云南省騰沖市牛羊感染梨形蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查

沈雪鷹，何志海，傅國璋，姚明國，張云，江佳富，孫毅，蔣寶貴，劉洪波，杜春紅*

(1. 云南省地方病防治所，云南 大理 671000；2. 云南省騰沖市動物疫病控制中心，云南 騰沖 679100；3. 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；4. 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071；5. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心,北京 100071)

梨形蟲(Prioplasma)屬頂復(fù)門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoa)、梨形蟲目(Piroplasmida)的原蟲，對動物致病的重要梨形蟲大多數(shù)屬于巴貝斯蟲屬(Babesia)和泰勒蟲屬(Thelieria)，可引起巴貝斯蟲病和泰勒蟲病，既往也稱為“焦蟲病”、“血孢子蟲病”等。臨床癥狀以高熱、貧血、黃疸、消瘦和血紅蛋白尿為主，慢性和隱形感染者可導(dǎo)致動物產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量下降，是一種分布廣泛、嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展、經(jīng)蜱傳播的重要血液原蟲病，有部分巴貝斯蟲，如分歧巴貝斯蟲、微小巴貝斯蟲、獵戶巴貝斯蟲對人也有致病性。該疾病的地理分布和發(fā)病季節(jié)均與蜱類的分布和活動密切相關(guān)。騰沖市位于云南省西部邊陲，北部和西北部與緬甸聯(lián)邦共和國接壤，是中國通向南亞、東南亞的重要門戶和節(jié)點。境內(nèi)森林資源豐富，森林覆蓋率達(dá)70.7%，橫貫全境的高黎貢山，因具有較高的生物多樣性特征，被聯(lián)合國教科文組織列為“生物多樣性保護圈”。適宜的氣候和植被環(huán)境，給媒介昆蟲的繁衍造就了天然條件。而畜牧業(yè)是騰沖市發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟的重要產(chǎn)業(yè)，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，家畜運輸和交易頻繁，將導(dǎo)致動物傳染病隨之?dāng)U散。為進一步全面了解本市家畜梨形蟲病的流行狀況和特點，本研究首次對我市養(yǎng)殖的牛羊進行梨形蟲病分子流行病學(xué)調(diào)查，旨在為梨形蟲的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家畜血樣采集

在云南省騰沖市曲石、滇灘、中和、猴橋、界頭、芒棒、騰越、明光、荷花、固東、蒲川等11個鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集牛、羊血樣758份，其中牛331份，羊427份。采樣區(qū)分布見圖1。用一次性靜脈采血針和無菌EDTA抗凝管采集動物頸靜脈血，放冷藏箱中保存，帶回實驗室進行相關(guān)檢測。

1.2 試劑

血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit, lot:03625)，DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)(Thermo Fisher Scientific)，DL2000 DNA Marker(Takara)。

圖1 調(diào)查樣本采集區(qū)分布

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

取200 μL抗凝血液到2 mL PE管中，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.2 梨形蟲18S rRNA基因PCR擴增

采用泰勒蟲屬和巴貝斯蟲屬在內(nèi)的梨形蟲科原蟲通用引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)、Touch-Down PCR擴增梨形蟲18S rRNA基因。第1輪擴增引物為Piro0F_(5′-GCCAGTAGTCATATGCTTGTGTTA-3′)和Piro6R_(5′-CTCCTTCCTYTAAGTGATAAGGTTCAC-3′)；第2輪擴增引物為Piro1F_(5′-CCATGCATGTCTWAGTAYAARCTTTTA-3′)和Piro5.5R_(5′-CCTYTAAGTGATAAGGTTCACAAAACTT-3′)。預(yù)期片段大小約為1 600 bp。

反應(yīng)條件：第1輪和第2輪擴增條件相同，95 ℃預(yù)變性3 min，前20個循環(huán)：95 ℃變性30 s，60→50 ℃退火30 s(每個循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃)和72 ℃延伸1 min 30 s；后10個循環(huán)：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min 30 s，最后72 ℃終延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 序列測定與分析

PCR陽性擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。利用CLC Genomics Workbench 3.6.1將所得序列進行拼接。登錄美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具將測序結(jié)果與GenBank中注冊基因序列進行同源性比對，根據(jù)本領(lǐng)域種類鑒定標(biāo)準(zhǔn)，以種間序列相似性≥99%，結(jié)合不同來源等生態(tài)學(xué)特征，判定為同一蟲種。應(yīng)用MEGA6.06軟件，鄰接法Neighbor-Joining，Kimura 2-parameter model，bootstrap 1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對獲得的陽性樣本序列進行遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 梨形蟲檢測

