二維薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼散射聯(lián)用技術(shù)用于飲料及水果中糖精鈉的快速分析

康 燕，孫 琳，吳 婷，杜一平

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 分析測(cè)試中心，上海 200237)

表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface enhancement Raman scattering,SERS)是由拉曼光譜衍生出來(lái)的一種新型的高靈敏光譜技術(shù)，是在粗糙化的貴金屬(如納米金、銀等)襯底上產(chǎn)生的、通過(guò)局域表面等離子共振而放大的拉曼信號(hào)[1-4]。通過(guò)這種技術(shù)，能將常規(guī)的拉曼信號(hào)增強(qiáng)十萬(wàn)到百萬(wàn)倍，極大地提高拉曼光譜的靈敏度，使得拉曼光譜能夠用于痕量化合物分析。近年來(lái)，人們開(kāi)始將SERS技術(shù)與各種技術(shù)聯(lián)用，充分利用SERS的優(yōu)點(diǎn)并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，如將SERS與原子力顯微鏡[5]、微流控技術(shù)[6]等聯(lián)用。但是，由于光譜技術(shù)不具備分離功能，無(wú)法對(duì)混合體系的譜峰進(jìn)行歸屬，從而使得SERS技術(shù)在復(fù)雜體系分析中受到限制。

薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)是一種能夠?qū)旌衔镞M(jìn)行快速分離的色譜技術(shù)，因具有簡(jiǎn)單、價(jià)廉、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[7-9]。TLC方法作為經(jīng)典的分離分析方法，具有很多優(yōu)點(diǎn)，但將其用于定性鑒別時(shí)靈敏度低，分析能力差，結(jié)果穩(wěn)定性欠佳。將TLC和SERS聯(lián)用，充分結(jié)合了TLC技術(shù)經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的優(yōu)點(diǎn)和SERS靈敏度高、指紋信息豐富的特點(diǎn)。目前，TLC-SERS已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境、考古、食品安全等領(lǐng)域。朱青霞等[10]用TLC-SERS技術(shù)對(duì)降糖類中成藥中非法添加的4種化學(xué)藥品進(jìn)行了檢測(cè)；呂迪亞等用此方法對(duì)減肥類中成藥中摻假的麻黃堿及其類似物進(jìn)行了檢測(cè)[11]。傳統(tǒng)中草藥鉤藤中的活性成分異鉤藤堿也可經(jīng)薄層色譜分離后利用SERS技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)[12]。TLC-SERS技術(shù)對(duì)藥物的現(xiàn)場(chǎng)快速打假有重大意義，不僅有利于維護(hù)藥品市場(chǎng)秩序，也有利于保障人民群眾用藥安全。除了在藥物領(lǐng)域的應(yīng)用外，TLC-SERS也被應(yīng)用于環(huán)境領(lǐng)域，渠陸陸等[13]采用TLC-SERS技術(shù)對(duì)河水中10多種芳香族污染物進(jìn)行了定性和半定量分析。該技術(shù)也同樣被成功應(yīng)用于對(duì)古油畫(huà)上的有機(jī)染料成分進(jìn)行分離和檢測(cè)[14]。Tan等[15]將該聯(lián)用技術(shù)用于海產(chǎn)品中組織胺的定量分析。在前期工作中，本課題組將TLC-SERS技術(shù)成功應(yīng)用于果蔬中農(nóng)殘的分析檢測(cè)[16-17]。盡管TLC-SERS具有很多優(yōu)點(diǎn)，適合快速分離分析，但由于TLC的分離效率不高，難以應(yīng)用于成分復(fù)雜的樣本。此外，當(dāng)采用溶膠作為SERS基底時(shí)，納米顆粒的不可控團(tuán)聚也使得這種聯(lián)用方法的重復(fù)性較差。為使TLC-SERS適用于更復(fù)雜的樣本分析，本文采用二維TLC技術(shù)進(jìn)一步提高分離效率；同時(shí)，在SERS基底的可控制備方面，采用金納米粒子修飾的介孔二氧化硅來(lái)提高基底的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

糖精鈉化學(xué)名鄰苯甲?；酋啺封c，是食品中常用的合成甜味劑，使用范圍廣泛。糖精鈉的甜度比蔗糖高300～500倍，但其在人體內(nèi)不被分解，對(duì)人體無(wú)任何營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且會(huì)影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退。中國(guó)消費(fèi)者協(xié)會(huì)對(duì)國(guó)內(nèi)近百種不同類型、檔次飲料的調(diào)查表明，大約有55.1%的飲料中含有糖精鈉[18]。此外，GB/T 2760-2014 標(biāo)準(zhǔn)明文規(guī)定禁止在鮮果中添加糖精鈉[19]，但是水果中添加糖精鈉增加甜度的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康。因此，建立快速的、高選擇性的糖精鈉分析方法，為食品安全保駕護(hù)航，具有實(shí)際意義。

