不同訓練負荷對大鼠骨骼肌超微結構及線粒體功能的影響

任鶴菲，于昕儀，陳立軍，張馨予，雷 靜，陳 健，于利人

不同訓練負荷下，骨骼肌的結構和功能會發(fā)生明顯的變化，肌原纖維和三聯(lián)體結構出現(xiàn)不同程度的改變，影響收縮和能量供應系統(tǒng)[1]。骨骼肌供能主要依靠線粒體呼吸鏈，線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的表達水平與線粒體呼吸及能量代謝功能密切相關[2]。骨骼肌供能的同時產(chǎn)生超氧化產(chǎn)物，線粒體超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)可及時清除超氧化產(chǎn)物并修復細胞損害[3, 4]。如何科學訓練才能保護骨骼肌結構，最大限度發(fā)揮線粒體功能需要進一步探討。本實驗檢測4周訓練后大鼠骨骼肌超微結構及線粒體功能的變化，探討訓練對骨骼肌結構和能量代謝的影響及保護機制，為科學訓練提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠24只，鼠齡2個月，體質量(214±11) g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證號SCXK2002-0001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在21～25 ℃，濕度范圍40%～60%，照明按自然晝夜供給，進食和飲水自由。本實驗中對動物的處理方法符合《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 訓練模型的建立 實驗大鼠先進行適應性飼養(yǎng)1周，然后隨機分為正常對照組、有氧訓練組和無氧訓練組，每組8只，組間動物體質量比較，差異無統(tǒng)計學意義。進行3 d適應性跑臺訓練(坡度為0°，速度8.2 m/min，10 min/d)后，實驗參照Bedford等[5]的方法建立動物模型。參考Shepherd等[6, 7]的方法確定訓練強度和分組：訓練強度在64%～76%最大攝氧量(maximal oxygen uptake, VO2max)確定為有氧訓練組，訓練強度>80% VO2max確定為無氧訓練組。有氧訓練組采用遞增負荷訓練，以15 m/min為起始速度，速度逐漸增快，第5分鐘增至18 m/min，第10分鐘增至20 m/min并保持恒定不變，同時增加坡度至5°，計時60 min。無氧訓練組以50 m/min為起始速度，訓練6 min后休息5 min，此過程重復3次。兩組在訓練過程中始終保證訓練強度恒定。訓練4周，每周保證在同一時間段開展訓練，時間每周不少于6 d。對照組大鼠于籠內(nèi)正常生活，不做任何額外處理。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織勻漿的制備 大鼠訓練后立刻處死，迅速取其腓腸肌，用介質Ⅰ(0.12 M KCl，20 mM Hepes，5 mM MgCl2，1 mM EDTA，5 mg defatted BSA/ml pH 7.4)沖洗，剔除脂肪及結締組織并剪碎，加10 ml介質Ⅰ。電動勻漿器勻漿，1200 r/min，上下3次。600 r/min離心10 min。棄沉淀，上清液于17 000 r/min離心10 min。沉淀用介質Ⅰ懸浮，7000 r/min離心10 min。沉淀懸浮在20 ml介質Ⅱ(0.3M Sucrose，2.0mM Hepes，0.1 mM EDTA，2 mg defatted BSA/ml pH 7.4)中，3500 r/min離心10 min。沉淀懸浮于0.3 ml介質Ⅱ中。以上操作均在0～4 ℃下進行。線粒體蛋白含量用考馬斯亮藍法測定，采用可見-紫外分光光度計280 nm下校正的BSA作標準。

1.3.2 線粒體呼吸鏈酶復合體活性的測定 參照上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司試劑盒說明書測定。分光光度法分別在340 nm(酶復合體Ⅰ)、600 nm(酶復合體Ⅱ)和550 nm(酶復合體Ⅲ和Ⅳ)處測定，以牛血清白蛋白為標準，應用Folin-酚法測定各組線粒體蛋白濃度。計算公式：復合體酶比活性=[(△A樣品-△A背景)×樣品稀釋倍數(shù)]/[0.1(樣品質量，mg)×吸光系數(shù)×1(反應時間，min)]/線粒體蛋白濃度(mg/ml)。

