王 喆, 蔣圓婷, 靳羽含, 趙晨宇, 劉艷麗, 梁寒峭*, 馬國(guó)需
(1. 北京城市學(xué)院 生物醫(yī)藥學(xué)部, 北京100094;2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所, 北京100093)
蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.) DC. 或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖。 味辛、苦,性溫,入脾、胃、肝經(jīng),具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目之功[1]。 蒼術(shù)作為常用中藥在我國(guó)擁有2000 多年的應(yīng)用歷史, 最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品。 《本草備要》記載其有辟穢之功。 《名醫(yī)別錄》中記載運(yùn)用含有蒼術(shù)的復(fù)方,來治療皮膚瘙癢,達(dá)到止癢效果[2]。 經(jīng)過現(xiàn)代科學(xué)研究證明, 蒼術(shù)的主要?dú)⒕钚猿煞譃閾]發(fā)油,其中包括蒼術(shù)素(atractylodin)、茅術(shù)醇(hinesol)、蒼術(shù)酮(atractylone)、核桉油醇(eudesmol)等[3]。 大量研究表明,蒼術(shù)揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌活性,對(duì)大腸埃希氏菌、酵母、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等臨床常見致病菌具有良好的抑制作用,且抑菌效果與揮發(fā)油濃度正相關(guān),揮發(fā)油中的蒼術(shù)素比蒼術(shù)酮具有更強(qiáng)的抑菌活性[4]。 本研究中對(duì)蒼術(shù)揮發(fā)油的體外殺菌活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以常見的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母作為供試菌,從藥物對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響、AKP 的含量變化、胞外大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定等多個(gè)方面闡述蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)供試菌的作用機(jī)制,從而為拓展中藥蒼術(shù)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
BSA2202S 電子天平:德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品;DNP-9052BS-Ⅲ恒溫培養(yǎng)箱: 上海新苗公司產(chǎn)品;分光光度計(jì):Spectrum 公司產(chǎn)品;ZWYR-2102C 恒溫培養(yǎng)搖床: 上海智城公司產(chǎn)品;SW-CJIF 超凈工作臺(tái):天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌器:上海博迅公司產(chǎn)品;麥?zhǔn)媳葷峁埽簭V東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。
蒼術(shù)飲片(批號(hào)20180403):產(chǎn)地河南信陽。
堿性磷酸酶試劑盒(批號(hào)20181228):南京建成生物工程研究所提供;甘氨酸(批號(hào)080702):上??颠_(dá)氨基酸廠制造; 吐溫-80 (批號(hào)2017052):Biotopped 公司產(chǎn)品;酵母浸粉(批號(hào)20130728):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品; 胰蛋白胨(批號(hào)20181022):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;蛋白胨(批號(hào)20170306):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;牛肉膏(批號(hào)20150102):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品; 葡萄糖(批號(hào)20160828):北京化工廠制造;十二烷基硫酸鈉(檔案編號(hào)069709005200):山東優(yōu)索化工科技有限公司產(chǎn)品;瓊脂粉、氯化鈉(批號(hào)20140623):北京化工廠制造;磷酸二氫鉀(分析純):北京化工廠制造;氫氧化鈉(分析純):北京化工廠制造。
CICC 21530 大腸埃希氏菌Escherichia coliEHECO157:H7、CICC 21600 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus:胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)基(TSA);CICC 32380 白假絲酵母Candida albicans:沙氏瓊脂斜面培養(yǎng)基(SDA)。
研究發(fā)現(xiàn),水蒸氣蒸餾法提取的蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)各供試菌體的抑制作用要強(qiáng)于微波萃取法和索氏提取法[6]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期考察的揮發(fā)油提取方法,將蒼術(shù)飲片粉碎為干粉, 裝入盛有10 倍量水的水蒸氣蒸餾提取器中,溫度控制在100 ℃左右,6 h 后提取器支管中流出的液體變?yōu)闊o色, 隨即停止提取。 用分液漏斗分離去除下部蒸餾水,上部棕黃色液體即為蒼術(shù)揮發(fā)油粗提物,于4 ℃冰箱中密封保存[5]。
2.2.1 平板的制備 指示菌平板分上下兩層。 先加入8 mL 瓊脂培養(yǎng)基作為下層培養(yǎng)基, 待培養(yǎng)基完全凝固后,在其上擺放4~6 只牛津杯,再加入20 mL相應(yīng)培養(yǎng)基。 待上層培養(yǎng)基完全凝固后,將牛津杯取出。
2.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 用新鮮培養(yǎng)的指示菌株菌懸液,調(diào)至菌液濃度0.5 McFarland,均勻涂布在雙層平板上,孔內(nèi)加入100 μL 的樣品、陰性對(duì)照(100 μL 新鮮培養(yǎng)基)和陽性對(duì)照(阿莫西林溶液),置于4 ℃冰箱4 h 后,放置在37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h(或28 ℃培養(yǎng)48 h),觀測(cè)抑菌圈形成情況,使用游標(biāo)卡尺精密測(cè)量抑菌圈的外徑d(cm),以反映抑菌活性強(qiáng)弱。
