刺盤(pán)孢菌真菌病毒研究進(jìn)展

李春霞　李敏　高兆銀　弓德強(qiáng)　洪小雨　姜瑛　常圣鑫　胡美姣

摘要：真菌病毒是指寄生于各種真菌中的病毒，其中部分弱毒相關(guān)病毒可使寄主真菌致病力發(fā)生衰退，甚至導(dǎo)致病原群體致病力下降，是一種具有生防潛能的微生物資源。刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum spp.）可引起植物嚴(yán)重的炭疽病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。文章歸納總結(jié)了刺盤(pán)孢菌中真菌病毒的種類(lèi)和特征：僅有9種刺盤(pán)孢菌中存在真菌病毒，且病毒基因組類(lèi)型均為dsRNA;絕大部分病毒為直徑25～50 nm的球狀病毒顆粒，另有目前唯一一例線(xiàn)狀真菌病毒;序列已知的6例刺盤(pán)孢菌病毒中有2例為雙分病毒、2例為產(chǎn)黃青霉病毒、2例還未確定歸類(lèi)。通過(guò)分析病毒對(duì)寄主真菌的影響發(fā)現(xiàn)不同病毒對(duì)刺盤(pán)孢菌表型、生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和致病力等方面的影響存在明顯差異，但僅有2例為能使寄主致病力衰退的弱毒相關(guān)病毒。弱毒相關(guān)病毒的發(fā)現(xiàn)為植物炭疽病的生防研究提供了新契機(jī)，但由于存在真菌病毒數(shù)量不足、真菌病毒分離鑒定進(jìn)展緩慢、真菌病毒傳播效率低及病毒與刺盤(pán)孢菌間的互作研究不夠深入等問(wèn)題，刺盤(pán)孢菌應(yīng)用于田間炭疽病的防治還有一定距離。針對(duì)上述問(wèn)題，未來(lái)研究方向可從以下方面著手：采用宏轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)鑒定和發(fā)掘更多的真菌病毒;通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化手段或挖掘可利用的化學(xué)物質(zhì)或傳播介體提高病毒的傳播效率;建立刺盤(pán)孢菌遺傳轉(zhuǎn)化體系及病毒反向遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、結(jié)合多組學(xué)手段深入研究病毒與寄主真菌互作，為刺盤(pán)孢菌的致病機(jī)理研究及真菌病毒的生防利用提供參考。

關(guān)鍵詞： 刺盤(pán)孢菌;真菌病毒;炭疽病;生物防治

中圖分類(lèi)號(hào)： S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）01-0123-10

Abstract： Mycoviruses are parasitic viruses in various fungi. Some hypovirulence-associated mycoviruses are microbial resources with the potential of biocontrol， which reduce the pathogenicity of plant pathogenic fungi and even cause the decline of pathogenicity of pathogenic groups. Colletotrichum spp. can cause severe anthracnose in plants， leading to enormous economic loss. This paper summarized the types and characteristics of mycoviruses in Colletotrichum spp. from literature. Currently， it has been found that mycoviruses infected only nine species of Colletotrichum spp.， and their genome typesare dsRNA. Most of the mycoviruses are a spherical particle with the diameter of 25-50 nm， but a filamentous mycovirus is found for the first time in the world. Among the six known sequence cases， two cases are partitivirus， two cases are chrysovirus， and two cases are unclassified. By summing up the effects of viruses on host fungi， it is shown that there are differences in phenotype， growth， sporulation， and pathogenicity among different mycoviruses but only two mycoviruses could make host pathogenicity decline. The discovery of hypovirulence-associated mycovirus provides a new opportunity for the biocontrol of plant anthracnose， but there is still a long way to go for the control of anthracnose in the field with the following reasons：the quantity of mycoviruses is insufficient; the progress of isolation and identification of mycoviruses is slow; the transmission of fungal viruses is insufficient; the interaction study between viruses and Colletotrichum spp. is not thorough enough; a long distance between the study and its application to field control. Given the above problems， it was suggested that researchers could carry out their researches from the following aspects：identifying and discovering more mycoviruses in Colletotrichum spp. by metatranscriptome technology; improving virus transmission efficiency by using genetic transformations or digging available chemicals or transmission mediators; establishment of Colletotrichum spp. genetic transformation system and mycovirus reverse genetic transformation system combine with multi-o-mics methods to study the interaction between mycoviruses and Colletotrichum spp.， providing references for the study of pathogenic mechanism of Colletotrichum spp. and biocontrol of mycoviruses.

Key words： Colletotrichum spp.; mycoviruses;anthracnose; biocontrol

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319MS095）; Chinese Academy of Tropical Agricultural Scien-ces Basic Research Special Project（1630042019041）

0 引言

刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum spp.）隸屬于半知菌亞門(mén)腔孢綱黑盤(pán)孢目黑盤(pán)孢科刺盤(pán)孢屬真菌，其有性階段是子囊菌亞門(mén)的小叢殼屬或無(wú)柄盤(pán)菌屬，是禾本科、果樹(shù)、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物的寄生菌，可引起嚴(yán)重的炭疽?。ㄖ艿聭c和徐士菊，2005）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，受刺盤(pán)孢菌侵染的影響，熱帶、亞熱帶及地中海地區(qū)出口水果品質(zhì)顯著下降，所造成的經(jīng)濟(jì)損失甚至可達(dá)80%以上（Joshi，2018），《2016全球植物現(xiàn)狀評(píng)估報(bào)告》（Willis and Bachman，2016）更是將刺盤(pán)孢菌列為十大影響植物的病原真菌之首，可見(jiàn)其對(duì)世界經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究的重要性。

