腺嘌呤誘導(dǎo)腎性骨病大鼠模型的生物力學(xué)分析

孟 彥 賀 寧 馬 嵐 潘 雪 韓 霞 趙建榮 武素珍 左 力

2010年全世界范圍慢性腎臟病(CKD)的患病率在20歲以上男性為10.4%,女性為 11.8%[1];在我國,2012年統(tǒng)計CKD 的患病率約為10.8%,總?cè)藬?shù)約1.195 億[2]。1990年～2016年全球CKD發(fā)病率增加了89%,患病率增加了87%[3]。早在CKD 3期,由于腎功能下降,開始逐步出現(xiàn)腎臟排磷功能下降,鈣、磷調(diào)節(jié)激素代謝異常,導(dǎo)致進行性加重的骨及礦物質(zhì)代謝紊亂,即慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常(CKD-MBD)。在CKD 3～5期,大多數(shù)患者會出現(xiàn)腎性骨病,表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松、骨痛、骨折等,顯著增加了患者的痛苦及社會經(jīng)濟負擔(dān)。2014年發(fā)表的研究提示,血液透析患者骨折的發(fā)生率較普通人群增加3.7倍[4]。

我們在前期工作中利用含有腺嘌呤的高磷飲食成功建立了腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠腎性骨病模型[5],通過骨形態(tài)計量學(xué)的方法,發(fā)現(xiàn)該模型較好模擬了人類腎性骨病中的纖維性骨炎這一病理類型。但是,前期研究未評估該模型生物力學(xué)效應(yīng)。生物力學(xué)是代謝性骨病研究中的重要評估手段[6-7],從結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)的角度對骨質(zhì)量進行評估,直接反映骨骼的質(zhì)量。本研究利用腺嘌呤誘導(dǎo)的腎性骨病大鼠模型,以生物力學(xué)的方法作為主要檢測手段,評估腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠CKD腎性骨病模型的生物力學(xué)性能。

材料與方法

實驗動物雄性11周齡SPF級SD大鼠共20只(體重420±32g)購買自北京維通利華公司。大鼠飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,相對濕度60%～70%,環(huán)境溫度23%±2 ℃,光照12 h/12 h明暗交替,每一籠4只,按照“3R”原則進行照護。

材料課題組確定動物飼料配方,委托北京科澳協(xié)力飼料公司進行加工。飼料配方基于AIN-93純化飼料配方[8]進行調(diào)整。共定制兩種飼料,第一種加入0.75%腺嘌呤,第二種無腺嘌呤。其他成分兩種飼料一致,均含磷1.03%,鈣1.11%,酪蛋白9%。

動物實驗方案經(jīng)過2周的環(huán)境適應(yīng)后,大鼠被隨機分成兩組:(1)正常對照組,用不含腺嘌呤的飼料喂養(yǎng),共6周;(2)CKD組,前4周用含有0.75%腺嘌呤的飼料喂養(yǎng),后2周用不含腺嘌呤的飼料喂養(yǎng)。6周后,處死所有大鼠。留取血標本備血清生化標志物檢測。取材第五腰椎和雙側(cè)股骨,第五腰椎和左側(cè)股骨行骨密度(BMD)測試,右下肢股骨用來行生物力學(xué)測試。

血清標志物檢測血尿素氮、血清肌酐(SCr)、血清鈣及無機磷由日立 7600自動生化分析儀(HITACHI,Japan)檢測。血清甲狀旁腺激素(PTH)水平采用大鼠全段PTH ELISA試劑盒(Immutopics,USA) 檢測。

BMD檢測用QDR-Discovery型骨密度儀(Hologic,USA)進行離體骨BMD檢測。檢測全股骨平均BMD和第五腰椎椎體的BMD。

骨生物力學(xué)測試選擇第五腰椎椎體進行腰椎壓縮試驗,選擇右側(cè)股骨行三點彎曲試驗。第五腰椎椎弓在檢測前被去除,在測試前椎體上下兩面的軟骨和皮質(zhì)骨由砂紙磨去,暴露松質(zhì)骨。使用MTS力學(xué)測試機(MTS,USA)將股骨壓縮至斷裂或?qū)⒆刁w壓縮至出現(xiàn)壓縮骨折,描記載荷-變形曲線。將測試室溫度設(shè)置為25℃,相對濕度50%～60%,設(shè)定加載速度3 mm/min,設(shè)定三點彎曲試驗的跨距18 mm。結(jié)構(gòu)力學(xué)指標選取最大橈度(Maximum displacement)、最大載荷(Maximum load)、剛度(Stiffness)和載荷能量(Force energy),材料力學(xué)指標選取最大應(yīng)變(Maximum strain)、最大應(yīng)力(Maximum stress)、彈性模量(Elastic modulus)和韌性(Toughness)。骨骼標本的處理方式、生物力學(xué)計算公式的確定主要參考Sato等[9]的研究。上述工作在北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科實驗室完成。

