高效毛細管電泳法同時分離測定化妝品中7種防腐劑

張 帥，高立娣*，梁 輝，秦世麗，蔣春紅，段圣村，徐 蕾，林肖同，王媛媛

(1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.生工生物工程(上海)股份有限公司，上海 201611；3.上海百雀羚日用化學(xué)有限公司，上海 200040)

眾所周知，微生物無處不在，在化妝品的生產(chǎn)和使用過程中亦不可避免的會有微生物侵入，使化妝品腐敗變質(zhì)，保質(zhì)期縮短，有效成分降低，甚至威脅使用者的身體健康，所以需要在化妝品中加入一類能防止由微生物引起這一系列不良影響的添加劑——防腐劑[1]。市面上常用的化妝品防腐劑多為化學(xué)合成品，其產(chǎn)量大，生產(chǎn)成本低，使用方便簡單。但當其使用量大，使用不當或者長時間使用時，會產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，對身體產(chǎn)生一定的危害，嚴重者甚至可能導(dǎo)致癌變[2]。我國已對其使用量制定了嚴格的限制標準[3-4]，但還未出臺相應(yīng)的國家標準。因此，建立一種快速、高效、準確的分離測定化妝品中防腐劑的方法非常必要。目前報道的化妝品中防腐劑的檢測方法有高效液相色譜法[5-6]、氣相色譜法[7-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-11]和毛細管電泳法[12]等。相對于傳統(tǒng)的高效液相色譜法和氣相色譜法，毛細管電泳法有效改善了高效液相色譜法的色譜柱價格昂貴，氣相色譜法分析周期長、樣品前處理繁瑣等缺陷[13-14]，具有快速、簡單、靈敏等優(yōu)點。但目前為止，該方法用于化妝品中防腐劑的檢測鮮見報道。

本文以磺丁基-β-環(huán)糊精為添加劑，磷酸鹽為緩沖溶液，建立了毛細管電泳法同時分離檢測7種防腐劑(對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯苯甘醚、辛酰羥戊酸、脫氫乙酸鈉)的方法。優(yōu)化了添加劑的種類與濃度、磷酸鹽緩沖液pH值及分離電壓，并對市售化妝品中的防腐劑含量進行了分離檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細管電泳儀(美國Agilent公司)，GWA-UN5系列超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)。對羥基苯甲酸甲酯(99.5%)、對羥基苯甲酸乙酯(99.5%)、對羥基苯甲酸丙酯(99.5%)、對羥基苯甲酸丁酯(99.5%)購自吉林化工有限公司；氯苯甘醚(98%)、辛酰羥戊酸(99.8%)購自天津凱萊試劑廠；脫氫乙酸鈉(99.6%)、磺丁基-β-環(huán)糊精(98%)購自北京華威瑞科化工有限公司?；瘖y品(護手霜)購自超市。所有溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后使用，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

石英毛細管(內(nèi)徑50 μm，總長38 cm,有效長度32 cm，美國Agilent公司)，采用含10 mmol/L磺丁基-β-環(huán)糊精的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉混合體系(pH 8.0)為緩沖液，分離電壓為20 kV，柱溫15 ℃，檢測波長280 nm，壓力進樣5 kPa×3 s。首次進樣前依次用1.0 mol/L NaOH、水及緩沖溶液沖洗毛細管3、1、3 min。

分別稱取0.010 g對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯苯甘醚、辛酰羥戊酸、脫氫乙酸鈉用甲醇溶于50 mL容量瓶，得到200 mg/L的標準儲備液。再將標準儲備液逐級稀釋得到100、50、30、10、5 mg/L的標準使用液。

1.3 樣品處理

分別取0.100 g護手霜和卸妝膏于燒杯中，各加入50 mL甲醇，取5 mL保濕水于燒杯中，加入50 mL甲醇，超聲20 min后，在5 200 r/min下離心5 min后，進樣檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 添加劑種類與濃度的優(yōu)化環(huán)糊精可與客體分子通過氫鍵、疏水鍵等形成主客體包合體系。樣品中的各組分通過與β-環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物形成穩(wěn)定常數(shù)不同的包合物,導(dǎo)致其在毛細管內(nèi)遷移時間不同,從而達到不同的分離效果。實驗以100 mg/L的標準溶液為分析對象，考察了β-環(huán)糊精及磺丁基-β-環(huán)糊精作為添加劑對分離的影響。結(jié)果表明，在所考察條件下，改變β-環(huán)糊精濃度未能明顯改善分離效果。采用分離電壓15 kV，pH 8.0，進一步考察了不同濃度磺丁基-β-環(huán)糊精對分離效果的影響。結(jié)果顯示，磺丁基-β-環(huán)糊精可改善7種防腐劑的分離效果，但當磺丁基-β-環(huán)糊精濃度分別為5 mmol/L 和15 mmol/L時，脫氫乙酸鈉和對羥基苯甲酸甲酯無法完全分離，當其濃度為10 mmol/L時，7種待測組分在8 min內(nèi)達到基線分離(見圖1)。因此實驗選擇10 mmol/L的磺丁基-β-環(huán)糊精作為添加劑分離7種防腐劑。

圖1 磺丁基-β-環(huán)糊精濃度對7種防腐劑分離效果的影響

2.1.2 磷酸鹽緩沖液pH值的選擇運行緩沖液的pH值會直接影響毛細管的Zeta電位，進而影響電滲流，同時緩沖液的pH值也決定樣品中各組分的帶電情況，從而影響其遷移時間和分離效果。實驗考察了pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0時,7種防腐劑的分離效果(表1)。結(jié)果顯示，隨著緩沖液pH值的增大，遷移時間逐漸縮短，組分間的分離度先增大后減小。當pH=6.0、7.0時，脫氫乙酸鈉和對羥基苯甲酸甲酯未達到基線分離，分離度Rs分別為0.85和0.92；當pH 8.0時，各組分的分離度增大，7種防腐劑均達到基線分離(Rs=1.69～2.40)；pH 9.0時，雖然7種組分也能分開，遷移時間更短，但分離度降低(Rs=1.60～1.92)。因此，綜合考慮，后續(xù)實驗選擇緩沖溶液的最佳pH值為8.0。