真菌病毒（Fungal virus或Mycovirus）是指寄生在真菌中的一系列病毒，它們廣泛地存在于各種真菌中。迄今為止，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)可查詢(xún)到超過(guò)250種真菌病毒被成功測(cè)序并注冊(cè)（Xie and Jiang，2014）。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（ICTV）將已發(fā)現(xiàn)的真菌病毒劃分為17個(gè)類(lèi)群，包括16個(gè)科和1個(gè)不包括在科里的屬（Kotta-Loizou and Coutts，2017），根據(jù)基因組類(lèi)型可分為雙鏈（ds）RNA病毒（8個(gè)類(lèi)群）：Botybirnavirus、Endornaviridae、Partitiviridae、Megabirnaviridae、Reoviridae、Chysoviridae、Totiviridae和Quadriviridae;單股正鏈RNA[（+）ssRNA]病毒（6個(gè)類(lèi)群）：Alphaflexiviridae、Gammaflexiviridae、Hypoviridae、Pseudoviridea、Barnaviridae和Metaviridea;單股負(fù)鏈[（-）ssRNA]病毒（1個(gè)類(lèi)群）：Mymonaviridea;環(huán)狀ssDNA病毒（1個(gè)類(lèi)群）：Genomoviridea。研究發(fā)現(xiàn)有部分真菌病毒可降低植物病原真菌的致病力，甚至使病原群體致病力發(fā)生衰退，這種特殊的致病功能使得真菌病毒兼具理論研究的重大意義和應(yīng)用開(kāi)發(fā)的廣泛前景，為農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，是一種有待開(kāi)發(fā)的、具有生防潛能的微生物資源。

本研究對(duì)刺盤(pán)孢菌中真菌病毒的種類(lèi)和特征進(jìn)行歸納總結(jié)，分析弱毒相關(guān)病毒對(duì)刺盤(pán)孢菌表型、生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及致病力等方面的影響，指出利用真菌病毒防治植物炭疽病的優(yōu)勢(shì)和存在的問(wèn)題，展望未來(lái)研究方向，為刺盤(pán)孢菌真菌病毒的深入研究和利用提供參考。

1 刺盤(pán)孢菌相關(guān)真菌病毒

早在1975年Moffitt和Lister就應(yīng)用血清學(xué)篩選試驗(yàn)在高粱刺盤(pán)孢病菌（C. graminicola）和甘蔗刺盤(pán)孢病菌（C. falcatum）中檢測(cè)到dsRNA真菌病毒。同年，Rawlinson等（1975）從菜豆刺盤(pán)孢病菌（C. lindemuthianum）菌株中提取獲得dsRNA，電鏡觀(guān)察到直徑30 nm的等距病毒粒子。截至目前，分別在尖孢刺盤(pán)孢（C. acutatum）、山茶刺盤(pán)孢（C. camelliae）、鐮形刺盤(pán)孢（C. falcatum）、果生刺盤(pán)孢（C. fructicola）、盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢（C. gloeosporioides）、禾生刺盤(pán)孢（C. graminicola）、希金斯刺盤(pán)孢（C. higginsianum）、豆刺盤(pán)孢（C. lindemuthianum）和平頭刺盤(pán)孢（C. truncatum）等9種刺盤(pán)孢菌中發(fā)現(xiàn)真菌病毒，且基因組類(lèi)型均為dsRNA，絕大部分病毒為直徑25～50 nm的球狀病毒顆粒;此外，在山茶刺盤(pán)孢中發(fā)現(xiàn)目前唯一一例線(xiàn)狀真菌病毒。以下將已發(fā)表的刺盤(pán)孢菌病毒分為序列已知和序列未知兩類(lèi)進(jìn)行介紹。

1. 1 序列已知的刺盤(pán)孢菌病毒

1. 1. 1 C. acutatum partitivirus 1（CaPV1） Zhong等（2014）從辣椒果實(shí)上分離的尖孢刺盤(pán)孢中發(fā)現(xiàn)直徑約40 nm的球形病毒樣顆粒，分離檢測(cè)后獲得2條dsRNA條帶，大小分別為1762和1381 nt;分析發(fā)現(xiàn)這2條dsRNA條帶各包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），分別編碼62和40 kD蛋白;其中，62 kD蛋白與部分病毒的RNA依賴(lài)RNA聚合酶（RdRp）相似，而40 kD蛋白與所有數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的任何衣殼蛋白（CP）均無(wú)顯著相似性;基因組比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該病毒與雙分病毒科的真菌病毒密切相關(guān)，因此，將其命名為C. acutatum partitivirus 1（CaPV1）。

1. 1. 2 C. higginsianum Non-segmented dsRNA virus 1（ChNRV1） Campo等（2016）發(fā)現(xiàn)希金斯刺盤(pán)孢菌株存在基因組未分段的dsRNA真菌病毒，命名為C. higginsianum Non-segmented dsRNA virus 1（ChNRV1）;分析發(fā)現(xiàn)該dsRNA大小為2923 nt，包含兩個(gè)不同的ORF：ORF1編碼一個(gè)假定的CP，而ORF2編碼一種假定的RdRp;通過(guò)對(duì)病毒RdRp進(jìn)行最大似然系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)ChNRV1既不屬于Totiviridae也不屬于Partitiviridae，而被歸為Partitiviridae家族的姐妹支——Amalgaviridae，作者認(rèn)為ChNRV1要么是Amalgaviridae的新成員，要么屬于一個(gè)尚未確定的家族。

