鱗杯傘可溶性蛋白提取工藝的優(yōu)化及其營養(yǎng)評(píng)價(jià)

王江，王術(shù)榮，郭富寬，常明昌，*，孟俊龍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；2.黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷030801）

山西省特色野生食用菌種質(zhì)資源豐富，臺(tái)蘑久負(fù)盛名。臺(tái)蘑泛指生長于五臺(tái)山生態(tài)區(qū)上的一些優(yōu)質(zhì)野生食用菌類，主要品種有臺(tái)蘑小香蕈、黑水皮香蕈、銀盤蘑菇、虎皮香蕈、秋露白等[1]。臺(tái)蘑味香濃郁，營養(yǎng)豐富，具有驅(qū)風(fēng)散寒、舒筋活血、降低膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、調(diào)節(jié)人體免疫等保健功效[2-3]。目前，關(guān)于臺(tái)蘑的研究主要集中于種質(zhì)資源調(diào)查[4-5]、營養(yǎng)成分分析[6]和生物學(xué)特性及其人工馴化栽培等方面[7-8]。

黑水皮香蕈學(xué)名鱗杯傘（Clitocybe squamulosa），隸屬于白蘑科（Tricholomataceae）杯傘屬（Clitocybe），主要生長于五臺(tái)管涔山的云杉、落葉松林內(nèi)草地上；鱗杯傘是野生臺(tái)蘑中的營養(yǎng)價(jià)值極高的一種，其質(zhì)地柔嫩、風(fēng)味獨(dú)特；關(guān)于其營養(yǎng)成分分析、生物活性蛋白分離提取及營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)等研究尚未有報(bào)道。據(jù)此，筆者對(duì)鱗杯傘子實(shí)體的主要營養(yǎng)成分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，采用堿溶酸沉法制備活性蛋白，通過探索其最佳提取工藝參數(shù)，并對(duì)所獲取得蛋白氨基酸組分進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值分析和評(píng)價(jià)；以期為鱗杯傘蛋白的制備及進(jìn)一步的功能性食品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鱗杯傘[Clitocybe squamulosa（Pers.）Kumm]：山西食用菌工程技術(shù)研究中心提供，放置于烘箱中35 ℃下烘干、粉碎、過60 目篩備用；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：北京百奧萊博科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250 試劑：上海瀚思化工有限公司；濃鹽酸：恒泰化工有限公司；氫氧化鈉：南京盛慶和化工有限公司；無水乙醇、磷酸：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司（以上試劑均為分析純）。

1.2 主要儀器

TB-214 型電子分析天平：北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GZX-9240MBE 型電恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵：邦西儀器科技有限公司；DF-101S 磁力攪拌器：北京中興偉業(yè)儀器有線公司；MultifugeX1R Centrifuge 離心機(jī)：美國THERMO 有限責(zé)任公司；德國Christ ALPHA 2-4 LSC 冷凍干燥機(jī)：德國格馬有限責(zé)任公司；UV-1800 紫外可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；DE-200 紅景天高速超微粉碎機(jī)：天津市精誠機(jī)械有限公司；KDN-1 型全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Biochrom-30+全自動(dòng)氨基酸分析儀：英國biochrom/百康有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱗杯傘子實(shí)體中基本成分的分析

蛋白質(zhì)含量測定方法采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法測定；水分含量測定方法采用GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》，將樣品放在（105±1）℃的烘箱中烘至恒重。脂肪含量測定采用GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》；灰分含量測定采用，GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》，將樣品置于（550±25）℃高溫下煅燒4 h，稱量殘?jiān)馁|(zhì)量；依次對(duì)子實(shí)體粉進(jìn)行粗蛋白、水分、粗脂肪、灰分的測定[9]。碳水化合物含量的測定參照李茉[10]的方法，稱取樣品質(zhì)量減去樣品中所測的水分、灰分、脂肪及蛋白質(zhì)含量的總和。

1.3.2 鱗杯傘可溶性蛋白含量的測定

采用Bradford 法測定鱗杯傘蛋白提取液中可溶性蛋白的含量，以牛血清蛋白（albumin from bovine serum，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以考馬斯亮藍(lán)比色法在595 nm下測定吸光值，通過繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 考馬斯亮藍(lán)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Coomassie brilliant blue bovine serum albumin standard curve

如圖1 所示，建立回歸方程為y=0.004 9x-0.002 6，其中 y 為所測吸光度，x 為蛋白濃度（μg/mL），R2=0.998 7。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中可溶性蛋白質(zhì)的含量，以此來確定樣品的蛋白提取率。

