重組短小芽孢桿菌CotA 漆酶的酶學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵優(yōu)化研究

許開忠， 王雅靜， 馬 慧， 蔡宇杰， 廖祥儒， 管政兵*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122）

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種多銅氧化酶，因其能夠催化多種酚類、芳香族有機物氧化，并且以氧原子為最終電子受體，最終生成水，并且沒有其他有害的副產(chǎn)物生成[1]，被稱為一種綠色、環(huán)保、環(huán)境友好的生物催化劑。 漆酶在印染廢水的處理、藥物合成、食品能源等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。 其中細菌漆酶又因其具有更寬廣的底物范圍和熱穩(wěn)定性，能夠耐受堿性環(huán)境等特點，可以適用于工業(yè)染料廢水的處理。

目前已有報道表明，許多細菌漆酶被篩選出來并克隆表達， 如2015 年Liu 等從嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus） 中克隆了漆酶基因LacTT，再應(yīng)用于工業(yè)染料剛果紅和活性黑的脫色降解[2]。2018 年，Gaur 和Nisha 等分離并克隆了新型肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）漆酶lac用于從大米和小麥麩生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇[3]。 作者以所在實驗室從五倍子原蜜中篩選出的短小芽孢桿菌W3（Bacillus pumilusW3） 中分離的CotA 漆酶基因（GenBank：AGO57931.1）為出發(fā)點，通過分子克隆的手段，將其克隆到具有信號肽的pet-22b 質(zhì)粒上， 并在大腸桿菌中得到了表達。 在適宜的發(fā)酵環(huán)境下，重組CotA漆酶的表達量為1 915.3 U/L。 想要提高CotA 漆酶的表達量，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基無疑是最直接有效的方法。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法主要用正交設(shè)計、響應(yīng)面等方法。 然后微生物發(fā)酵是一個多因素影響、非線性的黑箱系統(tǒng)，如果用傳統(tǒng)的優(yōu)化方法不僅工作量大而且難以準(zhǔn)確地預(yù)測。 而BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（Back propagation neural network）是一種按照誤差逆向傳播來達到訓(xùn)練效果的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[4]。 使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模無須事先知道輸入與輸出之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，而且通過自身的訓(xùn)練，學(xué)習(xí)某種規(guī)則來達到最接近期望輸出值的結(jié)果。 其核心思想是利用梯度下降的搜索方法來達到網(wǎng)絡(luò)實際輸出和期望的誤差均方差最小。 因此BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在擬合非線性關(guān)系上具有良好的適應(yīng)性，適合于多變量多因素的過程建模。 該建模方式已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到生物發(fā)酵領(lǐng)域。

螢火蟲算法（Firefly algorithm）是一種來源于螢火蟲的閃爍行為的仿生群智能優(yōu)化算法[5]。 該算法模擬螢火蟲在空間移動時，發(fā)光弱的螢火蟲會被發(fā)光強的螢火蟲吸引的這一特點建立的數(shù)學(xué)模型。 在搜索過程中，所有螢火蟲互相吸引，吸引能力只跟發(fā)光強度和距離相關(guān)， 當(dāng)亮度一樣時則做隨機運動，最終發(fā)光最亮的螢火蟲就是函數(shù)的最優(yōu)解。

本研究中首次組合運用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和螢火蟲算法對重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)CotA 漆酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化， 運用16 組實驗數(shù)據(jù)作為樣本數(shù)據(jù)進行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練和擬合，完成優(yōu)化任務(wù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒載體

短小芽孢桿菌W3：作者所在實驗室保存；克隆和表達載體pET-22b：購自TaKaRa（大連）公司；大腸桿菌JM109 和BL21（DE3）：購自TransGen（北京）公司。

1.2 主要試劑和儀器

高保真酶PrimeSTAR、限制性內(nèi)切酶、氨芐青霉 素（Amp）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）：購自TaKaRa（大連）公司；2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：購自Sigma-Aldrich （中國上海）公司；本實驗中所用的化學(xué)試劑全部為分析純。

梯度PCR 儀： 杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；凝膠核酸電泳儀：北京六一儀器廠制造；高速冷凍離心機： 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋：常州中誠儀器制造有限公司產(chǎn)品；組合式搖床： 太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-6000 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；全自動蛋白電泳儀：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/dL，酵母粉0.5 g/dL，NaCl 1 g/dL；pH 7.0。 固體培養(yǎng)基添加2～3 g/dL 的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.6～1.2 g/dL，酵母粉0.3～0.6 g/dL，NaCl 0.6～1.2 g/dL，CuSO40.15～0.30 mmol/L，甘油0.6%～1.2%（體積分?jǐn)?shù)）。

