貯藏溫度對(duì)‘Tarocco’血橙花色苷積累及抗氧化活性的影響

馮雨，賀明陽(yáng),2，王晶，王日葵*，傅云梅，洪敏

1(西南大學(xué)柑桔研究所，重慶，400712)2(中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510650)

血橙屬甜橙類(lèi)，其種植起源于歐洲。我國(guó)種植的血橙品種有路比(Ruby)、塔羅科(Tarocco)、桑吉耐洛(Sanguinello)、摩洛(Moro)等，主要從意大利、西班牙等國(guó)家引進(jìn)[1]。目前，我國(guó)種植面積最廣的是‘Tarocco’血橙[2]。血橙因富含多酚、類(lèi)黃酮、抗壞血酸等具有抗氧化活性的物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。血橙是唯一含花色苷的柑橘，花色苷的積累使其果實(shí)呈現(xiàn)特有的紫紅色[3]?；ㄉ帐且环N天然水溶性色素，屬于黃酮類(lèi)化合物[4]?；ㄉ帐茄戎兄饕目寡趸钚猿煞?，具有極強(qiáng)的抗氧化性，可有效地清除羥自由基[5]、增強(qiáng)植物抗脅迫能力[6]?；ㄉ者€對(duì)人體具有許多生理保健功能，如抗衰老、預(yù)防肥胖癥、抗炎癥[7-8]。因此，探究采后處理對(duì)血橙花色苷積累和抗氧化活性的影響具有重大意義。

溫度對(duì)花色苷的積累有一定的影響[9-12]。SHINOMIYA等[9]對(duì)葡萄進(jìn)行采前低溫結(jié)合光照處理，花色苷合成途徑的關(guān)鍵基因UFGT達(dá)到最高水平表達(dá)，從而促進(jìn)花色苷積累，使得果皮色澤更加誘人。CARMONA等[10]報(bào)道在4 ℃和9 ℃下貯藏‘Moro’血橙均能增加花色苷的含量，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在9℃條件下可誘導(dǎo)血橙中花色苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因上調(diào)幅度顯著，其中DFR/FLS遠(yuǎn)大于在4 ℃條件下貯藏，使二氫黃酮醇代謝途徑更加偏向于生成花色苷的方向。PANNITTERI等[11]發(fā)現(xiàn)‘Tarocco’血橙在4 ℃下貯藏70 d花色苷的含量明顯高于對(duì)照組(20 ℃)，但在1 ℃時(shí)貯藏20 d，血橙中花色苷含量沒(méi)有明顯的變化。而TSANIKLIDIS等[12]研究發(fā)現(xiàn)甜櫻桃在1℃下貯藏，其花色苷含量低于對(duì)照組(20 ℃)，進(jìn)一步研究得到，生成花色苷途徑的結(jié)構(gòu)基因ANS和UFGT表達(dá)降低。因此，在溫度過(guò)低的情況下，反而抑制花色苷合成途徑的基因表達(dá)，不利于果實(shí)中花色苷的積累。

由此可知，適宜的貯藏溫度能更有效地增加果實(shí)中花色苷含量。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)低溫誘導(dǎo)花色苷合成的研究報(bào)道不少，但對(duì)于低溫誘導(dǎo)血橙花色苷合成，同時(shí)維持果實(shí)的良好品質(zhì)有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)不同溫度貯藏‘Tarocco’血橙，探究貯藏溫度對(duì)血橙花色苷合成規(guī)律及血橙果肉中的總酚、總黃酮含量和酶活性的變化規(guī)律，篩選出適宜血橙貯藏的溫度，有利于提高血橙營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及商品價(jià)值，并為采后血橙品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)及可行技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血橙品種為‘Tarocco’血橙，2019年2月26日下午在重慶市萬(wàn)州區(qū)血橙基地采摘，次日運(yùn)回北碚區(qū)實(shí)驗(yàn)室。挑選出大小均勻，表面無(wú)損傷，無(wú)病害的果實(shí)，并用500 mg/L咪鮮胺溶液和250 mg/L 2,4-D溶液浸泡1 min，取出晾干備用。