制備含揮發(fā)油提取物的培養(yǎng)基平皿:將揮發(fā)油提取物用DMSO 稀釋,每一菌株制備7 個(gè)系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試液分別定量地加到熱溶解后的相應(yīng)培養(yǎng)基中,混勻,制成分別含揮發(fā)油提取物 (質(zhì)量分?jǐn)?shù))0.01%、0.025%、0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、1.0%共7 個(gè)不同的平皿。
用新鮮培養(yǎng)的指示菌株將菌懸液濃度調(diào)至0.5 McFarland,而后均勻涂布在上述平板上,放置相應(yīng)溫度下培養(yǎng)24 h, 觀察各平皿的菌落生長(zhǎng)情況,確定出揮發(fā)油提取物的最小抑菌濃度(MIC)[7-8]。
2.3.1 揮發(fā)油溶液的配制 分別取蒼術(shù)揮發(fā)油純品和醇提物與無水乙醇混溶,分別制成含揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%和2.5%的溶液, 醇提物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%和1%的溶液,備用。
2.3.2 菌懸液制備 將各實(shí)驗(yàn)菌經(jīng)過分離培養(yǎng),選取單個(gè)典型菌落, 白假絲酵母接種于SDA 培養(yǎng)基,大腸埃希氏菌、 金黃色葡萄球菌接種于TSA 培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,用磷酸鹽緩沖液洗下斜面培養(yǎng)物,經(jīng)充分混勻, 稀釋配制成實(shí)驗(yàn)菌懸液, 含菌量為1×107~5×107CFU/mL[9]。
2.3.3 中和劑的制備及選擇 中和劑的制備:準(zhǔn)確量取0.68 g 磷酸二氫鉀、1.415 g 無水磷酸氫二鈉,加水稀釋至1 000 mL,配制成磷酸鹽緩沖液。 準(zhǔn)確稱量甘氨酸、吐溫-80,按實(shí)驗(yàn)需要,配制成含0.5 g/dL甘氨酸,3 g/dL 吐溫-80 的磷酸鹽緩沖液[10]。
實(shí)驗(yàn)菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白假絲酵母,設(shè)計(jì)6 組實(shí)驗(yàn),按懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行中和劑選擇實(shí)驗(yàn)[11-12]。 當(dāng)?shù)? 組不長(zhǎng)菌,第3—5 組組間菌數(shù)差不超過10%,第1 組不長(zhǎng)菌或菌數(shù)遠(yuǎn)少于第2 組,第2 組菌數(shù)超過100 CFU/mL 時(shí),連續(xù)3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明所試中和劑及其濃度適宜。
2.3.4 懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在20 ℃條件下進(jìn)行, 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%DMSO 將各蒼術(shù)揮發(fā)油乙醇溶液溶解,再用無菌蒸餾水稀釋成實(shí)驗(yàn)濃度。 在無菌試管內(nèi)加入0.5 mL 菌懸液與4 mL 不同濃度的蒼術(shù)揮發(fā)油溶液以及0.5 mL 硬水混勻,作用至規(guī)定時(shí)間,吸取0.5 mL 反應(yīng)液,加入4.5 mL 中和劑,混勻。中和作用10 min,取混合后的樣液1 mL 接種培養(yǎng),接種于事先準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)皿上,放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),48 h 后對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[11]。
制劑溶劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)是將0.5 mL 菌懸液與4 mL稀釋液及0.5 mL 硬水混勻,作用10 min 后,按上述程序進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算平均殺滅率。
陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)是將0.5 mL 菌懸液與4 mL 阿莫西林或氟康唑溶液及0.5 mL 硬水混勻,作用10 min后,按上述程序進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算平均殺滅率。
2.4.1 對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響 分別將不同濃度的蒼術(shù)揮發(fā)油溶液加入菌懸液中,使得揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%,菌體濃度為1×107CFU/mL 的NB 培養(yǎng)基,對(duì)照組加滅菌雙蒸水,將以上培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱,37 ℃、120 r/min 的搖床中培養(yǎng)12 h,每隔1 h 取樣,于600 nm 處測(cè)定吸光度[13]。
2.4.2 對(duì)菌體細(xì)胞壁的影響 分別將不同濃度的蒼術(shù)揮發(fā)油溶液加入菌懸液中,揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%, 菌體濃度為1×107CFU/mL 的NB 培養(yǎng)基,對(duì)照組加滅菌雙蒸水;將以上培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱,37 ℃、120 r/min 的搖床中培養(yǎng),定時(shí)于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 取樣,離心10 min,速度4 000 r/min,吸取上清液按照試劑盒方法測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)的含量變化。 每個(gè)樣品平行實(shí)驗(yàn)3 次,取平均值[13-15]。
