甲狀腺素對動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響及其機(jī)制*

冉 卉， 尹 浩， 劉窗溪， 韓國強(qiáng)， 高方友， 諶鴻斌， 付 航， 徐曉鐘， 黎 濤， 馬 駿△

(1. 銅仁市人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 貴州 銅仁 554309； 2. 貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 貴州 貴陽 550002； 3. 清鎮(zhèn)市人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 貴州 貴陽 551400； 4. 畢節(jié)市中醫(yī)院神經(jīng)外科， 貴州 貴陽 551700； 5. 贛州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 貴州 貴陽 341000)

SAH的發(fā)病率在所有腦血管意外中僅次于腦梗死及高血壓腦出血，主要由動靜脈畸形破裂、動脈瘤破裂等疾病導(dǎo)致，其中動脈瘤破裂所致SAH占70%[1-2]。動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)患者預(yù)后較差，且患者發(fā)病的平均年齡多在50歲左右，是對其家庭沉重的打擊。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的核轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)低氧反應(yīng)的最主要的調(diào)節(jié)因子。HIF-1表達(dá)增高后可通過多種靶基因發(fā)揮后續(xù)多種生物學(xué)效應(yīng)，從而改善蛛網(wǎng)膜下腔出血預(yù)后。

aSAH患者即使經(jīng)過介入栓塞、開顱手術(shù)后神經(jīng)功能得以康復(fù)，但是甲狀腺激素水平紊亂仍可嚴(yán)重影響其認(rèn)知能力和生活質(zhì)量[3-4]。Ma J等[5-7]發(fā)現(xiàn)，部分動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后患者存在一定程度的甲狀腺激素紊亂和認(rèn)知能力障礙，通過補(bǔ)充甲狀腺素可改善患者預(yù)后。在腦缺血研究中發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有一定保護(hù)作用，甲狀腺素的補(bǔ)充可促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，是通過激活PI3K/Akt信號通路而實現(xiàn)的[8]。目前對于aSAH后補(bǔ)充甲狀腺素治療及其相關(guān)機(jī)制的研究尚鮮有文獻(xiàn)報道。為闡明aSAH后補(bǔ)充甲狀腺激素的作用及其對HIF-1α的影響機(jī)制故開展本研究，本研究利用頸內(nèi)動脈穿刺法建立SAH大鼠模型，探討T4甲狀腺素是否能夠?qū)用}瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠腦損傷起保護(hù)作用，及其對HIF-1α表達(dá)的影響及可能的作用途徑，為臨床上應(yīng)用T4干預(yù)動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血提供動物實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要儀器、試劑

72只SPF級健康雄性SD大鼠，8周齡，[重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2018-0003；實驗動物使用許可證號：SYXK(渝)2018-0003]，體重(300±20)g，。嚴(yán)格遵循動物倫理，本試驗經(jīng)院倫理委員會審批通過，審批號: 倫審(動物)2015-045號。T4 (美國sigma公司)、HIF-1α兔(美國immunoway公司)、p-Akt兔(美國immunoway公司)、MaxVision TM HRP-Polymeranti-Mouse/Rabbit IHC Kit 羊(武漢bioswamp公司)、TUNEL試劑盒(美國Roche公司)。

1.2 甲狀腺素溶液的配置

德國Sigma公司產(chǎn)的左甲狀腺素粉末100 mg，溶解在含0.4 mol/L NaOH的600 ml/L 的乙醇溶液，稀釋成1 g/L 的濃溶液，后用PBS緩沖劑稀釋100倍成0.01 g/L。

1.3 實驗分組

實驗動物隨機(jī)分為4組(n=18)：蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+甲狀腺素干預(yù)組(SAH+T4組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組(SAH+溶劑組)、假手術(shù)組。頸內(nèi)動脈穿刺法建立SAH模型，SAH+T4干預(yù)組及SAH+生理鹽水組：建模成功后即刻予大鼠腹腔注射3 μg/100 g T4及等體積溶劑,每隔24 h一次，連續(xù)3 d。假手術(shù)組在建立模型過程中尼龍線不刺破血管壁。建模前后均行以Loeffler 5分制評分法行神經(jīng)行為學(xué)評分。抓住大鼠背部時，能夠正常運(yùn)動并且在5 s內(nèi)翻身為5分，自主運(yùn)動減少但5 s內(nèi)仍能翻身為4分；翻身時間大于5 s為3分，不能翻身為2分，不能運(yùn)動為1分。