牛、羊血液DNA的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以出現(xiàn)約1 600 bp大小的條帶、產(chǎn)物測序成功者為陽性。共檢出陽性207頭，總陽性率27.31%。其中羊檢出陽性58頭，陽性率為13.58%；牛檢出陽性149頭，陽性率為45.02%；梨形蟲分布在騰沖市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)，以周邊山區(qū)為主(見圖1，表1)。,有6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊血檢出陽性，陽性率高低依次為荷花鎮(zhèn)(66.67%)、滇灘鎮(zhèn)(45.00%)、明光鎮(zhèn)(28.57%)、界頭鎮(zhèn)(6.25%)、芒棒鎮(zhèn)(4.76%)，全部鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牛均檢出陽性，陽性率在6.67%～100%之間，其中猴橋鎮(zhèn)某養(yǎng)殖戶的20頭牛均檢出陽性。

表1 騰沖市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛羊犁形蟲檢測結(jié)果 頭

2.2 感染梨形蟲的種類

本調(diào)查檢出巴貝斯蟲和泰勒蟲兩屬共13 種，均為蜱傳血液原蟲，包括8種泰勒蟲：呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)、環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、水牛泰勒蟲(T.buffeli)、東方泰勒蟲(T.orientalis)、瑟氏泰勒蟲(T.sergenti)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)、附膜泰勒蟲(T.velifera)和一種新的未命名泰勒蟲；5種巴貝斯蟲分別是：狍巴貝斯蟲(B.capreoli)、獵戶巴貝斯蟲(B.venatorum)、雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、微小巴貝斯蟲(B.microti)。

2.2.1 巴貝斯蟲感染情況

共檢出37份、5種巴貝斯蟲。其中羊感染狍巴貝斯蟲(1例)、獵戶巴貝斯蟲(3例)，牛感染雙芽巴貝斯蟲(21例)、牛巴貝斯蟲(10例)、微小巴貝斯蟲(1例)、獵戶巴貝斯蟲(1例)，共4種33例。從地區(qū)分布來看，雙芽巴貝斯蟲從7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牛中檢出，牛巴貝斯蟲在6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢出，狍巴貝斯蟲、微小巴貝斯蟲、獵戶巴貝斯蟲各在1個鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢出。檢出種類最多的是中和鎮(zhèn)，共檢出4種13例，陽性率最高是騰越鎮(zhèn)10.45%(7/67)。不同牛羊個體來源的同種巴貝斯蟲約1 600 bp基因序列差異在0.0和0.015之間。21個雙芽巴貝西蟲序列遺傳距離為0.0-0.004不等，在黃牛和奶水牛中檢出的雙芽巴貝西蟲序列存在更大差異。

2.2.2 泰勒蟲感染情況

共檢出170頭共計8種泰勒蟲。其中羊感染的54頭有呂氏泰勒蟲(51例)、綿羊泰勒蟲(2例)和附膜泰勒蟲(1例)；牛感染的116例有環(huán)形泰勒蟲(2例)、水牛泰勒蟲(53例)、東方泰勒蟲(51例)、瑟氏泰勒蟲(4例)、呂氏泰勒蟲(2例)、附膜泰勒蟲(2例)和未命名泰勒蟲(2例)。不同牛羊個體來源的同種泰勒蟲約1 600bp基因序列差異在0.0和0.020之間。

牛和羊都有感染的有呂氏泰勒蟲和附膜泰勒蟲。羊感染呂氏泰勒蟲分布于6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)；牛以水牛泰勒蟲(53/170)、東方泰勒蟲(51/170)為主，前者除曲石鎮(zhèn)以外，后者除明光、固東和曲石以外，其它鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有分布。感染率最高的猴橋鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場的20頭牛全部均有感染，包括3種泰勒蟲。

2.3 感染梨形蟲序列分析

測序成功的陽性樣本，挑選代表性序列在NCBI網(wǎng)站分別注冊序列號。所得巴貝斯蟲序列分別與GenBank中注冊的核苷酸序列進行同源性比較，檢出的5種巴貝斯蟲與相應(yīng)巴貝斯蟲蟲種的同源性均>99%。以間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax，JQ627158)為外類群建系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果表明，山羊中檢出的狍巴貝斯蟲，與德國、法國、意大利等地在鹿和馬中檢出的聚在同一分枝：在山羊和水牛中檢出的獵戶巴貝斯蟲，與在甘肅白牦牛中檢出的序列、黑龍江、新疆、蒙古等地的人群和蜱中檢出的序列聚在一個大簇，但分別獨處一個小分枝；在黃牛和奶水牛中檢出的雙芽巴貝斯蟲，與國內(nèi)多地檢出的序列同源性>99%；在黃牛和水牛中檢出的牛巴貝斯蟲，同源性>99%，進化分析分為2小簇，一部分與國內(nèi)家畜中檢出的序列聚得較近，一部分與南非、美國等地從牛和鹿中檢出的序列聚得較近；而在水牛中檢出的微小巴貝斯蟲，與在國內(nèi)多地的患者和鼠類檢出的序列同源性在99%以上，聚在同一分枝。見圖2。以上結(jié)果表明，本次檢出的不用巴貝斯蟲均能進行系統(tǒng)的分類，但存在自身的獨特特點。

