貽貝足的共聚焦顯微拉曼光譜分析

梁政委，杜增豐，李超倫，王敏曉，王 冰，張 鑫，閻 軍

1. 中國科學(xué)院海洋研究所，中國科學(xué)院海洋地質(zhì)與環(huán)境重點實驗室，中國科學(xué)院海洋研究所深海極端環(huán)境與生命過程研究中心，山東 青島 266071 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋地質(zhì)過程與環(huán)境功能實驗室，山東 青島 266061 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071

引 言

海洋貽貝屬軟體動物門，瓣鰓綱，其廣泛分布于沿岸和近海，主要通過足絲附著于巖石、船體或其他基質(zhì)表面來生存。貽貝的足絲通過貽貝足腺體分泌貽貝粘附蛋白(mussel adhesive protein, MAP)而形成的，這些蛋白在貽貝腹溝內(nèi)經(jīng)過一系列作用形成組分、結(jié)構(gòu)和功能完全不同的核心、外皮表面和粘附盤[1-2][圖1(a)]。

近年來，關(guān)于貽貝足以及足絲的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，F(xiàn)ilippidi等闡明了足絲組成：足絲核心部分主要由半結(jié)晶的膠原蛋白組成，稱為Precols；足絲纖維外皮表面由貽貝足蛋白-1(mfp-1)組成，對核心起到保護(hù)作用；粘附盤由大量富多巴的蛋白質(zhì)組成(mfp-2, -3, -4, -5, -6)，主要成分是酪蛋白經(jīng)過后翻譯修飾羥基化而形成的-3,4-二羥基苯丙氨酸(多巴，DOPA)，在貽貝足絲與其他基質(zhì)表面粘附時起主要作用[2-3]，Inoue等利用分子生物學(xué)方法研究了海洋貽貝足絲粘附蛋白的分子結(jié)構(gòu)[4]、Schmitt等的研究工作闡述了貽貝的DOPA與Fe等金屬離子進(jìn)行螯合作用的粘附機(jī)理[5]、Priemel等利用拉曼光譜技術(shù)對貽貝足腺體以及人工誘導(dǎo)后的腺體進(jìn)行拉曼光譜檢測揭示了貽貝足絲的生成的一系列生物調(diào)控過程[6-7]。相比于傳統(tǒng)的研究方法，拉曼光譜是一種非接觸、無損的提供物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)等生物化學(xué)信息原位探測技術(shù)手段，其不需要特殊繁雜的樣品預(yù)處理，可以避免樣品污染以獲得原本的樣品信息。而共聚焦顯微拉曼光譜儀在拉曼光譜儀的基礎(chǔ)上，在光路中引入針孔，激光通過針孔聚焦為微小光斑，只有在焦平面上的樣品產(chǎn)生的拉曼信號可以通過共聚焦孔回收至光譜，提高了信噪比和空間分辨率，還能有效的減少熒光干擾。對樣品微區(qū)進(jìn)行無損的拉曼光譜分析和2D掃描，可以直觀地呈現(xiàn)生物樣品化學(xué)組成與分布特征。近年來，共聚焦顯微拉曼光譜已經(jīng)逐漸應(yīng)用在生物組織和細(xì)胞檢測方面。

足絲是貽貝足腺體的外在表現(xiàn)形式，本文結(jié)合掃描電鏡和共聚焦顯微拉曼光譜對深海和淺海貽貝的足組織進(jìn)行分析，從貽貝足絲的表觀差異到貽貝足腺體的分泌蛋白組分和分布特征，探討兩種貽貝足組織分泌蛋白的差異對生成足絲的影響以及對環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，可以利用拉曼光譜成像技術(shù)研究不同環(huán)境下的貽貝足腺體分布特征，其對工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)對不同環(huán)境生產(chǎn)高效理想粘性復(fù)合材料具有指示意義。

1 實驗部分

1.1 樣品制備

深海貽貝(Bathymodiolusplatifrons)樣品于2017年“科學(xué)號”冷泉航次取自南海冷泉大陸坡福爾摩沙脊“Fanmaoqu”位點[圖1(b和c)]，采樣過程由“發(fā)現(xiàn)”號水下纜控機(jī)器人(ROV)完成。淺海貽貝(Mytilusedulis)來自于大連小平島。樣品采集至甲板后立即用海水沖洗，解剖的足組織于-80 ℃凍存。在-25 ℃的溫度下，使用冷凍切片機(jī)(HM 505 E, Germany, 69190 Walldorf)切下10 μm厚度的足組織切片，將其固定在載玻片上用于拉曼探測分析。