所有培養(yǎng)基都經(jīng)過1×105Pa 滅菌30 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 CotA 漆酶基因的克隆表達 根據(jù)W3 全基因組信息設(shè)計引物，上游引物為：5′-CCGGAATTCG ATGAACCTAGAAAAATTTG-3′， 下游引物為：5′-CCCAAGCTTGTACTGGATGATATCCATCGGCC-3′，酶切位點用下劃線表示（EcoRⅠ和HindⅢ）。 提取短小芽孢桿菌W3 的全基因組作為模板， 使用高保真酶PrimeSTAR 進行PCR 擴增目的條帶。 PCR 體系：PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dNTPs 4 μL， 上游引物1 μL， 下游引物1 μL， 模板1 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，雙蒸無菌水32.5 μL。 擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 s；57 ℃退火10 s；72 ℃延伸90 s； 循環(huán)20次。 對PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒進行雙酶切并產(chǎn)物回收，使用T4 連接酶于16 ℃連接4 h， 然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆進行測序驗證。 對于測序驗證正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 （DE3）進行表達。

1.4.2 重組菌株的誘導(dǎo)表達及蛋白質(zhì)純化 誘導(dǎo)方法： 接種體積分?jǐn)?shù)1%的新鮮菌液到50 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基。 37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)到OD600=0.3～0.6。 將IPTG（0.4 mmol/L）加到培養(yǎng)基中，然后在25 ℃、200 r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h 進行粗酶制備。

粗酶制備：4 ℃、5 000g離心15 min 然后收獲菌體。使用pH 7.0 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌菌體。 加入等體積pH 7.0 的滲透壓緩沖液（20 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4，36%（體積分?jǐn)?shù)）蔗糖，2.5 mmol/L EDTA），然后在25 ℃下，充分?jǐn)嚢?0 min。 馬上加入5 倍體積的預(yù)冷超純水，引發(fā)滲透壓沖擊[6]，平衡后離心收集上清液。

蛋白質(zhì)純化方法： 使用HisTrap HP 純化CotA漆酶， 采用高濃度咪唑線性洗脫的方法獲得CotA漆酶純化蛋白質(zhì)。 并用HiTrapTM進行脫鹽處理。 并通過SDS-PAGE 檢驗蛋白質(zhì)的表達水平[7]。

1.4.3 CotA 漆酶的酶活測定及SDS-PAGE 分析酶活力單位（U）：1 min 內(nèi)氧化1 μmol ABTS 所需的漆酶量。

酶反應(yīng)體系： 預(yù)先將2.4 mL 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和500 μL 的3 mmol/L 的ABTS 充分混勻，并于50 ℃條件下水浴5 min。 緊接著迅速加入100 μL 稀釋好的CotA 漆酶溶液。 用分光光度計記錄420 nm 波長下的讀數(shù)[8]。

漆酶酶活的計算公式如下：

式中，ΔOD為起始和結(jié)束時的吸光度差值；V1為反應(yīng)體系的總體積 （mL）；n為酶液的稀釋倍數(shù)；Δt為反應(yīng)時間（min）；V2為體系中酶液的體積（mL）；ε 為摩爾消光系數(shù)（L/（mol·cm））。

1.4.4 酶學(xué)性質(zhì)分析 最適pH：在50 ℃下，將反應(yīng)體系放置在不同pH（2.0～11.0）的緩沖液中，測定酶活，以最高酶活為100%，比較獲得最適反應(yīng)pH。

最適溫度：在最適反應(yīng)pH 條件下，將反應(yīng)體系分別在不同的溫度（30、40、50、60、70、80、90、100 ℃）條件下測酶活，以最高酶活為100%，得到漆酶的最適反應(yīng)溫度。

pH 穩(wěn)定性： 將酶液放置在不同pH 的緩沖液中，4 ℃孵育5 h，以最高酶活為100%，測定其剩余酶活。

熱穩(wěn)定性測定：在最適反應(yīng)pH 條件下，將漆酶置于不同的溫度梯度（30～90 ℃）條件下孵育2 h，以最高酶活為100%，測定CotA 漆酶的剩余酶活。

動力學(xué)參數(shù)的測定：在上述的最適pH 和50 ℃條件下，以ABTS 作為底物檢測漆酶酶活。配置不同濃度的ABTS（濃度為0.02～0.50 mmol/L）研究反應(yīng)動力學(xué)。 動力學(xué)參數(shù)Km和Kcat利用Michaelis-Menten equation 計算[9]。