1.4 標(biāo)本采集

各組6只經(jīng)4%水合氯醛(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉后，以多聚甲醛心臟灌注法處死后迅速開顱取腦，將鼠腦放在4%多聚甲醛內(nèi)固定，4℃冰箱保存24 h，用于免疫組化及凋亡檢測；石蠟包埋切片行免疫組化染色檢測HIF-1α及p-Akt蛋白、6只用TUNEL法檢測大腦皮層凋亡情況，。各組6只大鼠4%水合氯醛(0.1 ml/1kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后迅速開顱取全腦，以干濕重法進(jìn)行腦水腫含量檢測。凋亡率=tunel陽性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞數(shù)×100%；腦含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。HIF-1α以細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)；p-Akt以胞漿內(nèi)或胞膜有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。每個標(biāo)本隨機(jī)選取5張片各取2個視野，顯微鏡下計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺素對大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

SAH組及SAH+T4組、SAH+溶劑組大鼠的腦組織腫脹明顯，腫脹程度肉眼不易區(qū)分，均在顱底及Willis環(huán)附近蛛網(wǎng)膜下腔可見暗紅色血凝塊，假手術(shù)組大鼠腦組織則未見明顯血凝塊，SAH+T4組蛛網(wǎng)膜下腔出血情況較SAH組及SAH+溶劑組減輕(圖1，見彩圖頁Ⅳ)。大鼠建模術(shù)后行顱腦CT平掃：SAH組、SAH+T4組及SAH+溶劑組大鼠顱腦CT平掃可見腦池內(nèi)高密度影，假手術(shù)組顱內(nèi)則未見明顯密度增高影，證實大鼠建模成功，SAH+T4組密度增高影也較SAH組及SAH+溶劑組減輕(圖2)。

Fig.1 Brain tissue after internal carotid artery puncture

Fig. 2 CT scan after internal carotid artery puncture

2.2 甲狀腺素對大鼠腦含水量與神經(jīng)行為學(xué)評分的影響

結(jié)果表明，SAH組、SAH+T4組腦含水量較假手術(shù)組明顯增多(P<0.05);SAH+溶劑組腦含水量與SAH組比較未見明顯差異(P>0.05)；SAH+T4組腦組織含水量較SAH組明顯減少(P<0.05)。神經(jīng)行為學(xué)評分以Loeffler的5分制評分法為標(biāo)準(zhǔn)，主要觀察大鼠自主活動的變化。術(shù)前各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分各為5分，未見神經(jīng)功能缺失；假手術(shù)組大鼠術(shù)后未見明顯神經(jīng)功能障礙，SAH組、SAH+T4組及SAH+溶劑組術(shù)后神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)輕則自主活動減少，重則不能運(yùn)動。建模后：SAH組較假手術(shù)組神經(jīng)行為學(xué)評分降低(P<0.05)，較SAH+溶劑組比較未見明顯差異(P>0.05)，SAH+T4組則較SAH組神經(jīng)行為學(xué)評分增高(P<0.05)，較假手術(shù)組經(jīng)行為學(xué)評分降低(P<0.05)。SAH組細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，SAH+T4組細(xì)胞凋亡率較SAH組明顯減少(P<0.05，表1)。

2.3 大鼠腦大腦皮層HIF-1α蛋白、p-Akt蛋白水平

免疫組化法檢測HIF-1α蛋白，陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，HIF-1α蛋白表達(dá)：假手術(shù)組可見少量HIF-1α蛋白表達(dá)，較SAH組比較明顯減少(P< 0.05)；SAH組及SAH+溶劑組可見大量HIF-1α蛋白表達(dá)，兩者之間未見明顯差異(P>0.05)；SAH+T4組HIF-1α蛋白表達(dá)較SAH組明顯增多(P<0.05)。免疫組化法檢測p-Akt蛋白，陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，p-Akt蛋白：假手術(shù)組可見少量p-Akt蛋白表達(dá)，較SAH組比較明顯減少(P<0.05)；SAH組及SAH+溶劑組可見大量p-Akt蛋白表達(dá)，兩者之間未見明顯差異(P>0.05)；SAH+T4組p-Akt蛋白表達(dá)較SAH組明顯增多(P<0.05，圖3，4,表1，圖3，4見彩圖頁Ⅳ)。

Fig.3 Expression of HIF-1αprotein（SP ×200）

Fig.4 Expression of p-Akt protein（SP ×200）

Tab. 1 brain water content, neuroethology assessment, apoptosis index,HIF-1α, p-Akt of rats n=6)