本工作將構(gòu)建的二維TLC-SERS技術(shù)成功應(yīng)用于飲料和水果中糖精鈉的分析，開(kāi)發(fā)了一種新的糖精鈉快速分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Santa Barbara Amorphous-15，浙江嘉興探驪新材料研發(fā)有限公司)。對(duì)巰基苯胺(PATP)、羅丹明6G(R6G)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。糖精鈉購(gòu)于上海賢鼎生物科技有限公司。氯金酸、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、乙腈、異丙醇、乙醇、甲醇、甲酸、磷酸、正己烷、氨水、正丁醇、乙醚、二氯甲烷均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥(集團(tuán))化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用的薄層層析板從上海集聚盛化工有限公司采購(gòu)。所有溶液均用超純水設(shè)備Sartorius arium 611 DI( Germany )制備的Milli-Q水配制(電導(dǎo)率18 MΩ·cm)。飲料和水果購(gòu)于超市。

InVia激光顯微拉曼光譜儀(英國(guó)Renishaw公司)：激發(fā)光源514.5 nm，Ar+離子激光器，光柵刻線 1 800 l/mm?；椎谋砻嫘蚊灿脪呙桦娮语@微鏡(Scanning electron microscope,SEM)(S-4800，Hitachi，Japan)進(jìn)行表征。

1.2 金溶膠合成

金溶膠的合成方法參照文獻(xiàn)[20]，在250 mL燒瓶中加熱50 mL 1 mmol/L的氯金酸溶液至沸騰狀態(tài)，加入1.85 mL 38.8 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液，保持沸騰回流加熱15 min，待冷卻后裝入棕色試劑瓶中保存待用，制得的金溶膠呈酒紅色。

1.3 Au@ SBA-15 SERS材料的制備

將60 mg SBA-15 分散于80 mL異丙醇中并攪拌均勻，加入1 mL氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)原液，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將混合物加熱至接近回流(約80 ℃)并攪拌8 h，將固體過(guò)濾，并用無(wú)水乙醇和去離子水分別洗滌3次后于80 ℃干燥12 h，得到氨基改性SBA-15 介孔材料。取30 mg 改性SBA-15粉末于5 mL具塞式離心管中，加入2 mL去離子水，超聲分散均勻，加入2 mL金溶膠，在振蕩器上以1 000 r/min振蕩1 h后靜置，即得金納米顆粒修飾的SBA-15(Au@SBA-15)[21]材料。最后用去離子水沖洗，以去除未負(fù)載到材料上的金納米顆粒。

1.4 飲料及水果中糖精鈉的分離與檢測(cè)

市售飲料加熱除去CO2后再進(jìn)行檢測(cè)。在薄層板下端1 cm處，用點(diǎn)樣毛細(xì)管點(diǎn)上處理好的樣品，第一次展開(kāi)以乙醚-二氯甲烷-醋酸(8∶2∶1，體積比)為展開(kāi)劑，將點(diǎn)好的薄層板放入盛有展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中，展開(kāi)劑液層約0.5 cm，并預(yù)先已達(dá)到飽和狀態(tài)。待第一次展開(kāi)完成后，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，沿著另一個(gè)方向進(jìn)行第二次展開(kāi)，第二次展開(kāi)采用正丁醇-氨水-無(wú)水乙醇(7∶1∶2，體積比)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后將Au@SBA-15基底滴灑在薄層斑點(diǎn)原位(紫外燈下觀察)，采集斑點(diǎn)位置的SERS光譜。

對(duì)于水果中糖精鈉的檢測(cè)，樣品處理如下：取紅棗于攪拌機(jī)中攪成勻漿狀，稱取10 g于50 mL具塞離心管中，加入40 mL甲醇，振蕩8 min，超聲提取8 min，3 000 r/min離心，取上層清液，用雙層濾紙過(guò)濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。第一次展開(kāi)采用乙醚-二氯甲烷-醋酸(8∶2∶0.5，體積比)為展開(kāi)劑，將點(diǎn)好的薄層板放入盛有展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中，展開(kāi)劑液層約0.5 cm，并預(yù)先已達(dá)到飽和狀態(tài)。待第一次展開(kāi)完成后，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，沿著另一個(gè)方向進(jìn)行第二次展開(kāi)，第二次展開(kāi)采用正丁醇-氨水-無(wú)水乙醇(7∶2∶2，體積比)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后將Au@SBA-15基底滴灑在薄層斑點(diǎn)原位(紫外燈下觀察)，采集斑點(diǎn)位置的SERS光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 SERS材料(Au@SBA-15)的表征

按照“1.3”方法對(duì)SBA-15介孔材料進(jìn)行氨基改性，材料修飾金納米顆粒前后的SEM圖見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，大量的金納米顆粒均勻地分散在介孔材料表面，說(shuō)明改性材料對(duì)納米顆粒的親和力高，可形成足夠的SERS活性位點(diǎn)。

