基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及其受體CXCR4在翼狀胬肉中的表達(dá)及意義

劉倉倉,曹小彪,黃建波，高曉唯,任 兵,任紅燕，蔡 巖

0 引言

翼狀胬肉是一種呈翼狀增生并侵及角膜的良性纖維血管病變，其發(fā)病機(jī)制包括紫外線的生物學(xué)效應(yīng)、免疫學(xué)說、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、角膜緣干細(xì)胞移行學(xué)說、細(xì)胞凋亡等[1]。近來研究表明，翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展與新生血管有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor,SDF-1)通過與特異性受體趨化因子受體(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)結(jié)合，趨化CD34+細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)血管生成，從而參與了許多血管新生性疾病的發(fā)病過程[3-4]。本研究探討翼狀胬肉組織中SDF-1/CXCR4在其發(fā)生和發(fā)展中的作用及其意義。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象

1.1.1標(biāo)本的來源及收集收集2018-01/10在解放軍第四七四醫(yī)院行翼狀胬肉切除術(shù)的標(biāo)本60例60眼，均來源于鼻側(cè)靜止期翼狀胬肉，男24例，女36例；其中年齡<50歲組30眼，年齡27～49(平均40.23±6.56)歲，年齡>50歲組30眼，年齡52～82(平均62.23±8.47)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)按照診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的位于鼻側(cè)靜止期的翼狀胬肉；(2)頭部長入角膜2～4mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)復(fù)發(fā)性翼狀胬肉；(2)活動(dòng)性眼部炎癥；(3)假性翼狀胬肉；(4)單眼多發(fā)的翼狀胬肉。

同期收集視網(wǎng)膜脫離術(shù)或斜視矯正手術(shù)中切除的多余正常結(jié)膜組織30例30眼，其中男12例，女18例；年齡<50歲組15眼，年齡26～44(平均37.40±5.50)歲，年齡>50歲組15眼，年齡55～71(平均60.60±4.62)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡相匹配單純孔源性視網(wǎng)膜脫離術(shù)或斜視矯正手術(shù)中患者的鼻側(cè)角鞏緣結(jié)膜組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)眼或?qū)?cè)眼有翼狀胬肉或瞼裂斑；(2)既往有手術(shù)史；(3)術(shù)眼有角結(jié)膜病史；(4)術(shù)眼有外傷史者。所有翼狀胬肉患者均采用翼狀胬肉切除+自體球結(jié)膜移植術(shù)治療。兩組族別、性別、年齡、有無全身病及病史等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1、2。而室外工作者翼狀胬肉的患病率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本項(xiàng)研究經(jīng)中國人民解放軍第四七四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：2014-倫審字-27)，所有患者均被告知并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器兔抗人SDF-1單克隆抗體(英國abcam有限公司)；山羊抗人CXCR4多克隆抗體(英國abcam有限公司)；SP兔二步法試劑盒(北京中杉金橋公司)、SP山羊二步法試劑盒(北京中杉金橋公司)、DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理將收集的組織標(biāo)本用生理鹽水沖洗干凈，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測標(biāo)本中SDF-1和CXCR4的表達(dá)將組織用石蠟包埋，行3μm連續(xù)切片，每個(gè)組織取5張切片，用作免疫組織化學(xué)染色和HE染色。石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，去除過氧化氫酶活性，微波修復(fù)，羊血清封閉，滴加兔抗人SDF-1單克隆抗體(稀釋濃度1∶100)或山羊抗人CXCR4多克隆抗體(稀釋濃度1∶150)，濕盒內(nèi)4℃過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。用已知的SDF-1和CXCR4陽性表達(dá)組織切片作為陽性對(duì)照；空白對(duì)照選用0.01mol/L PBS緩沖液代替一抗。置于顯微鏡下觀察標(biāo)本的上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，采用image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量隨機(jī)5個(gè)視野的光密度值，取平均值，所得值為該區(qū)域的光密度值。HE染色切片了解組織的大體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1翼狀胬肉組織病理學(xué)特征顯微鏡下，正常結(jié)膜組織可分為上皮層和基質(zhì)層，上皮層下基質(zhì)層血管較疏松，有散在的毛細(xì)血管和少量的成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞(圖1A,細(xì)箭頭所示)。翼狀胬肉組織的上皮層鱗狀上皮增生明顯，基質(zhì)層有較多纖維組織和新生血管組織，伴有較多炎性細(xì)胞的浸潤(圖1B,細(xì)箭頭所示)，部分切片中還可看到嗜堿性物質(zhì)和變性物質(zhì)的存在(圖1C,粗箭頭所示)。