3 討論

動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后可出現(xiàn)甲狀腺素激素分泌減少現(xiàn)象，并且出現(xiàn)不同程度的記憶力減退，以及嗜睡等癥狀為主要表現(xiàn)的甲狀腺素紊亂癥狀[9]。文獻(xiàn)報道，補(bǔ)充T4治療可在一定程度上改善患者預(yù)后。HIF-1α作為重要的低氧反應(yīng)因子在很多組織器官的缺血、低氧反應(yīng)中起著重要作用。研究表明，慢性低氧小鼠睪丸組織HIF-1α的高表達(dá)可引起生精細(xì)胞凋亡增加[10]；心肌細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)可協(xié)同Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),在低氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[11]。在對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，新生大鼠缺氧缺血性腦損傷在使用T4治療可通過激活PI3K/Akt信號通路促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，而HIF-1α表達(dá)增加后可作用于靶基因發(fā)揮腦保護(hù)作用[12]。有關(guān)甲狀腺激素在出血性疾病中是否能通過上調(diào)HIF-1α產(chǎn)生后續(xù)生物學(xué)作用的研究甚少，對于出血性疾病蛛網(wǎng)膜下腔出血中大鼠使用甲狀腺素干預(yù)后腦組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的變化，以及其機(jī)制目前尚鮮有文獻(xiàn)報道。因此本實驗擬通過建立動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型，以甲狀腺素作為干預(yù)因素，檢測干預(yù)后大鼠腦組織內(nèi)的 HIF-1α蛋白、p-Akt蛋白、腦組織含水量、細(xì)胞凋亡等的變化情況，初步探討可能的機(jī)制。

本實驗中結(jié)果表明，SAH組腦含水量較假手術(shù)組明顯增多，SAH組較假手術(shù)組神經(jīng)行為學(xué)評分降低,SAH組可以見到大量凋亡細(xì)胞，其凋亡率較假手術(shù)組明顯增大,由此證明蛛網(wǎng)膜下腔出血可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)行為障礙、腦水腫加重、凋亡增大。

在aSAH后甲狀腺激素紊亂患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素替代治療能夠改善動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血慢性期甲狀腺功能低下患者的部分認(rèn)知能力，改善患者的預(yù)后[13]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，SAH+T4組腦含水量較SAH組明顯減少，SAH+T4組較SAH組神經(jīng)行為學(xué)評分增高，SAH+T4組凋亡率較SAH組明顯減小，證明使用T4治療可改善大鼠動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)行為學(xué)評分、減輕腦水腫、減少細(xì)胞凋亡。通過對大鼠動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后T4治療的研究得到了與臨床應(yīng)用的類似結(jié)果，從動物學(xué)實驗方面為T4治療改善aSAH的預(yù)后提供了依據(jù)。

為探討T4替代治療是否能通過促進(jìn)HIF-1α表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用及其機(jī)制，實驗中對腦組織蛋白HIF-1α表達(dá)水平，p-Akt蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體，其活性主要由HIF-1α調(diào)控。HIF-1α能夠調(diào)節(jié)數(shù)以百計的靶基因的表達(dá)，與其結(jié)合后由HIF-1α參與轉(zhuǎn)錄，可起到促血管的新生、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)節(jié)等作用[14]。據(jù)文獻(xiàn)報道，HIF-1α可通過上調(diào)Bcl-2而抑制細(xì)胞凋亡[15]，通過抑制凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。PI3K/Akt信號通路是重要的細(xì)胞代謝通路，PI3K通過絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt激活成為PIP3。Akt與PIP3結(jié)合并自胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜，最終Akt被激活為p-Akt，p-Akt是PI3K/Akt信號通路的重要標(biāo)志[16]。研究表明，缺氧時PI3K/Akt信號通路被激活，p-Akt表達(dá)增加，HIF-1α表達(dá)也相應(yīng)增加[17]，提示了p-Akt作為標(biāo)志物與HIF-1α表達(dá)相關(guān)，p-Akt可上調(diào)HIF-1α表達(dá)水平。本實驗中可見，T4干預(yù)aSAH后大鼠腦細(xì)胞HIF-1α蛋白及p-Akt蛋白較SAH組明顯增多；SAH組及SAH+溶劑組雖可見p-Akt蛋白表達(dá)，但兩者之間未見明顯差異。表明補(bǔ)充T4使PI3K/Akt信號通路活化，p-Akt蛋白表達(dá)增加，從而上調(diào)腦組織蛋白HIF-1α表達(dá)水平。T4干預(yù)可能通過PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)，上調(diào)腦組織蛋白HIF-1α表達(dá)水平發(fā)揮后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)，從而減輕細(xì)胞凋亡、腦水腫，改善神經(jīng)行為障礙，起到腦保護(hù)作用。

目前對于aSAH后補(bǔ)充甲狀腺素對HIF-1α表達(dá)的影響，以及其激活機(jī)制的研究尚鮮有文獻(xiàn)報道，本實驗研究對改善aSAH預(yù)后的治療提供了新的思路。然而T4替代治療以改善aSAH患者預(yù)后的相關(guān)機(jī)制仍不十分清楚，因此進(jìn)一步開展相關(guān)分子機(jī)制的研究，將對未來改善aSAH患者的預(yù)后提供新的治療思路和治療靶點。