圖1 SBA-15(A)和Au@SBA-15(B)的SEM圖

圖2 不同濃度R6G的SERS譜圖

2.2 基底的靈敏度與點(diǎn)-點(diǎn)重復(fù)性

本文采用R6G來(lái)考察基底的SERS活性。圖2為不同濃度R6G在Au@SBA-15材料上的SERS譜圖。由圖可以看出，隨著R6G分子濃度的降低，SERS信號(hào)逐漸減弱，但R6G濃度為10-10mol/L時(shí)仍然能夠清晰地觀察到其特征信號(hào)，說(shuō)明此基底具有良好的SERS活性。

良好的SERS基底的均勻性(點(diǎn)-點(diǎn)重復(fù)性)是固相基底的一個(gè)重要指標(biāo)。為了驗(yàn)證基底不同位置之間增強(qiáng)能力的差異，對(duì)基底進(jìn)行mapping掃描。隨機(jī)選擇1個(gè)基底，采用10-7mol/L PATP作為探針?lè)肿?，選擇12 μm×20 μm大小的區(qū)域，每個(gè)點(diǎn)間隔4 μm，采用514.5 nm Ar+離子激光器，積分3 s，累積1次，采集 24張譜圖，所采集到的譜圖見(jiàn)圖3A。從圖可以看出，在該區(qū)域內(nèi)所獲得的24張譜圖峰高差異不大，所測(cè)區(qū)域內(nèi)每個(gè)點(diǎn)都能產(chǎn)生較為一致的增強(qiáng)效果。記錄每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)上譜圖在1 436 cm-1處特征峰的強(qiáng)度(圖3B)，經(jīng)計(jì)算，這24個(gè)測(cè)量點(diǎn)峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.9%，說(shuō)明其SERS信號(hào)強(qiáng)度差異較小，基底具有較好的均勻性。

為了說(shuō)明不同批次制備得到的SERS基底的重復(fù)性，對(duì)9個(gè)批次基底進(jìn)行考察。以10-7mol/L PATP作為探針?lè)肿?，每個(gè)批次隨機(jī)采集5張光譜，并計(jì)算其在1 436 cm-1處峰高的平均值。9個(gè)批次光譜的平均信號(hào)強(qiáng)度如圖4所示。經(jīng)計(jì)算，該9批基底上所采集到的信號(hào)值的RSD為7.5%，表明基底具有良好的批-批重復(fù)性，制備方法的重復(fù)性高。

圖3 SERS基底的點(diǎn)-點(diǎn)重復(fù)性

圖4 不同批次制備基底上采集到的10-7 mol/L PATP的信號(hào)強(qiáng)度(1 436 cm-1)

圖5 不同質(zhì)量濃度糖精鈉的SERS信號(hào)曲線

圖6 飲料樣品經(jīng)二維TLC展開(kāi)后的照片(A)與薄層板上b點(diǎn)采集到的SERS光譜圖(B)

2.3 基底對(duì)不同質(zhì)量濃度糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)

2.4 二維TLC-SERS聯(lián)用技術(shù)用于飲料及水果中糖精鈉的檢測(cè)

將二維TLC-SERS聯(lián)用技術(shù)用于實(shí)際樣本飲料和水果中糖精鈉的檢測(cè)。采用“1.4”前處理方法，飲料樣本經(jīng)過(guò)二維TLC展開(kāi)后如圖6所示，圖中b點(diǎn)檢測(cè)到了糖精鈉的信號(hào)，其特征峰和標(biāo)樣峰基本一致，可以確定糖精鈉的存在。記錄709 cm-1位置的峰強(qiáng)，并用上述線性方程計(jì)算，測(cè)得飲料中糖精鈉的質(zhì)量濃度為(141±11.2)mg/L。對(duì)于紅棗中糖精鈉的測(cè)定，采用“1.4”中水果的處理方法進(jìn)行展開(kāi)和計(jì)算，得到紅棗中糖精鈉的質(zhì)量濃度為(18±1.9)mg/L。為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，采用液相色譜法進(jìn)行了平行檢測(cè)，得到飲料和紅棗中糖精鈉的質(zhì)量濃度分別為(149±9.6)mg/L和(20±1.6)mg/L。本方法測(cè)得結(jié)果與色譜法基本一致，兩者的相對(duì)偏差(RD)分別為5.3%和10 %，說(shuō)明本方法是一種可靠的快速分析方法。

3 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了一種二維TLC-SERS技術(shù)，采用納米金修飾的二氧化硅微球作為SERS基底，將第一次沒(méi)有分開(kāi)的目標(biāo)物成功從混合體系中分離，提高了色譜的分離能力,且靈敏度高。9個(gè)批次樣本基底SERS信號(hào)的RSD值為7.5%，表明基底的可重復(fù)性高，能夠可控制備。將該方法用于飲料和水果中糖精鈉的快速分析，所得結(jié)果與液相色譜方法的RD值在10%以內(nèi)。本方法操作簡(jiǎn)單，有望應(yīng)用于食品中農(nóng)殘和其他添加劑的快速分析。