1.4.5 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立及螢火蟲算法尋優(yōu)以發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨、酵母粉、NaCl、CuSO4、甘油這5 個因素作為BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的輸入單元，以重組CotA 漆酶的酶活作為輸出單元建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。 同時利用螢火蟲算法尋優(yōu)確定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值。 本實驗中BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立及螢火蟲尋優(yōu)算法使用MATLAB 2014a 軟件進行。

1.4.6 染料脫色應(yīng)用 使用純化后的漆酶對甲基紅（λmax=410 nm），孔雀石綠（λmax=619 nm），溴百里香酚藍（λmax=420 nm），酸性藍129（λmax=629 nm）進行染料脫色研究。 脫色體系：10 U 的CotA 漆酶，0.5 mL乙酰丁香酮（10 mmol/L），染料1 mL（0.025 mg/mL），3.5 mL 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（100 mmol/L，pH 3.5）。 將脫色體系（以不加酶的體系作為對照）置于50 ℃水浴搖床上脫色5 h，然后計算脫色率。脫色率計算公式如下：

式中，A1為對照組的吸光度值；A2為實驗組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 CotA 漆酶重組大腸桿菌構(gòu)建

通過PCR 擴增獲得短小芽孢桿菌W3 的CotA基因，然后通過雙酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。測序驗證得到重組菌株pET-22b-CotA 構(gòu)建成功。

2.2 誘導(dǎo)表達及蛋白質(zhì)純化結(jié)果

按照1.3.2 的方法誘導(dǎo)表達CotA 漆酶，經(jīng)鎳柱純化，脫鹽柱脫鹽和SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖1所示，泳道1 為純化后的CotA 漆酶蛋白質(zhì)，大小約6.5×104，與ExPASy 軟件預(yù)測的蛋白質(zhì)大小一致。

圖1 CotA 漆酶的SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of CotA-laccase

2.3 CotA 漆酶酶學(xué)性質(zhì)分析

經(jīng)一系列的酶活測定， 重組表達的CotA 漆酶最適pH 值在3.5 左右，能夠耐受pH 6～12 的環(huán)境，保持50%以上的酶活（見圖2（a）（b））。 重組表達的CotA 漆酶最適溫度為80 ℃，在80 ℃下孵育2 h 后依然可以檢測到40%的酶活性（見圖2（c）（d））。 以ABTS 作為底物時，經(jīng)計算得到Km為0.247 mmol/L，Kcat為41.32 s-1， 說明重組表達的CotA 漆酶具有耐高溫和耐堿性環(huán)境的特點，具有適合工業(yè)染料脫色應(yīng)用的潛力。

圖2 酶學(xué)性質(zhì)分析Fig. 2 Enzymatic properties of CotA-laccase

2.4 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建模

以16 組重組大腸桿菌發(fā)酵CotA 漆酶的五因素四水平正交實驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模。 選取12 組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，選取其余4 組數(shù)據(jù)作為測試集來檢驗?zāi)Ｐ汀P 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入為發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨、酵母粉、NaCl、CuSO4和甘油，輸出為重組CotA 漆酶的酶活。 經(jīng)訓(xùn)練比較后確定了隱含層神經(jīng)元個數(shù)為3。 確定了神經(jīng)拓撲結(jié)構(gòu)為5-3-1 的模型，見圖3。

圖3 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲圖Fig. 3 BP neural network topology

經(jīng)過12 次迭代后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的最佳驗證性能達到了0.000 403 34 （見圖4）。 決定系數(shù)R2為0.973 41，說明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型模擬效果良好，模擬效果見表1、圖5。

圖4 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最佳驗證性能Fig. 4 Optimal verification performance of BP neural network

表1 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合結(jié)果Table 1 Fitting results of BP neural network

圖5 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合結(jié)果Fig. 5 Fitting results of BP neural network

2.5 螢火蟲算法尋優(yōu)

經(jīng)過螢火蟲算法尋優(yōu)獲得，重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)CotA 漆酶培養(yǎng)基中的蛋白胨、 酵母粉、NaCl、CuSO4和甘油分別為1.16 g/dL、0.428 g/dL、1.06 g/dL、0.274 mol/L 和0.931%（體積分?jǐn)?shù)） 時， 預(yù)測重組CotA 漆酶的酶活達到了最大（2 830.23 U/L）。