1.3.3 鱗杯傘子實(shí)體蛋白提取的工藝流程

將烘干的鱗杯傘子實(shí)體粉過60 目篩→室溫下用正己烷料液比為1 ∶10（g/mL）脫脂→置于震蕩搖床脫脂2 h→連續(xù)用正己烷萃取兩次→靜置30 min→傾析出己烷→脫脂的樣品在空氣中干燥24 h 后備用；準(zhǔn)確稱取脫脂子實(shí)體粉0.50 g 溶于不同pH 值與液料比的蒸餾中→調(diào)節(jié)溫度水浴震蕩提取→4 500×g/min 離心10 min→測定提取液中可溶性蛋白的含量→調(diào)節(jié)上清液至鱗杯傘蛋白等電點(diǎn)（pH 3.6）→靜置30 min→6 500×g/min 離心15 min→棄上清，將蛋白沉淀用少量去離子水溶解→調(diào)節(jié)pH 值至中性→真空冷凍干燥得到鱗杯傘粗蛋白粉。

1.3.4 可溶性蛋白提取率的計(jì)算

式中：X 為蛋白質(zhì)提取率，%；C 為提取液中可溶性蛋白濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；m1

為樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.5 可溶性蛋白提取的單因素試驗(yàn)

利用單因素篩選鱗杯傘可溶性蛋白提取的最佳條件；由于提取過程中影響因素較多，為確定可溶性蛋白最佳的提取工藝，選取液料比、提取液pH 值、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)鱗杯傘可溶性蛋白提取率的影響。

1.3.5.1 液料比對(duì)鱗杯傘蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調(diào)節(jié)液料比 10、20、30、40、50 mL/g，使用濃度為 0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)提取液pH 值為9.5，提取溫度為（45±1）℃，提取時(shí)間 40 min。最后，將浸提液在 4 ℃離心（4 500×g/min，10 min），取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計(jì)算蛋白的提取率。

1.3.5.2 提取液pH 值對(duì)鱗杯傘蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調(diào)節(jié)液料比30 mL/g，使用濃度為0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)提取液 pH 值為 6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，提取溫度為（45±1）℃，提取時(shí)間 40 min。最后，浸提液在 4 ℃下離心（4 500 ×g/min，10 min），取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計(jì)算蛋白的提取率。

1.3.5.3 浸提溫度對(duì)鱗杯傘蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調(diào)節(jié)液料比30 mL/g，使用0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)提取液pH 值為10.5，震蕩水浴搖床溫度調(diào)節(jié)為 25、35、45、55、65 ℃，提取時(shí)間 40 min。最后，浸提液在 4 ℃下離心（4 500×g/min，10 min），取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計(jì)算蛋白的提取率。

1.3.5.4 浸提時(shí)間對(duì)鱗杯傘蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g 脫脂樣品，加入去離子水，調(diào)節(jié)液料比為30 mL/g，使用0.5 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)提取液pH 值為10.5，震蕩水浴搖床溫度調(diào)節(jié)為 45 ℃，浸提時(shí)間調(diào)節(jié)為 20、40、60、80、100 min。最后，浸提液在 4 ℃下離心（4 500×g/min，10 min），取上清液。采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測定提取液中的可溶性蛋白含量，計(jì)算蛋白的提取率。

1.3.6 響應(yīng)面影響因素的確定

依據(jù)單因素試驗(yàn)的篩選結(jié)果，采用Desig-expert 8.0.6 軟件，以鱗杯傘蛋白提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design 中心組合原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以液料比、提取液pH 值、提取溫度為變量，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1 所示；以鱗杯傘可溶性蛋白的提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行分析試驗(yàn)參數(shù)。

表1 響應(yīng)面三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of three factors and three levels of response surface method

1.3.7 鱗杯傘蛋白的氨基酸組成與營養(yǎng)價(jià)值分析

準(zhǔn)確稱取凍干的鱗杯傘粗蛋白樣品200 mg，置于安瓿中加6 mol/L HCl 溶液定容至10 mL。通入氮?dú)庋杆俜饪诤螅糜?10 ℃烘箱內(nèi)鹽酸水解22 h，將安瓿管取出后迅速冰水浴冷卻至室溫。然后，將蛋白水解液經(jīng)濾紙過濾后，用0.01 mol/L HCl 定容至50 mL 的容量瓶，然后準(zhǔn)確吸取水解液2.0 mL，置于60 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸干；繼續(xù)加入0.02 mol/L HCl 溶液2.0 mL，過0.45 μm 濾膜，即得酸水解液[11]。Biochrom+氨基酸自動(dòng)分析儀器，上樣取20 μL 水解液，分析樣品蛋白中水解氨基酸的組成與比例含量；最后，根據(jù)氨基酸平衡理論FAO/WHO 的必需氨基酸模式，通過計(jì)算氨基酸的化學(xué)評(píng)分（amino acid score，AAS）來評(píng)價(jià)鱗杯傘蛋白的營養(yǎng)價(jià)值[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱗杯傘子實(shí)體粉中基本成分分析