圖1 (a) 貽貝足絲形成模式圖；(b) 深海貽貝(Bathymodiolus platifrons)的采樣位點的地形圖；(c) 深海貽貝(Bathymodiolus platifrons)和淺海貽貝(Mytilus edulis)足、足絲、粘附盤結(jié)構(gòu)圖

Fig.1(a)Themodelofmusselbyssusformation; (b)Samplingsiteofdeep-seamussels(Bathymodiolusplatifrons); (c)Structuralimageoffoot,byssusandadhesiveplaqueofmussel(Bathymodiolusplatifrons)andmussel(Mytilusedulis)

1.2 儀器

共聚焦顯微拉曼光譜儀(alpha 300R+, WITec, Ulm, Germany)(圖2)用于貽貝足的單譜和成像分析，激發(fā)光源波長為532 nm，顯微鏡物鏡為50×/0.55(Zeiss, EC, Epiplan-Neofluar, Germany)，到達(dá)樣品處的激光功率為20 mW，UHTS300型光譜儀搭配600刻線光柵使光譜采集范圍為0～3 000 cm-1，分辨率為3 cm-1。進(jìn)行光譜采集時積分時間為1.5 s，累積次數(shù)為10，劃定面掃描區(qū)域，設(shè)置x和y方向的像素點，步長為500 nm。使用WITec Project plus軟件對拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，analysis是通過對某組分的特征峰區(qū)域進(jìn)行單變量成像，進(jìn)而整合所檢測區(qū)域的多個組分圖像得到各組分相對分布的2D拉曼光譜圖像。

圖2 WITec共聚焦拉曼光譜儀部件組成以及光路模式圖

1: 透鏡式UHTS拉曼譜儀系列；2: 光子晶體光纖；3: CCD探測器；4: 濾光片裝置；5: 激光光源；6：光纖；7：柯勒白光照明；8: 物鏡；9：聚焦用的Z軸電機(jī)；10：壓電掃描臺與機(jī)械平臺

Fig.2ImageofcomponentsofconfocalRamanmicroscopy(WITec)andlightpath

1: Ultra-high throughout spectrometer; 2: Optical fiber; 3: CCD; 4: Filter; 5: Excitation laser; 6: Optial fiber; 7: Kolver lighting source; 8: Objective lens; 9: Z-axis motor; 10: XY-axis motor

2 結(jié)果與討論

2.1 深海和淺海貽貝足絲的表觀特征

結(jié)合深海貽貝和淺海貽貝足絲的形態(tài)學(xué)知識和掃描電鏡表征(圖3)，兩種貽貝足絲特征如下：深海貽貝足絲稀疏而寬粗，粗度約為400 μm，其外皮表面較粗糙雜亂，粘附盤較大；淺海貽貝足絲繁多而纖細(xì)，粗度約為70 μm，其外皮表面較光滑平整，粘附盤較小。兩種貽貝足絲形態(tài)學(xué)表觀相差很大，而足絲由貽貝足腺體分泌的蛋白在各種作用下生成，所以足絲表觀差異是貽貝足腺體差異的外在表現(xiàn)形式，所以檢測兩種貽貝足腺體的組成以及分布對了解兩種足絲差別具有重要意義。

2.2 深海(Bathymodiolus platifrons)和淺海貽貝(Mytilus edulis)足的組分檢測以及分布特征

由于樣品進(jìn)行冷凍切片，受環(huán)境影響失水，鏡下形態(tài)改變，且兩種貽貝足的尺寸存在差異，在未經(jīng)染色的條件下無法保證兩種貽貝測定時位置一致性，所以本實驗對兩種貽貝的足腺體局部進(jìn)行拉曼檢測和成像，通過多點位多光譜重復(fù)檢測的方式確定腺體間的臨界位置。