2.2 SDF-1和CXCR4在不同年齡的翼狀胬肉患者中的表達(dá)通過免疫組化方法，可以觀察到SDF-1和CXCR4蛋白在正常結(jié)膜中僅見上皮基底層細(xì)胞有少量陽性表達(dá)或不表達(dá)，而在翼狀胬肉組織的全層上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)SDF-1和CXCR4陽性染色的棕黃色顆粒，見圖2、3。

2.3 SDF-1和CXCR4在不同年齡的翼狀胬肉患者中的平均光密度值SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉組織中的表達(dá)量明顯高于正常結(jié)膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)。SDF-1在不同年齡翼狀胬肉組中的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，但是年齡<50歲組翼狀胬肉表達(dá)量的均值高于年齡>50歲翼狀胬肉組(表4)。年齡<50歲組翼狀胬肉CXCR4表達(dá)量高于年齡>50歲翼狀胬肉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表4)。不同年齡正常結(jié)膜的SDF-1和CXCR4的表達(dá)無明顯差異，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

圖1正常結(jié)膜和翼狀胬肉的組織結(jié)構(gòu)(HE染色×400)A：正常結(jié)膜，箭頭所示炎性細(xì)胞；B：小于50歲的翼狀胬肉患者，箭頭所示為炎性細(xì)胞；C：年齡大于50歲的翼狀胬肉患者，粗箭頭指變性物質(zhì)。

圖2SDF-1在正常結(jié)膜和翼狀胬肉中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)法×400)A：正常結(jié)膜；B：年齡<50歲的翼狀胬肉患者；C：年齡>50歲的翼狀胬肉患者。

表1 翼狀胬肉與正常結(jié)膜組患者的一般資料

注：-：表示采用Fisher確切概率法。

表2 不同年齡翼狀胬肉組間病史的差異性分析 眼(%)

表3 SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉與正常結(jié)膜組間的差異性分析

表4 SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉與正常結(jié)膜組不同年齡的差異性分析

圖3CXCR4在正常結(jié)膜和翼狀胬肉中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)法×400)A：正常結(jié)膜；B：年齡<50歲的患者；C：年齡>50歲的患者。

2.4 SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉組織和正常結(jié)膜組織中表達(dá)的相關(guān)性翼狀胬肉患者中SDF-1蛋白和CXCR4蛋白進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析顯示兩者呈正相關(guān)(r=0.412，P=0.001)。正常結(jié)膜組織中SDF-1和CXCR4表達(dá)的平均光密度相關(guān)性分析顯示兩者呈正相關(guān)(r=0.946，P<0.001)。

3 討論

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，發(fā)生的主要環(huán)境因素是暴露于紫外線，這與我們的一般資料結(jié)果分析中室外作業(yè)者翼狀胬肉的發(fā)生率高結(jié)果一致[5]。正常人眼中鼻側(cè)結(jié)膜的血管低于其他位置的結(jié)膜血管(顳側(cè)、上方和下方)[6]，鼻側(cè)結(jié)膜更容易缺氧。發(fā)生缺氧損傷后，來自內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia induced factor-1，HIF-1)導(dǎo)致體內(nèi)SDF-1在缺血組織中的表達(dá)，SDF-1介導(dǎo)骨髓衍生的CXCR4的募集，將祖細(xì)胞表達(dá)到損傷部位，從而促進(jìn)了翼狀胬肉的增生。

病理形態(tài)學(xué)觀察，正常結(jié)膜組織結(jié)構(gòu)簡單，基質(zhì)層細(xì)胞數(shù)量較少，翼狀胬肉中的炎性細(xì)胞數(shù)則明顯增多，成纖維細(xì)胞增殖活躍，且新生血管豐富，提示炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增殖，新生血管增生與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