1. 1. 3 C. truncatum partitivirus 1（CtParV1） Marzano等（2016）發(fā)現(xiàn)平頭刺盤(pán)孢菌株中存在兩個(gè)與Partitiviridae親緣關(guān)系較近的dsRNA序列：dsRNA1（1820 nt，編碼病毒RdRp蛋白）和dsRNA2（1535 nt，編碼病毒CP蛋白），這兩個(gè)dsRNA的序列長(zhǎng)度及其編碼的多肽長(zhǎng)度均與gammapartitivtivirus屬病毒相近，且dsRNA1與gammapartitivtivirus屬Verticillium dahliae partitivirus 1 RNA1的相似性達(dá)87%，因此將該病毒命名為C. truncatum partitivirus 1。

1. 1. 4 C. gloeosprioides chrysovirus 1（CgCV1）

Zhong等（2016）從盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢中分離出一種新型dsRNA真菌病毒（C. gloeosprioides chrysovirus 1，CgCV1），由3個(gè)dsRNA基因組片段組成（dsRNA 1～dsRNA 3），長(zhǎng)度分別為3397、2869和2630 bp，各包含一個(gè)ORF，推定dsRNA 1～dsRNA 3分別編碼RdRp、CP和蛋白酶;CgCV1 RdRp的系統(tǒng)發(fā)育分析表明該病毒與Fusarium oxysporum chrysovirus 1密切相關(guān);根據(jù)病毒基因組片段大小、序列和結(jié)構(gòu)特征，RdRp的氨基酸序列相似性，特定基序的特征，病毒粒子的大小和結(jié)構(gòu)特征，作者認(rèn)為CgCV1是Chrysovirus屬的一個(gè)新物種。

1. 1. 5 C. camelliae filamentous virus 1 （CcFV-1）

Jia等（2017）在山茶刺盤(pán)孢菌中發(fā)現(xiàn)一種長(zhǎng)達(dá)4661.6 nm的線(xiàn)狀病毒，命名為C. camelliae filamentous virus 1（CcFV-1），是目前唯一一例線(xiàn)狀真菌病毒;CcFV-1有8個(gè)dsRNA，長(zhǎng)度分別為990、1053、1085、1122、1299、2012、2253和2444 bp，共編碼10個(gè)ORF，其中ORF1編碼一個(gè)RdRp，ORF4編碼CP;系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)CcFV-1與Aspergillus fumigatus tetramycovirus-1和Beauveria bassiana polymycovirus-1有一定的系統(tǒng)親緣關(guān)系，但在病毒形態(tài)和基因組組成上存在差異;CcFV1病毒的基因組大小不到3000 bp，卻包被在長(zhǎng)約4000 nm的病毒中，這可能是一種新的病毒包裝機(jī)制。CcFV1病毒的發(fā)現(xiàn)對(duì)進(jìn)一步了解RNA病毒的形態(tài)、進(jìn)化及分子特性等具有重要意義。

1. 1. 6 C. fructicola chrysovirus 1（CfCV1） Zhai等（2018）從果生刺盤(pán)孢菌株中分離并鑒定出一種新型7段dsRNA病毒，命名為C. fructicola chrysovirus 1 （CfCV1）。CfCV1為直徑35 nm的球狀病毒粒子;dsRNA 1～dsRNA 7的全長(zhǎng)分別為3620、2801、2687、2437、1750、1536和1211 bp;其中，dsRNA 1編碼RdRp，dsRNA 2編碼CP，dsRNA 5編碼一種C2H2型鋅指蛋白，dsRNA 3、dsRNA 4和dsRNA 6編碼其他蛋白的功能尚不清楚;基于RdRp和CP的系統(tǒng)發(fā)育分析表明CfCV1與Botryosphaeria dothidea chrysovirus 1和Penicillium janczewskii chrysovirus 2有系統(tǒng)親緣關(guān)系，同屬于產(chǎn)黃青霉科病毒。

1. 2 序列未知的刺盤(pán)孢菌病毒

除上述刺盤(pán)孢菌真菌病毒的基因組已進(jìn)行測(cè)序外，還有一些真菌病毒基因組未完成測(cè)序，僅觀(guān)察到類(lèi)似病毒的顆粒和/或提取到部分dsRNA片段。如Moffitt和Lister（1975）、Rawlinson等（1975）使用血清學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)禾生刺盤(pán)孢、鐮形刺盤(pán)孢和豆刺盤(pán)孢含dsRNA真菌病毒，通過(guò)電鏡可觀(guān)察到豆刺盤(pán)孢的病毒粒子為直徑30 nm的等距粒子。Dale等（1988）使用纖維素柱層析法提取了14株盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢菌株的dsRNA，發(fā)現(xiàn)菌株所含dsRNA的數(shù)量和大小與炭疽病類(lèi)型存在相關(guān)性。Figueirêdo等（2012）利用纖維素柱層析法從腰果刺盤(pán)孢病菌（C. gloeosporioides）菌株上分離得到9條dsRNA，透射電鏡可觀(guān)察到分離所得的RNA為直徑30～35 nm的球形病毒顆粒。Liao等（2012）利用纖維素粉抽提法提取3株不同致病力的尖孢刺盤(pán)孢病菌的dsRNA，發(fā)現(xiàn)不同致病力菌株中dsRNA的組成和大小存在差異，其中弱致病力菌株Coll-365中包含2條大小分別為1300和2500 bp的dsRNA，而強(qiáng)致病力菌株Coll-524中為1400和1700 bp的2條dsRNA條帶。Lima等（2012）對(duì)39株巴西胡椒刺盤(pán)孢病菌（C. gloeosporioides）進(jìn)行dsRNA提取，只在3株中發(fā)現(xiàn)1條3000 bp的dsRNA條帶。