拉曼光譜(如圖4和圖5)表明兩種貽貝足蛋白種類基本相同，都存在位于1 667 cm-1的amide Ⅰ和位于1 230～1 340 cm-1的amide Ⅲ蛋白質(zhì)骨架信號，基本表現(xiàn)為1 242，1 269，1 318和1 337 cm-1四個拉曼峰。而Amide Ⅲ的四個峰的相對強(qiáng)度變化又可以表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異，其中核心腺體的蛋白質(zhì)表現(xiàn)為有序的β重疊或螺旋蛋白質(zhì)高級構(gòu)象，對應(yīng)譜圖表現(xiàn)為位于1 242和1 269 cm-1位置的兩個峰的峰強(qiáng)度相對其他兩個較高，與膠原蛋白preCol的二級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一致，而外皮和粘附盤腺體的蛋白構(gòu)象無序，其光譜上表現(xiàn)為位于1 242和1 269 cm-1位置的兩個峰峰強(qiáng)度相對較低。

圖3 貽貝足絲掃描電鏡圖

上方為深海貽貝(Bathymodiolusplatifrons)，(a)和(c)分別為其粘附盤60倍和10 000倍電鏡圖，(b)和(d)分別為其足絲190倍和1 000倍電鏡圖；下方為近海貽貝(Mytilusedulis)，(e)和(g)分別為其粘附盤150倍和10 000電鏡圖，(f)和(h)分別為其足絲1 100倍和10 000電鏡圖；(a)標(biāo)尺為500 μm，(b)和(e)標(biāo)尺為300 μm，(c)和(g)標(biāo)尺為5 μm，(d), (h)和(f)標(biāo)尺為50 μm

Fig.3SEMofmusselfootbyssus

Upper part is deep-sea mussel, (a) and (c) is SEM of deep-sea mussel plaque 60× and 10 000× respectively, (b) and (d) is SEM of deep-sea mussel byssus 190× and 1 000× respectively; below part is shallow sea mussel, (e) and (g) SEM of shallow-sea mussel plaque 150× and 10 000× respectively, (f) and (h) is SEM of shallow-sea mussel byssus 150× and 10 000× respectively. Scale bar: (a) 500 μm，(b) and (e) 300 μm，(c) and (g) 5 μm，(d), (h) and (f) 50 μm

此外，三個腺體組成上也存在差異，外皮腺體和粘附盤腺體由特殊的蛋白質(zhì)組成，拉曼光譜表現(xiàn)為位于643，830，850和1 615 cm-1四個峰位置的酪氨酸(Tyr)信號以及由酪氨酸后翻譯修飾羥基化形成的拉曼信號峰位于785 cm-1的-3,4-二羥基苯丙氨酸(多巴，DOPA)信號[8]，表明外皮腺體(mfp-1)和粘附盤腺體(mfp2-6)存在酪氨酸和多巴。譜圖還呈現(xiàn)了位于1 006 cm-1的苯丙氨酸(Phe)信號[9]，其為mfp-2的主要組分，表明了足蛋白-2的存在。相對于深海貽貝，淺海貽貝的拉曼譜圖表現(xiàn)出高強(qiáng)度的位于1 043 cm-1位置的膠原蛋白信號[8]。

本實驗對兩種貽貝的三個腺體的局部區(qū)域進(jìn)行了拉曼成像，得到了2D拉曼彩色分布圖(如圖4和圖5)，其形象的展現(xiàn)了三個腺體區(qū)域的局部界限與分布，其中紅色、藍(lán)色和綠色分別與外皮、核心和粘附盤腺體區(qū)域一一對應(yīng)，黃色區(qū)域代表除三種腺體外貽貝足組織的剩余組分。2D拉曼彩色分布圖表明兩種貽貝足組織組分分布特征：淺海貽貝的核心和粘附盤腺體區(qū)域分布較分散，即區(qū)域中夾雜零散的黃色部分，而外皮腺體分布較集中；深海貽貝的核心和粘附盤腺體區(qū)域分布相對集中，即黃色區(qū)域分布集中，外皮腺體區(qū)域較集中。