1.3.3 總超氧化物歧化酶、錳超氧化物歧化酶和銅鋅超氧化物歧化酶活性的測定 采用比色法測定總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, Mn-SOD)和銅鋅超氧化物歧化酶(copper zincsuperoxide dismutase, CuZn-SOD)活性，試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3.4 透射電鏡觀察骨骼肌線粒體的超微結構 大鼠處死后迅速取腓腸肌，取1 mm2的骨骼肌組織用2.5%戊二醛孵育過夜。1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水后氧化丙烯浸透，環(huán)氧樹脂包埋，包埋好的樣品制成超薄切片，醋酸鉛鈾雙重染色，進行電鏡樣品制備。Philips EM400ST透射電鏡觀察骨骼肌線粒體超微結構，采集圖像。

2 結 果

2.1 不同訓練條件下骨骼肌形態(tài)及線粒體分布 在正常對照組中，肌漿內(nèi)含大量與細胞長軸平行排列的肌原纖維，相鄰肌原纖維間可見線粒體，每條肌原纖維上有明暗相間的帶(圖1A)。肌原纖維由大量平行排列的粗、細肌絲組成，可見粗、細肌絲橫斷面；肌膜下的肌漿中可見電子密度較高的線粒體(圖1B)。在有氧訓練組中，與正常對照組相比，肌原纖維排列更加規(guī)則，肌原纖維增粗，肌漿網(wǎng)、橫小管發(fā)達，構成明顯的三聯(lián)體結構，線粒體數(shù)量增多(圖1C、D)。在無氧訓練組中，與正常對照組相比，肌漿中，肌原纖維之間可見大量發(fā)生腫脹的線粒體，電子密度較正常染色體低；肌原纖維結構發(fā)生變化，明帶與暗帶界線不清，明帶中Z線不明顯，暗帶中H帶與M線不明顯，提示粗細肌絲排列紊亂(圖1E、F)。

圖1 不同訓練負荷下大鼠骨骼肌線粒體超微結構透射電鏡特點

A.正常對照組骨骼肌縱切面，Bar=0.5 μm；B.正常對照組骨骼肌橫切面，Bar=0.5 μm；C.有氧訓練組骨骼肌縱切面，Bar=1 μm；D.有氧訓練組骨骼肌縱切面，Bar=0.5 μm；E.無氧訓練組為骨骼肌縱切面，Bar=1 μm；F.無氧訓練組為骨骼肌縱切面，Bar=0.5 μm

2.2 線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性變化 訓練4周后，有氧訓練組大鼠線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性水平均高于正常對照組和無氧訓練組，無氧訓練組大鼠線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性水平較正常對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 T-SOD，Mn-SOD和CuZn-SOD活性測定 訓練4周后，有氧訓練組大鼠線粒體T-SOD、CuZn-SOD和Mn-SOD水平高于正常對照組和無氧訓練組，無氧訓練組大鼠線粒體T-SOD、Mn-SOD水平較正常對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。CuZn-SOD活性與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

表1 大鼠線粒體呼吸鏈酶復合體活性

酶復合體正常對照組有氧訓練組無氧訓練組Ⅰ5.99±0.126.81±0.39①5.43±0.10①②Ⅱ2.34±0.162.69±0.09①1.92±0.08①②Ⅲ4.29±0.054.66±0.08①4.13±0.24①②Ⅳ6.82±0.119.25±0.21①6.19±0.19①②

注：與正常對照組相比，①P<0.05；與有氧訓練組相比，②P<0.05

表2 T-SOD, Mn-SOD和CuZn-SOD活性

酶正常對照組有氧訓練組無氧訓練組T-SOD22.92±1.2139.41±2.91①16.96±1.29①②CuZn-SOD3.73±1.246.71±0.77①2.68±0.61②Mn-SOD19.19±0.9732.7±3.20①14.28±1.12①②