2 真菌病毒對(duì)刺盤(pán)孢菌的影響

2. 1 表型

Zhong等（2014）通過(guò)環(huán)已胺法脫除尖孢刺盤(pán)孢病菌菌株中的CaPV1病毒，獲得2株脫毒菌株，在感染病毒和脫除病毒的分離株之間，菌落表型在色素沉著和菌絲生長(zhǎng)上有輕微差異，脫毒菌株黑色素積累顯著減少，菌絲生長(zhǎng)松散或稀疏并出現(xiàn)隆起的同心輪紋圈;Jia等（2017）通過(guò)對(duì)含毒山茶刺盤(pán)孢菌株進(jìn)行單孢分離獲得無(wú)毒菌株，發(fā)現(xiàn)脫毒后的菌株呈現(xiàn)隆起的同心輪紋圈，且分泌黑色素減少;而轉(zhuǎn)染CcFV-1后，菌落形態(tài)恢復(fù)至與帶毒親本相似，即菌株輪紋圈消失，黑色素增加，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)（15 d），黑色素累積顯著增多，說(shuō)明病毒的存在顯著影響了寄主真菌的菌落形態(tài)。但也有研究指出病毒存在對(duì)果生刺盤(pán)孢菌株的菌落形態(tài)無(wú)明顯影響（Zhai et al.，2018），說(shuō)明不同病毒粒子對(duì)寄主真菌的影響存在差異。

2. 2 生長(zhǎng)

Jia等（2017）通過(guò)對(duì)山茶刺盤(pán)孢菌株和脫毒菌株進(jìn)行生長(zhǎng)速度測(cè)定，結(jié)果顯示3株脫毒菌株相比帶毒菌株生長(zhǎng)速度變快（6.3～6.5 mm/d）;轉(zhuǎn)染CcFV-1后，3株菌株的生長(zhǎng)速度變慢（5.6～5.9 mm/d），與帶毒菌株LT-3-1（生長(zhǎng)速度5.4 mm/d）近似。而Zhai等（2018）通過(guò)對(duì)帶毒果生刺盤(pán)孢菌株進(jìn)行單孢分離獲得脫毒菌株，發(fā)現(xiàn)帶CfCV1病毒菌株與無(wú)毒菌株間菌株生長(zhǎng)速率差異不大。

2. 3 產(chǎn)孢

Zhong等（2014）研究發(fā)現(xiàn)在尖孢刺盤(pán)孢病菌分生孢子的產(chǎn)生方面，帶毒菌株與脫毒菌株之間存在顯著差異，即脫毒菌株的產(chǎn)孢量幾乎是帶毒菌株HNZJ001的3倍，意味著病毒可能對(duì)尖孢刺盤(pán)孢病菌有一定的影響，至少在分生孢子的產(chǎn)生方面，這可能有利于這種病原菌的廣泛傳播。與之相反，Campo等（2016）采用環(huán)己胺處理獲得1株ChNRV1病毒固化/脫除的野生型C. higginsianum菌株IMI 349063A，研究發(fā)現(xiàn)無(wú)病毒菌株產(chǎn)孢水平是含毒菌株的8.8倍，證實(shí)C. higginsianum菌株產(chǎn)孢缺陷與ChNRV1病毒有關(guān)。

2. 4 致病力

前人研究發(fā)現(xiàn)有一類(lèi)病毒能使寄主真菌出現(xiàn)產(chǎn)孢能力下降、生長(zhǎng)速率減慢、致病力降低等癥狀，這一類(lèi)真菌病毒稱(chēng)為弱毒相關(guān)病毒（Hypovirulence-associated mycovirus）。目前，在刺盤(pán)孢菌中僅發(fā)現(xiàn)2例能使寄主致病力衰退的弱毒相關(guān)病毒：Jia等（2017）通過(guò)對(duì)帶毒山茶刺盤(pán)孢菌株和脫毒菌株進(jìn)行致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3株脫毒菌株相比帶毒菌株致病力增強(qiáng)（6.1～14.9 mm）;而轉(zhuǎn)染CcFV-1后，3株菌株的致病力減弱（1.0～4.0 mm），與帶毒菌株LT-3-1（病斑長(zhǎng)度1.0 mm）近似，因此作者認(rèn)為CcFV-1通過(guò)損害山茶刺盤(pán)孢細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡引發(fā)弱毒現(xiàn)象，從而影響寄主形態(tài)，如色素生產(chǎn)和分配、生長(zhǎng)率和菌絲輪紋。值得一提的是，CcFV-1裸露的dsRNA也具有感染性，可侵染真菌原生質(zhì)體誘導(dǎo)其產(chǎn)生并積累病毒顆粒，同時(shí)，被CcFV-1病毒感染后的真菌仍能維持生長(zhǎng)活動(dòng)，CcFV-1這種強(qiáng)傳播又不影響宿主生存的能力使其具有顯著的生防潛能。Zhai等（2018）通過(guò)對(duì)帶毒果生刺盤(pán)孢進(jìn)行單孢分離獲得脫毒菌株，發(fā)現(xiàn)帶CfCV1病毒菌株與脫毒菌株間菌落形態(tài)和菌株生長(zhǎng)速率差異不大，但對(duì)離體果實(shí)的弱毒力作用較無(wú)CfCV1菌株強(qiáng)。雖然Liao等（2012）研究發(fā)現(xiàn)帶毒尖孢刺盤(pán)孢Coll-365對(duì)辣椒的致病力顯著低于Coll-153（無(wú)毒）和Coll-524（帶毒），侵染辣椒果實(shí)96 hpi后仍無(wú)法產(chǎn)生分生孢子盤(pán)，但作者并未對(duì)菌株進(jìn)行脫毒或?qū)⒉《巨D(zhuǎn)入無(wú)毒菌株，因此不能確定菌株Coll-365所帶病毒為弱毒相關(guān)病毒。