鱗杯傘子實(shí)體樣品的主要營養(yǎng)成分，如表2 所示。

表2 鱗杯傘子實(shí)體的主要成分分析Table 2 Analysis of main components of Clitocybe squamulosa（Pers.）Kumm %

通過分析可以發(fā)現(xiàn)鱗杯傘子實(shí)體粉中脂肪含量僅有3.27%，粗纖維含量為8.16%，碳水化合物為40.96%，總蛋白含量高達(dá)38.57%。據(jù)相關(guān)報(bào)道；猴頭菇蛋白的含量為26.3%，白靈菇為25%左右，香菇為19.9%，而平菇為10.5%[14]，鱗杯傘子實(shí)體中蛋白的含量遠(yuǎn)高于多數(shù)的食用菌。

2.2 單因試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 液料比對(duì)蛋白提取率的影響

在提取溫度45 ℃、提取時(shí)間40 min、提取液pH 9.5的條件下，探究提取料液比對(duì)鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖2。

圖2 液料比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on protein extraction rate

如圖2 所示，當(dāng)液料比在10 mL/g～30 mL/g 范圍內(nèi)，鱗杯傘可溶性蛋白的提取率，隨液料比增加呈顯著增加的趨勢；當(dāng)液料比達(dá)到30 mL/g 時(shí)，可溶性蛋白的溶解度達(dá)到飽和，若繼續(xù)提高液料比增加可溶性蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用，使得蛋白分子在等電點(diǎn)處不易沉淀，導(dǎo)致蛋白在濃縮時(shí)殘留率增加[15-16]。因此，篩選最佳的液料比為30 mL/g。

2.2.2 提取液pH 值對(duì)蛋白提取率的影響

在提取溫度45 ℃、提取時(shí)間40 min、液料比為30 mL/g 的條件下，探究浸提液pH 值對(duì)鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖3。

圖3 提取液pH 值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH on protein extraction rate

如圖3 所示，樣品可溶性蛋白的提取率，隨著浸提液pH 值升高，可溶性蛋白的提取率呈上升趨勢；當(dāng)浸提液pH 值達(dá)到11.5 時(shí)，提取液色澤變得越來越深，呈現(xiàn)明顯的黑褐色；可能是堿液濃度對(duì)蛋白分子中的次級(jí)鍵，導(dǎo)致脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應(yīng)，產(chǎn)生有毒縮和氨基酸化合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值降低[17]。綜合考慮；可溶性蛋白最佳的提取pH 值為10.5

2.2.3 提取溫度對(duì)蛋白得率的影響

在液料比為30 mL/g、提取液pH 值為10.5、提取時(shí)間40 min 條件下，探究提取溫度對(duì)鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on protein extraction rate

如圖4 所示，隨著提取溫度的升高，可溶性蛋白質(zhì)與水分子之間相互作用，增加了蛋白的溶解性，當(dāng)提取溫度在45 ℃時(shí)蛋白的提取率基本保持穩(wěn)定；若繼續(xù)提高蛋白的提取溫度時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致部分可溶性蛋白變性[18]。因此，選取最佳的提取溫度為45 ℃。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白得率的影響

在液料比為30 mL/g、提取液pH 值為10.5、提取溫度45 ℃的條件下，探究浸提時(shí)間對(duì)鱗杯傘可溶性蛋白提取效果的影響，見圖5。

如圖5 所示，在鱗杯傘子實(shí)體粉在水浴震蕩浸提的初期，隨著提取時(shí)間延長，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)顯著增長的趨勢，浸提時(shí)間到60 min 時(shí)，可溶發(fā)性蛋白的提取率保持穩(wěn)定；選取蛋白浸提時(shí)間為60 min。此時(shí)，樣品蛋白的溶出量達(dá)到飽和時(shí)，可溶性蛋白的溶出率已趨于平衡[19-20]。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

Box-Behnken 中心組合因素水平編碼見表3。

圖5 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of time on protein extraction rate

表3 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼Table 3 Independent variables and coded levels in Box-Behnken experimental design

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸模型方差分析結(jié)果

以 X1、X2、X3為響應(yīng)變量，以鱗杯傘蛋白提取率為響應(yīng)值，由表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到表4 回歸方程方差分析表；利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行非線性的二次多項(xiàng)式擬合，得到多元二次回歸方程如下：