注：與正常對照組相比，①P<0.05；與有氧訓練組相比，②P<0.05

3 討 論

不同訓練負荷可以誘發(fā)骨骼肌發(fā)生相應的適應性改變，無氧訓練超過機體承受能力會導致骨骼肌產(chǎn)生暫時性的生理機能減退現(xiàn)象，即會發(fā)生訓練疲勞。本實驗中，電鏡下觀察骨骼肌超微結構呈現(xiàn)不同程度的變化，有氧訓練組大鼠骨骼肌肌原纖維排列更加規(guī)則，三聯(lián)體結構明顯。無氧訓練組大鼠骨骼肌肌漿中，電子密度較正常染色體低，粗細肌絲排列紊亂，超微電鏡結果顯示，有氧訓練可加強骨骼肌收縮能力，提高應激狀態(tài)下骨骼肌能量供應，無氧訓練則導致骨骼肌損傷。

不同訓練負荷可誘導運動性疲勞，線粒體結構和功能的失調(diào)是運動性疲勞發(fā)生的重要潛在因素。高強度氧化應激可使線粒體通透轉運孔道(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)更易于開放，線粒體膜電位的缺失及mPTP的開放進一步誘導線粒體腫脹，進而影響骨骼肌的結構。線粒體反向電子傳遞理論指出，在應激缺氧狀態(tài)下，大量電子在復合體Ⅱ處聚集無法向下傳遞，而當無氧訓練終止時，大量氧氣致使游離電子涌向復合體Ⅰ，導致活性氧產(chǎn)生，誘發(fā)機體損傷[8]。本實驗結果顯示，4周有氧訓練后大鼠骨骼肌線粒體數(shù)量增多，線粒體呼吸鏈酶復合體活性顯著增強，這可能與持續(xù)性的有氧訓練使得骨骼肌增加對能源物質的需求有關。無氧訓練組線粒體呼吸鏈酶復合體活性低于正常對照組和有氧訓練組，肌原纖維之間可見大量發(fā)生腫脹的線粒體，這可能是因為無氧訓練損傷了線粒體呼吸鏈，使得電子傳遞發(fā)生障礙。

不同訓練負荷下機體可產(chǎn)生如氧自由基等訓練副產(chǎn)物，自由基的細胞毒作用可引起膜脂質過氧化，導致細胞損傷[9]。自由基如不能得到及時有效的清除將導致機體氧化與抗氧化功能平衡的失調(diào), 破壞組織細胞，影響生物體行為訓練能力及機體正常的氧化代謝功能[10, 11]。正常機體內(nèi)存在以SOD為代表的自由基清除體系，其活力可以反映機體清除自由基的能力[12]。SOD以錳或銅和鋅等作為輔因子，兩者均是自由基的清除酶，是維持細胞正常代謝和生長必不可少的抗氧化物質[13]。過氧化氫是一類自由基，無氧訓練可引起小鼠腓腸肌線粒體過氧化氫含量明顯增加[14]。Mn-SOD基因的啟動子通過與過氧化氫相結合，使得Mn-SOD基因轉錄水平顯著提高[15]，有利于提高自由基的清除能力。本實驗結果顯示，有氧訓練組T-SOD、Mn-SOD和CuZn-SOD水平均高于正常對照組和無氧訓練組。說明有氧訓練提高能量代謝能力顯著高于無氧訓練，能通過進一步提高SOD的表達水平，增加超氧陰離子自由基的清除，使得抗氧化能力得到了增強。高強度的無氧訓練由于線粒體呼吸鏈電子傳遞發(fā)生障礙，還原型輔酶Ⅰ得不到氧化而堆積，導致氧自由基生成增加，破壞了機體氧化與抗氧化功能的平衡，進而影響線粒體的呼吸及氧化代謝功能。此外，實驗發(fā)現(xiàn)，無氧訓練并不能顯著降低CuZn-SOD水平，原因可能是因為無氧運動主要影響線粒體，而CuZn-SOD主要存在于胞漿中，受影響變化不明顯。

綜上所述，不同訓練負荷對骨骼肌超微結構和線粒體功能影響不同，其機制復雜，對其進行深入的研究具有重要意義。有氧訓練可以改善骨骼肌的能量代謝及抗氧化功能，增加細胞內(nèi)線粒體數(shù)量及相關代謝酶活性，從而改善骨骼肌形態(tài)，提高機體抗疲勞能力，這與線粒體能量代謝及SOD等抗氧化功能密切相關。但對不同訓練負荷引起骨骼肌結構和功能改變的機制，仍有待進一步研究。