梨形蟲以微小巴貝斯蟲(Babesiamicroti,AB242176.1) 為外類群建系統(tǒng)進化樹，各蟲種均與參考序列聚在各自的小分枝里。2份牛血中檢出的呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)與羊血中檢出的序列同源性較高，聚在一起。一種新的未命名的泰勒蟲2份樣本(TC-B-562，567)與韓國和國內(nèi)檢出的序列同源性最高，和水牛泰勒蟲聚在一簇，但獨處一個分枝； TC-B-296序列則與日本巖手縣報道的在臺灣鬣羚檢出的泰勒蟲序列同源性最高(>99%)，最接近的為呂氏泰勒蟲。這些蟲種是否為一個單獨的種或亞種，還有待研究。見圖3。

●為本研究檢出的序列

圖2 基于巴貝斯蟲18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

●為本研究檢出的序列

圖3 基于泰勒蟲18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

騰沖市下轄18個鄉(xiāng)鎮(zhèn)(7個鄉(xiāng)、11個鎮(zhèn))，畜牧業(yè)是當(dāng)?shù)剞r(nóng)村的重要產(chǎn)業(yè)，市內(nèi)還有騰沖馬、檳榔江水牛、明光小耳豬、騰沖雪雞、騰沖綿羊等優(yōu)良地方畜禽品種和遺傳資源。梨形蟲是一類嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展的蜱傳寄生蟲病，為了解該病在我市家畜中的感染情況，本次調(diào)查共在11個鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集牛、羊血樣進行調(diào)查。既往，血液原蟲病多采用血涂片染色鏡檢法，但較為費時，且不同發(fā)育時期的不同蟲種形態(tài)特征較為復(fù)雜，對檢測人員的要求較高，容易漏檢，但形態(tài)學(xué)檢測是診斷寄生蟲病的金標(biāo)準(zhǔn)。分子生物學(xué)檢測敏感性和特異性較高，尤其是帶蟲量少時，較血涂片檢出率高，還能對感染蟲種進行定種鑒定[1]。因而本次調(diào)查采用擴增梨形蟲18S rRNA基因1 600 bp片段的方法，根據(jù)擴增到目的片段的測序結(jié)果進行蟲種鑒別。因此，如將形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合，將有利于提高檢出率和準(zhǔn)確率。本研究暫運用分子生物學(xué)方法，調(diào)查我市牛羊感染梨形蟲的情況。在758份樣本中檢出陽性并測序成功207份，總陽性率為27.31%。其中羊的感染率為13.58%(58/427)，牛的感染率為45.02%(149/331),所有鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牛均存在感染，6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊檢出陽性。陽性集中在猴橋鎮(zhèn)、滇灘鎮(zhèn)、明光鎮(zhèn)、騰越鎮(zhèn)和中和鎮(zhèn)。我國家畜中感染梨形蟲較為普遍，據(jù)調(diào)查在全國12個省市、自治區(qū)均有分布，家畜和野鼠均有感染[2-5]。相關(guān)文獻報道，我國南方貴州、廣東、重慶的羊泰勒蟲感染率分別達(dá)46.80%、90.9%、12.7%[6]，吉林省部分地區(qū)為28.08%[7]，新疆庫車縣羊梨形蟲感染率高達(dá)52.79%[8]。本次調(diào)查表明當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖牛羊中流行梨形蟲病，以牛感染泰勒蟲為主，分布廣泛。