2. 5 其他

病原真菌分泌的角質(zhì)酶、蛋白酶及漆酶等可降解寄主植物的細(xì)胞壁和角質(zhì)層等，以利于病原真菌的侵入、定殖與擴(kuò)展。另外，真菌附著胞還可通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的丙三醇從而形成巨大的膨脹壓力幫助其穿透植物寄主角質(zhì)層啟動(dòng)侵染植物的進(jìn)程（Money，1999）。Liao等（2012）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶不同類(lèi)型dsRNA的尖孢刺盤(pán)孢具有不同的酶活力和細(xì)胞膨壓，其中弱致病力帶毒菌株Coll-365具有較高的蛋白酶和角質(zhì)酶活性，而強(qiáng)致病力帶毒菌株Coll-524的漆酶活性最高，且Coll-365的細(xì)胞膨壓（<4.9 Mpa）低于Coll-524和無(wú)毒菌株Coll-153（>6.0 Mpa）。同樣由于Liao等（2012）未對(duì)帶毒菌株進(jìn)行脫毒或?qū)o(wú)毒菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因此無(wú)法準(zhǔn)確證實(shí)病毒與菌株酶活力和細(xì)胞膨壓的相關(guān)性。Zhong等（2014）研究也指出攜帶CaPV1病毒的尖孢刺盤(pán)孢菌株與脫毒菌株的漆酶活性無(wú)明顯差異。Campo等（2016）發(fā)現(xiàn)ChNRV1病毒粒子的積累量受真菌DCL1和AGO1蛋白的負(fù)向調(diào)控，但病毒粒子并未被真菌完全清除，作者猜測(cè)ChNRV1可能在尚未研究的環(huán)境中為尖孢刺盤(pán)孢提供了一些優(yōu)勢(shì)，也可能作為載體促進(jìn)真菌基因組的可塑性，通過(guò)進(jìn)化促進(jìn)新的毒力性狀出現(xiàn)。Jia等（2017）對(duì)比脫毒菌株與帶毒菌株的菌絲超微細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在帶毒菌株菌絲體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的為病毒提供復(fù)制和組裝場(chǎng)所的囊泡結(jié)構(gòu)，缺少液泡和伏魯寧體，并且囊泡內(nèi)部還觀(guān)察到疑似病毒樣顆粒，說(shuō)明CcFV-1病毒的存在顯著影響了菌絲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

如上所述，確實(shí)有部分病毒對(duì)寄主真菌的產(chǎn)孢能力、生長(zhǎng)速率、致病力等存在顯著影響，但也有研究表明某些真菌病毒對(duì)寄主沒(méi)有明顯的影響（Buck，2017）。在菜豆刺盤(pán)孢病菌中，Rawlinson等（1975）對(duì)比同一株系的帶毒菌株與無(wú)毒菌株，發(fā)現(xiàn)病毒的存在并不會(huì)對(duì)菜豆刺盤(pán)孢病菌菌株/菌落的形態(tài)、產(chǎn)孢特性及菌株致病力產(chǎn)生影響，甚至在不同碳源培養(yǎng)基（無(wú)碳源或1%葡萄糖、聚果膠或纖維素的Mathur培養(yǎng)基）中，帶毒菌株與無(wú)毒菌株的菌絲生長(zhǎng)速率均無(wú)明顯差異。

3 利用真菌病毒防治植物炭疽病存在的問(wèn)題與前景展望

3. 1 存在問(wèn)題

刺盤(pán)孢屬真菌的種類(lèi)多達(dá)600余種，且多數(shù)種類(lèi)可引起植物嚴(yán)重的炭疽病，造成巨大損失（Jaya-wardena et al.，2016;Carbú et al.，2019）。目前植物炭疽病的防治主要通過(guò)化學(xué)藥劑，若藥劑施用不當(dāng)，不僅防效顯著下降，還將污染環(huán)境，影響人類(lèi)健康。利用弱毒相關(guān)病毒防治植物真菌病害不僅綠色安全高效，而且與其他生物防治方法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)：首先，弱毒相關(guān)病毒一旦進(jìn)入寄主病原菌即可抑制病斑擴(kuò)展，防效精準(zhǔn)快速;其次，含弱毒相關(guān)病毒的弱致病力菌株進(jìn)入寄主植物后不僅不會(huì)傷害寄主植物，還會(huì)誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，增強(qiáng)寄主對(duì)強(qiáng)致病力菌株的抗性;再者，弱毒相關(guān)病毒一旦進(jìn)入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，既可長(zhǎng)久定殖于病原菌體內(nèi)，又可在不同菌株間進(jìn)行傳播，防效長(zhǎng)、作用范圍廣（Xie and Jiang，2014）。最經(jīng)典的是1965年Grente等通過(guò)寄生板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）的弱毒相關(guān)病毒C. parasitica hypovirus 1防治歐洲板栗疫病的蔓延，直至1994年，Heiniger和Rigling對(duì)當(dāng)時(shí)歐洲板栗疫病情況的調(diào)查綜述中還指出，含有弱毒相關(guān)病毒的低毒菌株不僅成功控制了歐洲板栗疫病病情，還顯著降低了板栗疫病的嚴(yán)重性，由此可見(jiàn)真菌病毒確實(shí)具有巨大的生防潛能。但是，利用真菌病毒防治植物炭疽病目前仍存在許多問(wèn)題，主要表現(xiàn)為：