統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析由《SPSS 24》統(tǒng)計軟件完成。用均數(shù)±標準差表示計量資料。兩組組間比較如果符合參數(shù)檢驗的要求,用兩樣本t檢驗;如果不滿足參數(shù)檢驗的要求,用兩獨立樣本Mann-Whitney U檢驗。采用連續(xù)測量方差分析進行體重變化情況的統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

體重及血清標志物檢測結(jié)果兩組大鼠在進入實驗時體重?zé)o差異,隨著時間推移,正常對照組體重逐漸上升,CKD組體重逐漸下降(表1)。整個飼養(yǎng)過程中兩組均無大鼠死亡。兩組大鼠處死時SCr、尿素氮、血鈣、血磷、血PTH均有顯著差異。

表1 第六周末大鼠體重及血清生化標志物數(shù)據(jù)

PTH：甲狀旁腺激素；*：與正常對照組比較，P<0.05;**：與正常對照組比較，P<0.01;***：與正常對照組比較，P<0.001

BMD檢測與正常對照組比較,第6周末,CKD組的股骨和腰椎BMD均明顯降低(圖1)。

圖1 BMD測量結(jié)果

骨生物力學(xué)測量各組大鼠三點彎曲試驗結(jié)構(gòu)力學(xué)方面結(jié)果見圖2,與正常對照組比較,CKD組的最大載荷(189.21±15.77 Nvs110.63±32.41 N,P<0.001)、最大橈度(0.85±0.19 mmvs0.60±0.20 mm,P<0.05)、剛度(499.17±47.49 N/mmvs303.52±94.35 N/mm,P<0.001)和載荷能量(117.61±30.90 mJvs47.25±22.63 mJ,P<0.001)均明顯下降。

圖2 第6周末大鼠股骨三點彎曲實驗結(jié)構(gòu)力學(xué)指標

各組大鼠三點彎曲試驗材料力學(xué)方面結(jié)果見圖3,與正常對照組比較,CKD組的最大應(yīng)力(0.14±0.01 MPavs0.07±0.04 MPa,P<0.001)、最大應(yīng)變(79 774.15±16 834.76vs55 393.29±19 413.84,P<0.05)、彈性模量(6.82±0.38 GPavs4.38±1.00 GPa,P<0.01)和韌性(8 196.81±2 068.64 MJ/m3vs3 442.13±1 754.36 MJ/m3,P<0.001)均明顯下降。

各組大鼠腰椎壓縮試驗結(jié)果見圖4。結(jié)構(gòu)力學(xué)方面,與正常對照組比較,CKD組的最大載荷(247.65±30.32 Nvs186.41±37.52 N,P<0.01)、最大橈度(0.22±0.04 mmvs0.15±0.03 mm,P<0.01)和剛度(1 831.70±155.56 N/mmvs1 365.26±183.90 N/mm,P<0.01)和載荷能量(34.36 ±12.16 mJvs13.17±5.09 mJ,P<0.01)均明顯下降。材料力學(xué)方面,與正常對照組比較,CKD組的最大應(yīng)力(22.24±4.37 MPavs16.65±3.44 MPa,P<0.05)、最大應(yīng)變(0.05±0.02vs0.03±0.01,P<0.01)、彈性模量(722.96±68.64 MPavs488.89±146.40 MPa,P<0.01)和韌性(0.55±0.24 MJ/m3vs0.22±0.08 MJ/m3,P<0.01)均明顯下降。

圖3 第6周末大鼠股骨三點彎曲實驗材料力學(xué)指標

圖4 第6周末大鼠腰椎壓縮試驗骨生物力學(xué)參數(shù)