2.3 貽貝足腺體以及足絲與環(huán)境的關(guān)系

貽貝足腺體分泌蛋白形成足絲，足絲是足腺體的外在表現(xiàn)形式，所以足腺體分布特征決定了的足絲形態(tài)特征。深海貽貝和近海貽貝表現(xiàn)出較大差異的足絲表觀和內(nèi)部足腺體分布，這可能源于兩種貽貝對各自生存環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制：本實驗所用的深海貽貝生存在中國南海冷泉繁茂區(qū)，附著于自生碳酸鹽巖上，需要利用冷泉滲漏的甲烷生存，其棲息環(huán)境表現(xiàn)為高壓、黑暗、低溫、富甲烷、富硫化氫結(jié)合等，貽貝足絲較粗，其強(qiáng)度、韌性相對較好，即便受到海流或其他地質(zhì)活動影響，有利于貽貝安穩(wěn)的固定在冷泉滲漏區(qū)域來生存；而淺海貽貝生存在大連小平島，水域環(huán)境溫度較高，受人類活動影響較大，淺海海流較大，在受海流擾動時貽貝足絲較細(xì)有利于貽貝斷開單個足絲進(jìn)行遷徙重新附著。除海流外，pH、壓力、溫度等理化環(huán)境參數(shù)以及粘附基質(zhì)也可能造成兩種貽貝足和足絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。所以貽貝為適應(yīng)不同環(huán)境表現(xiàn)出的貽貝足絲的高粘附強(qiáng)度、高韌性、強(qiáng)耐水性的性質(zhì)，這些有效的粘附蛋白是一種高效的高聚天然生物膠黏劑，其為工業(yè)生產(chǎn)適應(yīng)多種復(fù)雜環(huán)境應(yīng)用的聚合物材料提供理論基礎(chǔ)。

圖4 中國南海冷泉貽貝足腺體的拉曼光譜圖

(a)：三個足腺體的拉曼光譜，(b)：外皮腺體和核心腺體的2D拉曼彩色圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，外皮腺體(1 596～1 630 cm-1，紅色)；(c)：核心腺體和粘附盤腺體的2D拉曼彩色分布圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，粘附盤腺體(1 596～1 630 cm-1，綠色)，標(biāo)尺條為4 μm

Fig.4RamanspectraimageofmusselfootglandsfromcoldseepattheSouthChinaSea

(a): Raman spectra of three foot glands；(b): 2D Raman color-coded image of cuticleand core gland, core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the cuticle gland (1 596～1 630 cm-1, red)；(c): 2D Raman color-coded image of core and plaque gland; core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the plaque gland (1 596～1 630 cm-1, green)；Scale bars: 4 μm

圖5 大連小平島貽貝(Mytilus edulis)足腺體的拉曼光譜圖

(a)：三個足腺體的拉曼光譜，(b)：外皮腺體和核心腺體的2D拉曼彩色圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，外皮腺體(1 596～1 630 cm-1，紅色)；(c)：核心腺體和粘附盤腺體的2D拉曼彩色分布圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，粘附盤腺體(1 596～1 630 cm-1，綠色)，標(biāo)尺條為10 μm

Fig.5Ramanspectraimageofmusselmussel(Mytilusedulis)footglandfromDalianXiaopingisland

(a): Raman spectra of three foot glands, (b): 2D Raman color-coded image of cuticleand core gland, core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the cuticle gland (1 596～1 630 cm-1, red)；(c): 2D Raman color-coded image of core and plaque gland；core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the plaque gland (1 596～1 630 cm-1, green)；Scale bars: 10 μm

3 結(jié) 論

分別對淺海貽貝和深海貽貝足組織切片進(jìn)行拉曼檢測和成像，得到了三個腺體的拉曼光譜以及腺體局部區(qū)域的2D拉曼彩色分布圖。拉曼光譜表明兩種貽貝足腺體組成：核心腺體表現(xiàn)為有序高級的蛋白構(gòu)象，外皮和粘附盤表現(xiàn)為豐富的酪氨酸和多巴組成；淺海貽貝在1 043 cm-1位置有高強(qiáng)度的膠原蛋白信號。拉曼成像呈現(xiàn)兩種貽貝腺體分布特征：深海貽貝表現(xiàn)為較為集中的腺體分布，淺海貽貝腺體分布較為分散，表明貽貝為適應(yīng)不同環(huán)境形成不同的腺體分布機(jī)制。共聚焦顯微拉曼光譜為不同環(huán)境下生存貽貝的足腺體分布特征研究提供技術(shù)方法，是一種潛在的研究開發(fā)適用于不同環(huán)境要求的新型高效人工聚合物探測技術(shù)。