（1）刺盤(pán)孢菌真菌病毒數(shù)量不足。目前，有超過(guò)250種真菌病毒被成功測(cè)序并在NCBI注冊(cè)（Xie and Jiang，2014），其中可引起植物病原真菌致病力衰退的弱毒相關(guān)真菌病毒至少有30余例（表1），其寄主包括栗疫病菌（C. parasitica）、核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）等10余種真菌。由表1可知，核盤(pán)菌中發(fā)現(xiàn)的弱毒相關(guān)病毒數(shù)量較多，種類(lèi)豐富，為防治菌核病提供了堅(jiān)實(shí)后盾。相比于核盤(pán)菌，600多種刺盤(pán)孢菌中僅有9種刺盤(pán)孢菌報(bào)道發(fā)現(xiàn)真菌病毒顯得遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，且僅有2例弱毒相關(guān)病毒能降低寄主致病力，因此，還需進(jìn)一步挖掘刺盤(pán)孢菌中的真菌病毒，為防治植物炭疽病提供支撐。

（2）真菌病毒分離鑒定進(jìn)展緩慢。早期刺盤(pán)孢菌真菌病毒的分離鑒定大多是通過(guò)顯微鏡觀(guān)察和/或血清學(xué)檢測(cè)法（Moffitt and Lister，1975;Rawlinson et al.，1975;Figueirêdo et al.，2012;Zhong et al.，2014），針對(duì)基因組為dsRNA類(lèi)型的真菌病毒也可使用纖維素粉抽提結(jié)合酶解法獲得菌株內(nèi)的dsRNA病毒（Liao et al.，2012;Rosseto et al.，2016;Zhong et al.，2016）。顯微鏡鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)儀器設(shè)備要求較高，血清學(xué)可批量檢測(cè)樣品，但對(duì)微量病毒檢出率低，如Lima等（2012）、Rosseto等（2016）研究中刺盤(pán)孢菌真菌病毒檢出率較低，分別為7.7%（3/39）和3.85%（1/26），原因可能是刺盤(pán)孢菌中仍有部分真菌病毒基因組類(lèi)型為單鏈RNA或DNA。此外，在顯微鏡下未觀(guān)察到病毒顆粒并不意味著沒(méi)有真菌病毒。正如Nuss（2005）所描述，這可能是因?yàn)樵S多真菌病毒并不編碼衣殼蛋白，而是以裸露的dsRNA分子存在，因此，醋酸雙氧鈾無(wú)法染色病毒蛋白，從而無(wú)法觀(guān)察到病毒顆粒，而纖維素粉抽提結(jié)合酶解法僅局限于dsRNA病毒，因此，還需探索更高效準(zhǔn)確的真菌病毒檢測(cè)鑒定方法。

（3）真菌病毒傳播效率低。真菌病毒粒子普遍不具有侵染性，不能在體外對(duì)寄主真菌進(jìn)行傳播，而真菌的細(xì)胞壁也在一定程度上攔截了真菌細(xì)胞對(duì)病毒的攝入。因此，大部分真菌病毒只能通過(guò)寄主細(xì)胞分裂和孢子產(chǎn)生的垂直傳播方式或菌絲細(xì)胞融合的水平傳播方式在細(xì)胞內(nèi)傳播，其中垂直傳播主要通過(guò)產(chǎn)生無(wú)性孢子進(jìn)行（Varga et al.，2003），而水平傳播僅限于在遺傳上可親和的菌株間進(jìn)行（Hutchison et al.，2009）。Hutchison等（2009）研究表明，營(yíng)養(yǎng)體不親和的菌株在菌絲接觸時(shí)會(huì)出現(xiàn)程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象，使真菌病毒不能通過(guò)菌絲融合進(jìn)行水平傳播。另外，攜帶弱毒相關(guān)病毒的真菌菌株一般生命力弱、不易存活，在自然環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)力差，進(jìn)一步影響了病毒的傳播力。所以傳播效率不足是真菌病毒生防應(yīng)用的主要限制因素。在核盤(pán)菌中已發(fā)現(xiàn)病毒SsHADV-1不僅能在寄主細(xì)胞內(nèi)傳播，降低寄主致病力，還可通過(guò)純病毒顆粒和基因組DNA進(jìn)行體外侵染，抑制PDA上核盤(pán)菌的生長(zhǎng)，或接噴在擬南芥和甘藍(lán)油菜葉子上，可感染無(wú)病毒油菜菌核病菌絲，減緩發(fā)病程度，提高野外培養(yǎng)油菜籽的產(chǎn)量（Yu et al.，2010，2013;于曉，2013）;而病毒SsMYRV4可作為其他病毒粒子傳播的橋梁，介導(dǎo)弱毒相關(guān)病毒在不同菌株個(gè)體間傳播，降低病原菌群體的致病力（Wu et al.，2017）。在刺盤(pán)孢菌中，僅發(fā)現(xiàn)一例病毒粒子裸露的dsRNA具有感染性，可通過(guò)原生質(zhì)體融合侵染真菌原生質(zhì)體，誘導(dǎo)其產(chǎn)生并積累CcFV-1病毒顆粒（Jia等，2017），但未有研究指出其具有田間防治效果，值得進(jìn)一步探究。因此，還需進(jìn)一步發(fā)掘具有高傳播效率的真菌病毒資源及探索更高效的輔助病毒傳播的方法，提高真菌病毒應(yīng)用潛力和價(jià)值。

