑[17-18]。因此，酚/氯仿法不適合用于綿羊血液中布氏桿菌DNA提取。

基于硅膠膜的試劑盒法提取基因組 DNA 效率高并且可減少有機試劑對人體的傷害，近年來也得到了普遍的認可和應用。本研究的結(jié)果表明，盡管選擇的3種國內(nèi)外試劑盒提取的DNA純度有一定的差異，但均能有效提取綿羊血液中布氏桿菌的DNA，并能用于PCR敏感檢測。但是商業(yè)試劑盒成本較高，如不考慮成本的因素，試劑盒法最為理想。但在實際檢測過程中，需要大批量檢測樣本，基層單位在檢測過程中對成本的限制較大，需要在保證檢測品質(zhì)的同時降低成本，以適應市場的需求。

碘化鈉法是利用在低滲的雙蒸餾水中,破壞血中紅細胞膜及白細胞膜,放出血紅蛋白及胞核，加入碘化鈉后破壞核膜并解離DNA-蛋白質(zhì)復合物，再以氯仿/異戊醇抽提使蛋白質(zhì)變性，然后用異丙醇沉淀DNA從而獲得DNA。本研究采用碘化鈉法所獲得的DNA濃度較高，沒有蛋白和RNA污染，可以在短時間內(nèi)完成DNA的提取且價格低廉，經(jīng)PCR擴增也可獲得目的條帶，因此可用于臨床大量血液樣本的批量提取、流行病學調(diào)查等，具有較高的實用價值。

總之，本研究比較了5種方法對綿羊血液中布氏桿菌DNA的提取及PCR檢測的影響，碘化鈉法具有成本低、時間較短、操作簡單的優(yōu)點。基于硅膠膜的3種試劑盒，均能有效地提取血液中基因組 DNA，且配備成套試劑，具有安全、方便、規(guī)范的優(yōu)點，但檢測成本較高，不適于基層單位在實際檢測中大批量樣本檢測。常規(guī)的酚氯仿法不能很好地去除混在樣本中的 PCR 抑制劑，故不利于 PCR 擴增，因此不適于從綿羊血液中提取基因組DNA，有必要對其進行改良。