討 論

骨生物力學(xué)是生物力學(xué)的一個分支,其以工程力學(xué)的理論為基礎(chǔ),研究骨組織在外力作用下的力學(xué)特征和生物學(xué)效應(yīng),是對骨質(zhì)量進行評估的一種可靠方法[10]。骨生物力學(xué)從結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)兩個角度評估骨骼的質(zhì)量,結(jié)構(gòu)力學(xué)研究骨結(jié)構(gòu)在外來因素作用下的強度、剛度和穩(wěn)定性,材料力學(xué)研究骨結(jié)構(gòu)中材料的強度和構(gòu)件承載力、剛度、穩(wěn)定性。目前動物水平評估骨質(zhì)量的其他常用方法還有骨密度、顯微CT(micro-CT)、骨形態(tài)計量學(xué)等方法。骨密度是利用影像學(xué)的方法測量單位面積下的礦化骨的含量,間接反映骨質(zhì)量;micro-CT同樣是利用影像學(xué)的方法對骨骼進行評估,較骨密度檢查更加精細,可測量單位體積內(nèi)的骨小梁含量、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目等靜態(tài)指標。骨形態(tài)計量學(xué)是定量的骨病理學(xué)檢查,可利用特殊的圖像分析軟件對普通光鏡下骨病理圖片進行定量分析,計算出骨小梁含量、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目等參數(shù),同時觀察成骨細胞、破骨細胞、骨礦化的情況,得出相應(yīng)的參數(shù),還可利用熒光顯微鏡從熒光素標記的骨骼病理圖片中獲得骨形成的動態(tài)參數(shù),以此從骨量、骨礦化、骨轉(zhuǎn)運三個角度較全面的評估骨骼的情況。然而,上述方法都是從間接的角度評估骨質(zhì)量,有時會出現(xiàn)評估結(jié)果和實際骨質(zhì)量不相符的情況。很多臨床研究和動物實驗都表明,影像學(xué)提示的礦化骨含量的增加,并不代表骨質(zhì)量的增加,反而骨質(zhì)量可能會下降,這在長期應(yīng)用雙磷酸鹽的患者中尤為突出[11]。因此,對骨骼進行生物力學(xué)的分析就顯得尤為重要。

本研究主要從生物力學(xué)的角度對腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠CKD腎性骨病模型進行評估。作者在前期研究中,已通過骨密度和骨形態(tài)計量學(xué)對該模型進行過研究,發(fā)現(xiàn)模型的特點較符合腎性骨病中的高轉(zhuǎn)運類型纖維性骨炎的特點[5],可作為后續(xù)開展相關(guān)研究的載體,但是前期研究中缺乏骨生物力學(xué)的評估數(shù)據(jù),本研究進行了良好的補充。

三點彎曲實驗反映的是皮質(zhì)骨的生物力學(xué)性能。從圖2和圖3股骨三點彎曲實驗結(jié)果看,較正常對照組,CKD組大鼠股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)性能和材料力學(xué)性能明顯下降。這與圖1提示的CKD組股骨骨密度下降結(jié)果一致,也與我們前期研究中骨形態(tài)計量學(xué)檢測結(jié)果中的CKD組股骨皮質(zhì)骨骨量下降、侵蝕小孔面積增加一致[5]。腰椎壓縮實驗體現(xiàn)的是松質(zhì)骨生物力學(xué)性能。由圖4的腰椎壓縮實驗的結(jié)果看,較正常對照組,CKD組大鼠腰椎松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)性能和材料力學(xué)性能有明顯下降。這與圖1提示的CKD組腰椎椎體骨密度下降結(jié)果一致,也與我們前期研究中骨形態(tài)計量學(xué)檢測結(jié)果中的CKD組股骨松質(zhì)骨骨量下降、骨礦化減弱一致[5]。目前尚無其他研究者關(guān)于該方面的研究報告。

小結(jié)：從生物力學(xué)的角度分析,臨床上CKD時出現(xiàn)的高轉(zhuǎn)運腎性骨病可被腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠CKD模型較好地模擬,表現(xiàn)為皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨材料力學(xué)和結(jié)構(gòu)力學(xué)性能的下降。結(jié)合作者前期的骨密度及骨形態(tài)計量學(xué)檢測結(jié)果,未來開展CKD高轉(zhuǎn)運腎性骨病的研究可采用腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠CKD腎性骨病模型作為研究載體。