（4）真菌病毒與刺盤(pán)孢菌間的互作研究不夠深入。大量研究表明，弱毒相關(guān)病毒的侵染將造成寄主的基因表達(dá)異常、蛋白質(zhì)合成受阻或代謝等功能發(fā)生改變。攜帶弱毒相關(guān)病毒的弱毒株可視為遺傳背景相同且無(wú)病毒的強(qiáng)毒株在毒力調(diào)控途徑中發(fā)生突變的突變體，故可通過(guò)比較強(qiáng)毒株與遺傳背景相同的弱毒株之間的表達(dá)差異來(lái)研究影響真菌毒力的因子（康寧，2004）。因此，弱毒相關(guān)病毒除具有應(yīng)用于生物防治的潛力外，還可作為模式病毒用于病毒與寄主的互作以及植物病原真菌的致病機(jī)理研究（李文靜等，2015）。目前，研究弱毒相關(guān)病毒與寄主真菌互作相對(duì)成熟的系統(tǒng)主要包括：CHV1-栗疫病菌互作系統(tǒng)、SsDRV-核盤(pán)菌互作系統(tǒng)、FgV1-鐮刀菌互作系統(tǒng)和BVX/BVF-灰霉菌互作系統(tǒng)（劉忱等，2018）。在刺盤(pán)孢真菌病毒的報(bào)道中僅有Zhong等（2014）、Campo等（2016）、Jia等（2017）、Zhai等（2018）的研究成功獲得脫毒菌株，通過(guò)對(duì)比帶毒菌株與脫毒菌株，驗(yàn)證病毒粒子對(duì)寄主真菌的影響;只有Campo等（2016）研究了寄主真菌對(duì)病毒粒子的影響，指出C. higginsianum中涉及ChDCL1和ChAGO1的RNA沉默可能具有抗病毒作用;僅有Jia等（2017）報(bào)道將CcFV-1病毒dsRNA成功轉(zhuǎn)染了脫毒C. camelliae菌株。由此可見(jiàn)，病毒與刺盤(pán)孢菌間的互作研究仍需進(jìn)一步深入。

3. 2 前景展望

3. 2. 1 病毒挖掘 近期研究表明，利用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可不依賴(lài)于病毒培養(yǎng)及病毒序列，直接以環(huán)境（樣本）中病毒核酸為研究對(duì)象，快速準(zhǔn)確地鑒定出樣本中所有的病毒序列組成，為病毒資源的挖掘與研究提供了極大便利（Shi et al.，2016）。宏轉(zhuǎn)錄組是一門(mén)研究環(huán)境中總RNA的技術(shù)，由于真菌病毒基因組多為dsRNA和ssRNA類(lèi)型，因此，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用對(duì)刺盤(pán)孢菌真菌病毒研究具有重要意義。Marzano等（2016）研究指出，相比傳統(tǒng)先富集樣本中病毒再提取病毒RNA進(jìn)行測(cè)序的方法，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)直接提取真菌總RNA進(jìn)行測(cè)序，避免了富集過(guò)程造成大量病毒序列信息的損失。Mu等（2017）利用該技術(shù)對(duì)澳大利亞84株核盤(pán)菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)57例真菌病毒，包括32例新病毒，為植物菌核病的防治提供了豐富的生防資源。筆者通過(guò)宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（數(shù)據(jù)未發(fā)表）發(fā)現(xiàn)弱致病力芒果刺盤(pán)孢病菌（Colletotrichum spp.）中的病毒基因組序列占比遠(yuǎn)高于強(qiáng)致病菌株，且弱致病力菌株中平均70%的病毒基因組序列為Partitiviridae，而強(qiáng)致病力菌株中未發(fā)現(xiàn)Partitiviridae病毒序列，由此推定弱致病力菌株中可能存在能引起致病力衰退的弱毒相關(guān)病毒，且該病毒與Partitiviridae親緣關(guān)系較近。因此，利用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可快速鑒定刺盤(pán)孢菌中的真菌病毒，挖掘更多具有生防潛力的真菌病毒，促進(jìn)植物炭疽病的生防研究。