2.4.3 對(duì)菌體可溶性蛋白質(zhì)泄露量的影響 分別將不同濃度的蒼術(shù)揮發(fā)油加入菌懸液中,使得揮發(fā)油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%, 菌體濃度為1×107CFU/mL 的NB 培養(yǎng)基,對(duì)照組加滅菌雙蒸水,將以上培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱,37 ℃、120 r/min 的搖床中培養(yǎng)。 分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 定時(shí)取樣,蛋白質(zhì)含量按照Bradford 的方法進(jìn)行。 每個(gè)樣品平行實(shí)驗(yàn)3 次,取平均值[15-16]。
3.1.1 不同提取溶劑對(duì)提取物抑菌效果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%和25%蒼術(shù)蒸餾提取的揮發(fā)油具有抑菌效果,隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加對(duì)菌體的抑制作用隨之增加。 蒼術(shù)醇提物無抑菌效果,助溶劑無抑菌效果。 陽性對(duì)照對(duì)細(xì)菌有抑制效果,對(duì)白假絲酵母無抑菌效果,見表1。
3.1.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油抑菌效果 蒼術(shù)揮發(fā)油提取物對(duì)白假絲酵母的抑制活性最強(qiáng),MIC值為0.5%;對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌抑制活性較弱,MIC 值均為1.0%。 見表2。
3.2.1 中和劑選擇實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以含5 g/L甘氨酸、30 g/L 吐溫-80 的磷酸鹽緩沖液組成的中和劑, 可有效中和蒼術(shù)揮發(fā)油抑菌液殘余抑菌作用,且中和劑及其中和產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌和培養(yǎng)基無影響,結(jié)果見表3。 中和劑選擇含0.5 g/dL 甘氨酸,3 g/dL 吐溫-80 的磷酸鹽緩沖液符合要求。
3.2.2 懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蒼術(shù)揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)對(duì)大腸埃希氏菌具有一定抑制效果,對(duì)白假絲酵母和金黃色葡萄球菌的抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于2%。 單方使用抑菌效果有限,由于受到蒼術(shù)揮發(fā)油溶解性的影響, 當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí),會(huì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象,影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和抑菌效果。 結(jié)果見表4。
表1 蒼術(shù)揮發(fā)油的抑菌實(shí)驗(yàn)Table 1 Bacteriostasis experiment of volatile oil of Atractylodes chinensis
表2 揮發(fā)油的最小抑菌濃度Table 2 Minimum bacteriostatic concentration of volatile oil
表3 蒼術(shù)揮發(fā)油中和劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of volatile oil neutralizer in traditional Chinese medicine
表4 蒼術(shù)揮發(fā)油殺菌效果Table 4 Germicidal effect of volatile oil of Atractylodes chinensis
3.3.1 蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響 由圖1—3 可見,各菌體經(jīng)過蒼術(shù)揮發(fā)油處理后生長(zhǎng)趨勢(shì)與陰性對(duì)照組相比變化明顯,且蒼術(shù)揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響也越大。 在12 h 內(nèi),陰性對(duì)照組菌體數(shù)量呈現(xiàn)增加趨勢(shì),中低劑量樣品溶液吸光度雖略有增加, 但總體水平低于陰性對(duì)照組,說明菌體的繁殖受到一定程度的抑制;而當(dāng)蒼術(shù)揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到2%時(shí),12 h 反應(yīng)結(jié)果與初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持一致, 始終維持于0 點(diǎn)附近,表明蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)于各菌體均具有抑制作用,抑菌活性強(qiáng)弱與揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。
圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃希氏菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 1 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the growth curve of Escherichia coli
圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 2 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the growth curve of Staphylococcus aureus
圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 3 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the growth curve of Candida albicans