表1 磷酸鹽緩沖液pH值對7種防腐劑分離的影響

*the alphabet(a-g) denoted was the same as that in Fig.1

圖2 分離電壓對7種防腐劑分離的影響

2.1.3 分離電壓對分離的影響分離電壓影響遷移時間和分離度的大小。實驗考察了7種防腐劑在分離電壓分別為15、20、25 kV條件下的分離情況(見圖2)。結(jié)果顯示，隨著分離電壓的增加，各組分的遷移時間逐漸縮短，但分離度有所下降。當電壓為15 kV和20 kV時，7種防腐劑均基線分離(Rs=1.63～2.40)，但20 kV時7種防腐劑的遷移時間較短(5 min)，分離效率更高。當電壓達到25 kV時，辛酰羥戊酸和氯苯甘醚的分離度降低(Rs=1.42)，無法完全分離，且基線變差。因此，實驗選擇20 kV為最佳分離電壓。

2.2 標準曲線、檢出限與重現(xiàn)性

在優(yōu)化條件下，取配制的7種防腐劑標準溶液系列濃度(5、10、30、50、100、200 mg/L)依次進樣分離檢測，以峰面積(y)對各組分標準溶液的質(zhì)量濃度(x,mg/L)繪制標準曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。選取5 mg/L的標準溶液，在最佳電泳條件下重復(fù)檢測7次，計算所得峰面積的標準偏差(SD)，以及遷移時間與峰面積的相對標準偏差(RSD)，根據(jù)MDL(方法檢出限)=SD*t(n-1)(n=7時的自由度)獲得方法檢出限。結(jié)果表明：7種防腐劑在5～200 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.990 7～0.998 9，檢出限為1.23～4.30 mg/L；該方法的重現(xiàn)性良好，遷移時間和峰面積的RSD分別不大于1.3%和6.0%(見表2)。

表2 7種防腐劑的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限及其遷移時間與峰面積的相對標準偏差

2.3 加標回收率與相對標準偏差

某市售護手霜樣品、卸妝膏樣品分別稱取兩份0.100 g，保濕水樣品量取5 mL，各溶于50 mL甲醇中，分別加入對應(yīng)含量的標準品，平行測定5次，計算加標回收率(見表3)。結(jié)果表明，各組分的平均回收率為95.4%～103%，RSD不大于4.8%。說明本方法準確可靠，可以用于化妝品中該7種防腐劑的檢測。

表3 7種防腐劑的加標回收率與相對標準偏差(n=5)

*no detected

2.4 實際樣品的分析

對市售的其它某品牌護手霜、卸妝膏、保濕水中所含防腐劑進行分離檢測，按照“1.2”將樣品進行簡單預(yù)處理后，在所建立的優(yōu)化條件下對各樣品進行檢測，結(jié)果見圖3。其中護手霜中檢出3個峰，分別為對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、未知組分峰(圖3A)。卸妝膏中共檢出4個峰，分別為氯苯甘醚、脫氫乙酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、未知組分峰(圖3B)。保濕水中檢出2個峰，分別為辛酰羥戊酸、未知組分峰(圖3C)。經(jīng)計算，該護手霜中對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯的含量分別為0.39%和0.23%；該卸妝膏中，氯苯甘醚的含量為0.03%，脫氫乙酸鈉的含量為0.11%，對羥基苯甲酸甲酯的含量為0.19%；該保濕水中的辛酰羥戊酸的含量為0.02%。對羥基苯甲酸甲酯及脫氫乙酸鈉含量符合我國衛(wèi)生部《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》對這些防腐劑的限量要求，即單一酯的最大允許用量為0.4%，混合酯為0.8%，脫氫乙酸鈉為0.6%。

2.5 與其他方法的比較

將本方法與已有報道的檢測防腐劑的方法進行比較。結(jié)果顯示，毛細管電泳法分離化妝品中防腐劑，可在10 min內(nèi)檢測分離氫醌、苯酚等4種防腐劑，回收率為93.2%～110%[12]；傳統(tǒng)的高效液相色譜法分離化妝品中防腐劑，其樣品預(yù)處理方法需經(jīng)過一定比例的甲醇和水溶解、萃取、超聲、離心等操作，分離時間長(40 min)，且部分組分間的分離度較低，定量困難，柱效較低[15-16]。而本方法可在5 min內(nèi)同時分離檢測7種化妝品中的常用防腐劑，回收率為95.4%～103%，回收率范圍更準確，對樣品預(yù)處理僅需甲醇溶解、超聲、離心即可，樣品預(yù)處理方法更簡便，分離時間更短，分離效率更高，分離度更大，定量準確且進樣量少。

圖3 實際樣品的測定結(jié)果

3 結(jié) 論

本文建立了一種同時分離檢測化妝品中7種防腐劑的毛細管電泳方法。在20 mmol/L磷酸鹽-10 mmol/L磺丁基-β-環(huán)糊精(pH 8.0)為緩沖溶液，分離電壓20 kV的優(yōu)化條件下，7種防腐劑在5 min內(nèi)達到基線分離。研究結(jié)果表明，該方法簡單快速，準確度和靈敏度高，重現(xiàn)性好，可為化妝品中防腐劑的分離分析提供參考，同時也可為制訂化妝品中防腐劑檢測的國家標準提供數(shù)據(jù)。