青海省曲麻萊牦牛的母系遺傳多樣性及遺傳背景探究

李廣禎，馬志杰，陳生梅，楊秋蕾，竇全林，若巴仁青

（1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧 810016；2.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧 810016；3.青海省玉樹黃河源良種繁育有限公司，青海曲麻萊 815500）

牦牛是青藏高原上的特有物種，以食草為生，生性強悍，具有極強的適應(yīng)性，可在高海拔、低溫、缺氧的惡劣環(huán)境中生存自如并世代繁衍。目前，全世界擁有牦牛1 500多萬頭，其中95%分布在青藏高原及其毗鄰地區(qū)［1］。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定、母系遺傳、進化速度快等特點。目前，mtDNA中的D-loop區(qū)被證明是很好的分子遺傳標記［2］，該標記已被用于人［3］、豬［4］和家鼠［5］等物種的起源、進化歷史、遺傳資源評估等研究。在牦牛mtDNA研究中，馬志杰［6］對牦牛mtDNA D-loop區(qū)的研究概況進了歸納總結(jié)。然而，目前尚未見對曲麻萊牦牛的母系遺傳多樣性及遺傳背景的研究報道。

曲麻萊縣位于青海省玉樹藏族自治州的東北部，地處長江、黃河源頭，是一個純牧業(yè)縣，有“江河源頭第一縣”的美稱，牦牛遺傳資源豐富。在青海牦牛的父系遺傳研究中，Ma等［7］對9個青海牦牛（唐古拉山、天峻、曲麻萊、祁連、郭勒木德、崗龍、雪多、環(huán)湖和大通牦牛）的Y染色體單倍型多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，H1，H2和H6單倍型為所有牦牛品種/群體所共享，H3與H7單倍型僅存在于大通牦牛品種中，H4單倍型存在于曲麻萊、祁連、天峻和崗龍牦牛群體中，而H5單倍型僅存在于曲麻萊牦牛群體中，表明曲麻萊牦牛含有特殊的父系遺傳信息。鑒于此，為深入了解曲麻萊牦牛的母系遺傳特征，本研究對曲麻萊牦牛mtDNA D-loop區(qū)進行測定，在此基礎(chǔ)上分析曲麻萊牦牛的母系遺傳多樣性及遺傳背景，為曲麻萊牦牛資源的保護提供理論依據(jù)，為其合理的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA提取

采用頸動脈采血法，在青海省曲麻萊縣玉樹黃河源良種繁育有限公司所屬的牦牛群中隨機采集34頭牦牛頸靜脈血樣在實驗室用低溫冰箱（-20℃）保存。將牦牛血樣使用血液DNA提取試劑盒（艾德萊生物科技有限公司，北京）提取DNA，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計合成和PCR擴增

使用Ma等［8］在野牦牛研究中運用的引物擴增曲麻萊牦牛mtDNA D-loop區(qū)的序列，其上游引物（PF）為 5′-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3′，下游引物（PR）為5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′，引物委托上海生工公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25μL）為2×PrimeSTAR Max Premix（上海寶生物公司）10.5μL，超純水12.5μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5μL，樣品DNA為1μL，共計25μL。其中PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性4 min；95℃變性1 min，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送到上海生物工程公司進行測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)的處理與分析

將測序數(shù)據(jù)使用BioEdit 7.2.5軟件進行分析比對，并對測序的數(shù)據(jù)進行校對，確保數(shù)據(jù)的準確性。采用DnaSP 5.10.01軟件確定曲麻萊牦牛的多態(tài)位點、單倍型數(shù)量、單倍型多樣度和核苷酸多樣度，后采用MEGA 5.05軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，揭示曲麻萊牦牛的母系遺傳背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲麻萊牦牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性分析

通過測定34頭曲麻萊牦牛的D-loop序列，得到有效片段長度為618 bp，排除1處插入或缺失位點后，共發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點36處（圖1），占所分析序列長度的5.83%。在36處多態(tài)位點中有4處為單一多態(tài)位點，包括85、144、239、382位點，約占總序列長度的0.65%；其余的32處為簡約多態(tài)位點，分別為35、42、60、67、98、113、119、146、173、174、175、181、182、192、201、218、221、234、235、236、240、242、244、251、254、259、281、316、317、323、426 和464 位點，約占總序列長度的5.18%。