SDF-1是新近發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，主要在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[7]，作為器官的修復(fù)器而引起人們的注意[8]，在人體的外周血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元中表達(dá)[9]。SDF-1將表達(dá)CXCR4的細(xì)胞募集到損傷部位來促進(jìn)損傷愈合[10]。然而過量的SDF-1/CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)能促進(jìn)纖維血管瘢痕形成[11]，相反，抗SDF-1治療可減輕體內(nèi)組織纖維化[12]。SDF-1可能通過雙重過程介導(dǎo)纖維血管瘢痕為特征的翼狀胬肉：SDF-1表達(dá)的上調(diào)和通過與CXCR4的相互作用參與肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。SDF-1是眾所周知的CXCR4表達(dá)細(xì)胞的募集者[13]，因此，Kim等[12]認(rèn)為CXCR4+細(xì)胞可能跨內(nèi)皮遷移到翼狀肉中誘導(dǎo)纖維化而發(fā)生翼狀胬肉。他們還使用特異性CXCR4阻斷劑和SDF-1的小分子干擾RNA體外下調(diào)SDF-1/CXCR4的信號(hào)傳導(dǎo)通路，均降低了a-SMA表達(dá)。因此認(rèn)為這種軸的下調(diào)可能潛在地暗示了翼狀胬肉成纖維細(xì)胞活性的可逆。Ding等[14]認(rèn)為在SDF-1/CXCR4生物軸被抑制的條件下，肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能不會(huì)完全受損。該假設(shè)推測其他機(jī)制可能參與翼狀胬肉的肌肉成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且還提出了在翼狀胬肉發(fā)生期間在體內(nèi)早期抑制SDF-1/CXCR4軸的要求。

本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SDF-1和CXCR4在在翼狀胬肉組織的整個(gè)上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)都出現(xiàn)棕黃色的陽性表達(dá)，以基底層細(xì)胞中表達(dá)更為突出，呈現(xiàn)明顯極性。在一些翼狀胬肉組織中在基質(zhì)中的相同位置中檢測到SDF-1和CXCR4表達(dá)。此外，CXCR4+細(xì)胞主要在血管周圍區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，也可見于血管內(nèi)區(qū)域。SDF-1和CXCR4在翼狀胬肉中的表達(dá)水平上調(diào)，提示SDF-1/CXCR4可能參與翼狀胬肉的形成。翼狀胬肉有較強(qiáng)的血管增生性，SDF-1和CXCR4可作為評(píng)判血管新生能力的重要指標(biāo)。

用IPP6.0軟件分析光密度值，翼狀胬肉組織中SDF-1和CXCR4的平均光密度明顯高于正常結(jié)膜組織(P<0.05)，說明翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展與新生血管密切相關(guān)。年齡<50歲翼狀胬肉患者中CXCR4表達(dá)量高于年齡>50歲患者的表達(dá)量(P<0.05)，提示年輕患者的血管增生能力可能更強(qiáng)。而年齡<50歲翼狀胬肉患者中SDF-1表達(dá)量與年齡>50歲的患者表達(dá)量無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是年齡<50歲組翼狀胬肉表達(dá)量的均值高于年齡>50歲翼狀胬肉組(表4)，可能與樣本量相對(duì)較少有關(guān)。翼狀胬肉患者中SDF-1蛋白和CXCR4蛋白進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析顯示兩者呈正相關(guān)，這與Kim等[12]的研究結(jié)果相似，SDF-1是CXCR4+表達(dá)細(xì)胞的募集者，將CXCR4+細(xì)胞募集到傷口區(qū)域來促進(jìn)損傷愈合。而正常結(jié)膜中SDF-1和CXCR4的表達(dá)相關(guān)更明顯，可能是由于SDF-1和CXCR4在正常結(jié)膜均不表達(dá)，其光密度值都為0或者光密度值都很小，或正常結(jié)膜組織中的樣本量較少造成的。

本研究初次研究了SDF-1和CXCR4在不同年齡的翼狀胬肉組織中的表達(dá)結(jié)果，研究有一定的局限，因此，這種現(xiàn)象需要通過骨髓衍生的細(xì)胞特異性標(biāo)記物，基因敲除和通過大規(guī)模的研究，大量病例和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究來驗(yàn)證我們的結(jié)論。