2.6 模擬效果驗證

以BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和螢火蟲算法尋優(yōu)獲得的最佳培養(yǎng)基組成進行重組大腸桿菌發(fā)酵，重復(fù)3 次獲得實際發(fā)酵生產(chǎn)的重組CotA 漆酶酶活達到了3 088.68 U/L，相比未優(yōu)化前提高了61.26%。

2.7 染料脫色應(yīng)用

CotA 漆酶對4 種染料的脫色效果如圖6 所示。CotA 漆酶對4 種染料都具有不同程度的脫色能力，其中對孔雀石綠和酸性藍脫色效果尤其明顯，脫色效果接近90%。

圖6 染料脫色效果Fig. 6 Dye decolorization

2.8 討論

細菌漆酶由于具有良好的熱穩(wěn)定性和耐受堿性環(huán)境的能力而在工業(yè)廢水處理和有毒物質(zhì)的降解中具有良好的應(yīng)用前景[10]。 S.Basheer 等從芽孢桿菌R5 菌株中篩選到了高熱穩(wěn)定性的漆酶[11]。 Wang等成功克隆了芽孢桿菌WD23 來源的CotA 漆酶并用于染料的脫色[12]。 M.Kumar 等克隆表達了來自Pandoraeasp. ISTKB 來源的新型嗜熱漆酶[13]。 各種新的細菌漆酶正在不斷地被人們挖掘和利用。 同時，關(guān)于漆酶發(fā)酵的優(yōu)化也是當(dāng)前研究的一個重要內(nèi)容。 培養(yǎng)基的成分優(yōu)化是發(fā)酵過程優(yōu)化的第一步也是關(guān)鍵的一步。 傳統(tǒng)的培養(yǎng)基優(yōu)化方法都是通過響應(yīng)面分析，但是響應(yīng)面分析采用多元二次回歸方程作為擬合的基礎(chǔ)， 這就意味著如果影響因素在3個以上的話就必須通過其他方法進行降維。 同時，響應(yīng)面也會帶來巨大的工作量，例如五因素三水平的響應(yīng)面分析就需要46 組實驗， 而本實驗中只使用了16 組就達到了良好的擬合效果， 說明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在生物建模和非線性擬合方面具有減少工作量的優(yōu)點。 近年來也有越來越多的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化發(fā)酵的相關(guān)報道，如Peng 等通過BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化了類胡蘿卜素發(fā)酵培養(yǎng)基，使類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了95.9%[14]。Ting 等利用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化了畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基高效表達β-葡萄糖苷酶[15]。 王強等通過BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)偶聯(lián)遺傳算法優(yōu)化三孢布拉霉發(fā)酵培養(yǎng)基，使番茄紅素產(chǎn)量提高了31.6%[16]。

3 結(jié) 語

綜上所述，本實驗中通過分子克隆的手段將短小芽孢桿菌CotA 漆酶克隆到了pET-22b 質(zhì)粒上并構(gòu)建了重組大腸桿菌， 重組表達的CotA 漆酶相對分子質(zhì)量大約6.5×104，以ABTS 作為底物測得反應(yīng)的最適pH 值為3.5，最適溫度為80 ℃。 重組表達的CotA 漆酶在pH 3.5 和50 ℃的條件下對4 種工業(yè)染料具有明顯的脫色效果，其中對孔雀石綠和酸性藍129 脫色率達到了90%左右。 在實際的印染工藝中，酸性藍等酸性染料應(yīng)用的pH 值為4 左右[17]。 而酸性藍染料廢水的處理一般需要花費大量的堿性物質(zhì)將pH 值調(diào)到6 左右[18]。 本實驗中的重組CotA漆酶能夠直接在酸性條件下直接對酸性藍脫色，因此重組CotA 漆酶在酸性染料廢水的處理方面具有應(yīng)用潛力。 本實驗中利用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組合螢火蟲算法尋優(yōu)得到最佳產(chǎn)重組CotA 漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO40.274 mol/L 和甘油 （體積分?jǐn)?shù)）0.931%。 優(yōu)化過的培養(yǎng)基產(chǎn)CotA 漆酶酶活為3 088.68 U/L，相比未優(yōu)化之前提高了61.26%。本研究中優(yōu)化后的CotA 漆酶產(chǎn)量明顯高于已報道的重組短小芽孢桿菌LC01 漆酶產(chǎn)量[19]。 與報道的枯草芽孢桿菌漆酶cjp3 的最大酶活仍有差距[20]，但是這只是搖瓶實驗所得產(chǎn)量，仍然具有很大的潛力。 可見利用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模結(jié)合螢火蟲算法來優(yōu)化CotA 漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基是一種可行的手段。