式中：Y 為鱗杯傘可溶性蛋白提取率，%；X1、X2和X3分別為液料比、提取液pH 值、提取溫度作為3 個(gè)自變量的編碼值。鱗杯傘可溶性蛋白提取率與回歸方程預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R2=0.965 8，擬合狀況良好，表明回歸模型方案可行。

通過建立此模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行理論推測，回歸方程的系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；結(jié)果如表4 所示，經(jīng)分析結(jié)果，該模型 P＜0.01；其中項(xiàng)差異極顯著項(xiàng)差異顯著；X1X3、X2X3項(xiàng)差異不顯著。因此，該模型有實(shí)際應(yīng)用的意義，擬合的二次回歸方程具有良好的顯著性；可溶性蛋白的提取率失擬項(xiàng)P 值0.866 1＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著；此外，該模型F值為21.53，由自變量F 值大小可以得出，這三個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響順序依次是X2＞X3＞X1，即提取液pH 值＞提取溫度＞液料比。

表4 回歸分析結(jié)果Table 4 Results of regression analysis

2.5 響應(yīng)面模型條件優(yōu)化及驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行計(jì)算與分析，得到鱗杯傘子實(shí)體可溶性蛋白提取最佳工藝條件為：液料比為31.24 mL/g、提取液pH 值為11.06、提溫度為50.51 ℃、浸提時(shí)間為60 min，在此條件下，響應(yīng)值鱗杯傘蛋白提取率為33.71%?？紤]到實(shí)際應(yīng)用的可行性，將提取條件調(diào)整為液料比為31 mL/g、提取液pH 值為11.00、提取溫度為51℃浸提時(shí)間為60 min，在此條件下做3 次平行試驗(yàn)的蛋白提取率為（33.65±0.17）%，經(jīng)SPSS 軟件顯著性分析，實(shí)際蛋白得率稍低于理論值，差異不顯著（P＞0.05）。因此，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的模型可靠。

2.6 鱗杯傘蛋白氨基酸組成及營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

采用堿溶酸沉法制備獲得鱗杯傘蛋白中含有17種氨基酸（色氨酸未測），其中蛋白營養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)劣主要取決于所含必需氨基酸（essential amino acid，EAA）的種類、數(shù)量和組成比例[21]。鱗杯傘蛋白中所含的必需氨基酸組成比例越接近人體需要氨基酸的比例，則其營養(yǎng)價(jià)值就越高。通過測定與分析樣品蛋白水解氨基酸的結(jié)果表明；此蛋白中必需氨基酸的比例接近FAO/WHO 的推薦值，能夠滿足人體對(duì)于氨基酸的基本需求。Biochrom+氨基酸自動(dòng)分析儀測定鱗杯傘蛋白氨基酸組分色譜圖如圖6 所示，蛋白樣品中氨基酸組分的含量及其營養(yǎng)價(jià)值分析見表5 所示。

圖6 鱗杯傘蛋白氨基酸分析色譜圖Fig.6 Clitocybe squamulosa protein amino acid analysis chromatogram

表5 鱗杯傘蛋白氨基酸的組分含量及營養(yǎng)價(jià)值分析Table 5 Analysis of component content and nutritional value of clitocybe squamulosa amino acids

3 結(jié)論與討論

本研究通過單因素試驗(yàn)篩選堿溶酸沉法制備鱗杯傘蛋白的提取條件，并在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最佳提取工藝參數(shù)：液料比為31.24 mL/g、提取液 pH 值為 11.06、提溫度為 50.51 ℃、浸提時(shí)間為60 min，在此條件下，鱗杯傘子實(shí)體蛋白理論提取率達(dá)33.71%。通過建立的回歸模型，其決定系數(shù)R2=0.965 8，回歸模型顯著，擬合程度好，能很好地預(yù)測堿溶酸沉法制備鱗杯傘可溶性蛋白的提取工藝參數(shù)。

通過進(jìn)一步對(duì)提取的鱗杯傘蛋白氨基酸組分含量進(jìn)行分析及營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)；鱗杯傘蛋白中（除色氨酸外）含有17 種氨基酸，7 種是人體必需氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA 為39.35%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA/NEAA 為64.89%，均接近FAO/WHO 的推薦值。鱗杯傘蛋白氨基酸種類齊全，能夠滿足成人日常的需要，可以作為一種理想的蛋白質(zhì)；其中鱗杯傘蛋白中所含的呈味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸）總量為總量的23.55 %，占總氨基酸的比例達(dá)到了45.59%。鱗杯傘蛋白呈味氨基酸的組成和比例含量，賦予其良好的風(fēng)味與鮮味等特點(diǎn)，可以為進(jìn)一步開發(fā)天然呈鮮味物質(zhì)及其功能性風(fēng)味食品的研究提供了理論依據(jù)。