目前，全世界報道的哺乳動物巴貝斯蟲共67種，泰勒蟲有13種，近年不斷有新種被證實和發(fā)現(xiàn)。其中牛感染泰勒蟲主要有 5種:環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、突變泰勒蟲(T.mutans)、瑟氏泰勒蟲(T.sergenti)、小泰勒蟲(T.parva)、中華泰勒蟲(T.sinensis)[9]；巴貝斯蟲主要有5種：雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、大巴貝斯蟲(B.major)、卵形巴貝斯蟲(B.ovata)和東方巴貝斯蟲(B.orientalis)。羊感染泰勒蟲有6種：萊氏泰勒蟲(T.lestoquardi)、隱藏泰勒蟲(T.recondita)、分離泰勒蟲(T.separata)、尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)和綿羊泰勒蟲(T.ovis)；巴貝斯蟲有9種：莫氏巴貝斯蟲(Babesia.motasi)、綿羊巴貝斯蟲(Babesia.ovis)、微小巴貝斯蟲(Babesiamicroti)、雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)、分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)、泰氏巴貝斯蟲(Babesia.taylory)、粗糙巴貝斯蟲(Babesia.crassa)、葉狀巴貝斯蟲(Babesia.foliata)和狍巴貝斯蟲(Babesiacapreoli)等[10]。我國牛、羊、馬、犬等家養(yǎng)已發(fā)現(xiàn)9種巴貝斯蟲和7種泰勒蟲[11]。其中尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲是我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)并命名的新蟲種[12]。一般認(rèn)為，萊氏、尤氏、呂氏泰勒蟲具有強致病性，屬于惡性泰勒蟲，環(huán)形泰勒蟲、小泰勒蟲對牛也有高度致病性，易致易感動物患病甚至死亡。其它為弱毒或無致病性，屬于溫和型泰勒蟲。同時，巴貝斯蟲的致病性主要還取決于宿主的免疫狀態(tài)。部分蟲種如微小巴貝斯蟲(Babesiamicroti)、分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)、獵戶巴貝斯蟲(Babesiavenatorum)、鄧肯巴貝斯蟲(Babesiaduncani)等可對人致病，一般認(rèn)為泰勒蟲不感染人。根據(jù)檢測到的核苷酸序列比對和遺傳進化分析，本次調(diào)查共檢出巴貝斯蟲和泰勒蟲兩屬共13 種蜱傳血液原蟲：5種巴貝斯蟲和8種泰勒蟲。優(yōu)勢蟲種為呂氏泰勒蟲、水牛泰勒蟲、東方泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲。羊以感染呂氏泰勒蟲為主，牛以水牛泰勒蟲、東方泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲為主，有對家畜致病性較強的蟲種，也有對人有致病性的蟲種。一些種類如類獵戶巴貝斯蟲、狍巴貝斯蟲是尚不明確其致病性的。在牛中檢出2例呂氏泰勒蟲，尚需進一步驗證。同時，通過18S rRNA核苷酸序列比對和遺傳進化分析的方法來確定蟲種，還存在一些不足，如能結(jié)合P32、COI、28S rDNA等其它目的基因的檢測，將更有利于蟲種的確認(rèn)及病原體溯源等研究。

云南省是我國記錄蜱種最多的省份，也是蟲媒傳染病的高發(fā)區(qū)和主要流行區(qū)。騰沖市位于云南省西南部，境內(nèi)多高山，海拔高差顯著(930～3 780 m)，橫貫境內(nèi)的高黎貢山是橫斷山脈的組成部分，森林覆蓋率較高，野生動物豐富。本市壩區(qū)(河谷)面積占總面積的16%，山區(qū)、半山區(qū)面積占84%，加之氣候濕潤，降雨量豐沛，適合蜱蟲生長。由于山區(qū)、半山區(qū)地理條件的限制，養(yǎng)殖業(yè)是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)人口的主要經(jīng)濟來源，近年來規(guī)模養(yǎng)殖也得到快速發(fā)展。既往相鄰地區(qū)大理、梁河等地有牛、羊、豬等動物巴貝斯蟲病暴發(fā)流行的報道[13-15]，近年有當(dāng)?shù)鼐用窀腥景拓愃瓜x的病例報道[16]，本市醫(yī)療機構(gòu)病人調(diào)查也反映出[17]，家中飼養(yǎng)家畜尤其是牛染蜱常見。本次從家畜中檢出多種梨形蟲，包括對人致病的微小巴貝斯蟲、未命名的新種蟲種、對人致病性較強但序列存在差異的獵戶樣巴貝斯蟲。有強致病性的，也有溫和型的。雖然陽性率與國內(nèi)其它地方相比并不算高，但在同一地區(qū)檢出如此多種類梨形蟲的情況較為少見。這與騰沖市具有良好的自然環(huán)境、較高的生物多樣性特征密切相關(guān)，尤其家畜放養(yǎng)，增加了通過媒介蜱將病原體從野生動物向家畜傳播的機會。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，跨地區(qū)運輸交易頻繁等可導(dǎo)致疾病隨之傳播，一旦流行則很難根除，成為梨形蟲病的自然疫源地。而蜱蟲攜帶和傳播的病原體不僅有梨形蟲，還包括病毒、細(xì)菌、立克次體等。提示在發(fā)展畜牧業(yè)的同時，需加強動物圈舍、動物體表的滅蜱，輸入家畜的檢疫，以及從業(yè)人員提高防范意識，避免被蜱蟲叮咬。獸醫(yī)應(yīng)加強對梨形蟲病的認(rèn)識，及時治療病畜，控制疾病傳播，從而降低梨形蟲病及其它蜱傳疾病對當(dāng)?shù)厝巳航】岛托竽翗I(yè)發(fā)展帶來的危害。