研究結(jié)果表明:34頭曲麻萊牦牛D-loop區(qū)序列分析共確定了20種單倍型，其中單倍型H1由6個個體共享，為優(yōu)勢單倍型。單倍體H7、H9和H12均由3個個體共享，而H3、H4和H17均由2個個體共享，剩余的所有單倍型均有1個個體所共享。單倍型多樣度為0.952±0.020，核苷酸多樣度為0.018±0.009，序列平均核苷酸差異K值為10.10。

2.2 曲麻萊牦牛系統(tǒng)發(fā)育分析

從Genbank中找出普通牛（AB085924）作為外群，對曲麻萊牦牛D-loop序列20種單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示:20 種單倍型聚為 2 個支系，其中 H6、H13、H7、H2、H9、H11、H18、H3、H10、H8、H1、H15 和 H17 為一支（即支系Ⅰ），H5、H12、H16、H4 和 H14 為另一支（即支系Ⅱ）。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物進化與分化的基礎(chǔ)，遺傳多樣性研究可為揭示物種的進化歷史、遷徙和起源等研究提供洞察，同時可為其品種選育與改良奠定基礎(chǔ)。在對野牦牛mtDNA D-loop區(qū)的研究中，Ma等［8］對8頭野牦牛mtDNA D-loop區(qū)全序列進行測定分析，得出其單倍型多樣度為0.962±0.026。Guo等［9］對13頭野牦牛進行了母系遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示其單倍型多樣度為0.960±0.040。Wang等［10］對47頭野牦牛進行了D-loop區(qū)進行測序分析，得出其單倍型多樣度為0.967±0.013?？梢钥闯觯瓣笈５膯伪缎投鄻佣却笮≈禐?.920～1.000。而在我國家牦牛的mtDNA D-loop區(qū)母系遺傳研究中，賴松家等［11］基于mtDNA D-loop區(qū)的結(jié)果對5個群體（九龍、麥洼、天祝、西藏牦牛和及犏牛）進行了分析，研究結(jié)果表明這5個群體的平均單倍型多樣度為0.970±0.018。郭松長等［12］對我國10個家牦牛群體（環(huán)湖、巴州、斯布、大通、嘉黎、九龍、青海高原、天祝牦牛、帕里和麥洼牦牛）的D-loop區(qū)作了測序分析，其平均單倍型多樣度為0.925±0.010。李瑞哲等［13］對34頭雪多牦牛的mtDNA D-loop區(qū)進行了研究，其單倍型多樣度為0.900±0.043。涂世英等［14］對15頭中甸牦牛D-loop區(qū)進行了測序分析，表明其單倍型多樣度為0.983。Yue等［15］對209頭天祝白牦牛進行了mtDNA D-loop區(qū)全序列測定，得出其單倍型多樣度為0.946±0.007。宋喬喬等［16］對我國8個西藏牦牛類群共328頭牦牛進行了mtDNA D-loop區(qū)序列測定與分析，其單倍型多樣度為0.884。可以看出，我國家牦牛的單倍型多樣度為0.884～0.983。在本研究中，曲麻萊牦牛的單倍型多樣度為0.952±0.021，與上述基于D-loop區(qū)對野牦牛及其他家牦牛品種（群體）計算的單倍型多樣度大小相比，其值也較高，這表明曲麻萊牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性。究其原因，可能與曲麻萊牦牛生活在與野牦牛聚居區(qū)相毗鄰的高原牧區(qū)有關(guān)。通常，在曲麻萊牦牛的繁殖季節(jié)，經(jīng)常有毗鄰地的野牦?；烊肫淙褐薪慌?，這種家、野牦牛間的雜交和遺傳漸滲可一定程度上提高曲麻萊牦牛的遺傳多樣性。

在對曲麻萊牦牛的單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析中，發(fā)現(xiàn)20種單倍型可以聚為2個支系，說明其具有2個母系起源，這與賴松家等［11］、郭松長等［12］、李瑞哲等［13］研究者對其他牦牛品種/群體的母系遺傳研究結(jié)果一致。