3.3.2 蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)菌體細(xì)胞壁的影響 堿性磷酸酶是存在于細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間的一種酶,在正常情況下細(xì)胞外很難檢測(cè)到它的含量。 當(dāng)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁被破壞后,細(xì)胞通透性增加,堿性磷酸酶泄露到細(xì)胞外,通過檢測(cè)細(xì)胞外酶的變化可以反映出細(xì)胞結(jié)構(gòu)及通透性的改變。 從圖4—6 中可以看出,從反應(yīng)最初開始,3 種菌在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蒼術(shù)揮發(fā)油的作用下堿性磷酸酶水平顯著高于對(duì)照組,堿性磷酸酶含量與蒼術(shù)精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正相關(guān),且一直處于平穩(wěn)狀況。 通過觀察可以得知,蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)3 種指示菌細(xì)胞壁具有很強(qiáng)的破壞性。
圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃希氏菌細(xì)胞壁的影響Fig. 4 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on cell wall of Escherichia coli
圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的影響Fig. 5 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on cell wall of Staphylococcus aureus
圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母細(xì)胞壁的影響Fig. 6 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on cell wall of Candida albicans
3.3.3 蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)菌體胞外蛋白質(zhì)的影響 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程在0~0.1 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,y為吸光度,菌液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 7.435 7x+0.022,R2=0.996 4。
由圖7—9 可見, 經(jīng)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蒼術(shù)揮發(fā)油處理后,與對(duì)照組相比,在600 nm 處的吸光度值明顯增加,且胞外蛋白質(zhì)的吸光度隨著揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大,說明隨著蒼術(shù)揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高,菌體通透性屏障受損程度隨之增高,從而從胞內(nèi)流出的蛋白質(zhì)量越多,蒼術(shù)揮發(fā)油可通過破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而發(fā)揮抑菌殺菌的效果。
圖7 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃希氏菌胞外可溶性蛋白質(zhì)泄露量的影響Fig. 7 Effects of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the extracellular soluble protein leakage of Escherichia coli
圖8 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌胞外可溶性蛋白質(zhì)泄露量的影響Fig. 8 Effect of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the extracellular soluble protein leakage of Staphylococcus aureus
圖9 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)白假絲酵母胞外可溶性蛋白質(zhì)泄露量的影響Fig. 9 Effects of different volatile oil concentrations of Atractylodes chinensis on the extracellular soluble protein leakage of Candida albicans
本研究中考察了蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和白假絲酵母的體外抑菌活性、殺菌活性和抑菌機(jī)制。 從抑菌效果可知,蒼術(shù)蒸餾提取的揮發(fā)油對(duì)于3 種指示菌均具有抑菌效果,其中對(duì)白假絲酵母的抑制活性最強(qiáng),最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%,對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色酵母菌的抑制活性相對(duì)較弱,最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。 通過體外殺菌實(shí)驗(yàn)可知,蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃希氏菌表現(xiàn)出明顯殺菌效果, 但蒼術(shù)揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到2%時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌和白假絲酵母雖有一定殺滅作用,但殺菌率仍未達(dá)到要求。 通過抑菌機(jī)制研究可以看出,蒼術(shù)揮發(fā)油能夠通過影響和破壞菌體細(xì)胞膜、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),改變菌體正常滲透作用,導(dǎo)致菌體內(nèi)AKP、蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)外泄,從而導(dǎo)致菌體死亡,發(fā)揮抑菌效果。 蒼術(shù)揮發(fā)油具有一定抑菌效果,但由于其水溶性有限,高濃度單獨(dú)使用容易分層析出,影響使用效果,因此以蒼術(shù)揮發(fā)油為原料的復(fù)配制劑還有待進(jìn)一步研究。