3. 2. 2 提高病毒傳播效率 除篩選具有強(qiáng)侵染力的弱毒相關(guān)真菌病毒資源外，還可通過(guò)人為技術(shù)手段打破菌株?duì)I養(yǎng)體不親和限制，幫助病毒粒子轉(zhuǎn)移和繁殖。（1）利用化學(xué)物質(zhì)。Hutchison等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇、活性氧（ROS）及Ca2+信號(hào)途徑均與粗糙脈孢霉的營(yíng)養(yǎng)不親和性密切相關(guān)。Kenichi等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，鋅的化合物可減弱白紋羽病菌菌株間的營(yíng)養(yǎng)體不親和性，提高菌株間病毒粒子的傳播效率。因此，Xie和Jiang（2014）推測(cè)，ROS清除劑或可用于克服真菌間的營(yíng)養(yǎng)不親和性。（2）遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)原生質(zhì)體融合（Lecoq et al.，1979）、電擊法（Chen et al.，1994）、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)（Varga et al.，1994）、基因槍轟炸（Sasaki et al.，2002）和農(nóng)桿菌介導(dǎo)（于曉，2013）等方法將病毒粒子/病毒RNA/病毒cDNA轉(zhuǎn)入真菌原生質(zhì)體獲得可復(fù)制的病毒，以克服營(yíng)養(yǎng)體非親和性限制，實(shí)現(xiàn)病毒粒體在不同菌株間的擴(kuò)散，甚至在遠(yuǎn)緣不同種之間轉(zhuǎn)移，拓寬病毒的寄主范圍。另一方面，Zhang和Nuss（2016）、Stauder等（2018）通過(guò)破壞板栗疫病菌的多個(gè)營(yíng)養(yǎng)不親和位點(diǎn)打破菌株間的營(yíng)養(yǎng)不親和，使改造后的病原菌成為低毒病毒的超級(jí)供體，通過(guò)菌絲融合將病毒傳播至不同菌株，用于野外板栗疫病菌的防治。（3）挖掘傳播介體。Liu等（2016）研究發(fā)現(xiàn)厲眼蕈蚊幼蟲(chóng)食用了感染SsHADV-1病毒的核盤(pán)菌后，SsHADV-1會(huì)在厲眼蕈蚊體內(nèi)及其細(xì)胞中復(fù)制積累，然后再經(jīng)厲眼蕈蚊轉(zhuǎn)移至其他不攜帶病毒的核盤(pán)菌菌株。因此，食用真菌的昆蟲(chóng)或可發(fā)掘成為真菌病毒傳播介體。

3. 2. 3 建立真菌和病毒的遺傳操作系統(tǒng) 栗疫病菌、核盤(pán)菌、灰霉菌和禾谷鐮刀菌的基因組均為單倍體，遺傳性狀穩(wěn)定，不僅建立了原生質(zhì)體再生、基因敲除或互補(bǔ)等分子遺傳轉(zhuǎn)化體系，還建立了病毒侵染性克隆和高效病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，可簡(jiǎn)便、快速地克隆和鑒定出寄主靶基因。由此可知，建立真菌遺傳操作系統(tǒng)和病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，是研究寄主真菌與真菌病毒互作機(jī)制的首要條件（Nuss，2011）。迄今已有27種刺盤(pán)孢菌基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）被測(cè)定，同時(shí)，盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢菌、瓜類(lèi)刺盤(pán)孢菌和禾生刺盤(pán)孢菌等多種刺盤(pán)孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系已成功構(gòu)建（Yan et al.，2018），這為進(jìn)一步研究刺盤(pán)孢菌與病毒的分子互作提供了有力支持。但刺盤(pán)孢菌中病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)仍存在許多困難需要克服，如病毒侵染性克隆、轉(zhuǎn)化及病毒基因組/病毒粒子轉(zhuǎn)染等，因此，還需認(rèn)真借鑒CHV1-栗疫病菌和SsDRV-核盤(pán)菌等互作系統(tǒng)中的分子技術(shù)在刺盤(pán)孢菌中建立相應(yīng)的病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)。

3. 2. 4 結(jié)合多組學(xué)手段研究病毒與寄主真菌互作

弱毒相關(guān)病毒與寄主真菌這一特殊系統(tǒng)再結(jié)合快速發(fā)展的組學(xué)研究技術(shù)將為研究病毒在寄主中復(fù)制并引起癥狀的機(jī)理、病原真菌致病力/毒力的構(gòu)成及調(diào)控機(jī)理等病毒學(xué)和病原真菌學(xué)的核心問(wèn)題提供極大便利。Allen等（2003）應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在一定程度上揭示了低毒病毒CHV1-EP713對(duì)板栗疫病菌基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的規(guī)模和程度：超過(guò)2200個(gè)差異表達(dá)基因，涉及的生物功能包括應(yīng)激反應(yīng)、碳代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。Kwon等（2009）利用比較蛋白組學(xué)研究弱毒相關(guān)病毒Fusarium graminearum virus-DK21（FgV-DK21）的侵染對(duì)禾谷鐮刀菌的影響，發(fā)現(xiàn)病毒特異性地影響寄主碳代謝、氨基酸代謝及能量代謝等通路中關(guān)鍵酶和成分的積累。Lee Marzano等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，弱毒相關(guān)病毒侵染核盤(pán)菌后寄主真菌會(huì)產(chǎn)生大量特殊的mRNA和sRNA重新編碼產(chǎn)物。因此，利用組學(xué)手段可確定真菌病毒侵染對(duì)刺盤(pán)孢菌轉(zhuǎn)錄、翻譯和加工的調(diào)控模式，確定病毒與刺盤(pán)孢菌互作的關(guān)鍵基因及刺盤(pán)孢菌的致病關(guān)鍵基因，為利用真菌病毒防治刺盤(pán)孢菌引起的植物炭疽病打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）