乙酸鈉(優(yōu)級(jí)純)，上海麥克林生物公司；Al(NO3)3(分析純)，冰醋酸(優(yōu)級(jí)純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；愈創(chuàng)木酚(化學(xué)純)，中國(guó)佘山化工廠；NaNO2、鄰苯二酚、PEG 6000(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；福林酚試劑(生物試劑)，生工生物工程股份有限公司；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，南通飛宇生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀，成都立德賽科技有限公司；CF16RN高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HZK-FA210S電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；CM-5分光色差儀，柯尼卡美能達(dá)公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將晾干的血橙單果包裝隨機(jī)分在不同溫度下貯藏。溫度的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]得出，并結(jié)合實(shí)際情況作相應(yīng)調(diào)整：對(duì)照組，15～20 ℃、80%～85% RH(CK)；處理組1，6～8 ℃、80%～85% RH(T1)；處理組2，4～6℃、80%～85% RH(T2)，每組約300個(gè)果實(shí)，分別在空間大小都一致、且處于無(wú)光照條件下的冷庫(kù)室及通風(fēng)室內(nèi)貯藏。每隔15 d隨機(jī)取樣1次，每組取15個(gè)果實(shí)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。最后，果肉用液氮速凍后置-80 ℃的冰箱備用。

1.3.2 色差測(cè)定

柑橘榨汁，過(guò)濾混合后取樣，根據(jù)CIEL*、a*、b*參數(shù)采用CM-5色差儀于室溫下測(cè)得。參考CHEN[13]等采用色澤指數(shù)(citrus color index，CCI)表示柑橘果汁顏色變化。CCI值為正則表示紅黃色，為負(fù)表示藍(lán)綠色，值的絕對(duì)值越大代表顏色越深；為零表示紅，黃和藍(lán)綠復(fù)合色。CCI計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：L*為亮度；a*為紅綠色差；b*為黃藍(lán)色差。

1.3.3 花色苷含量測(cè)定

采用pH示差法[14-15]。使用兩種緩沖液，pH=1.0的KCl緩沖液和pH=4.5的乙酸鈉緩沖液。用相應(yīng)的緩沖液(1∶6)稀釋樣品，于510 nm和700 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.4 總酚含量和總黃酮含量測(cè)定

液氮研磨冷凍的血橙果肉樣品，稱(chēng)取2 g粉末，加入80%甲醇10 mL，渦旋混勻，室溫超聲30 min，然后將混合液離心(22 ℃、5 000×g、10 min)，取上清液到25 mL容量瓶中，殘?jiān)靥?～2次，將所有上清液用80%甲醇定容于25 mL容量瓶中，混合后溶液置于5 mL離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

總酚含量測(cè)定：參考季露等[16]方法并略作修改。采用Foiln-Ciocalte法，用沒(méi)食子酸作標(biāo)準(zhǔn)物。準(zhǔn)確取待測(cè)樣品溶液0.3 mL，加入1.2 mL蒸餾水，再加入福林酚試劑0.3 mL，混勻后暗反應(yīng)6 min，再加入3 mL 7%Na2CO3、2.4 mL蒸餾水，室溫靜置90 min，于760 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。以每克果蔬樣品干重相當(dāng)于沒(méi)食子酸的毫克數(shù)。

總黃酮含量測(cè)定：參考季露等[16]和張東峰等[17]方法并略作修改。用兒茶素做標(biāo)準(zhǔn)物。準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)溶液0.6 mL、2.4 mL 80%甲醇、0.3 mL 5%NaNO2溶液，混勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 10%Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min，最后加入2.4 mL 4%NaOH溶液，混勻靜置15 min，于510 nm下測(cè)吸光度，重復(fù)3次。以每克果蔬樣品干重相當(dāng)于兒茶素的毫克數(shù)。

1.3.5 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性測(cè)定

稱(chēng)取5 g血橙果肉凍樣，置于預(yù)冷的研缽中，加入5 mL提取緩沖液(1 mmol聚乙二醇6 000、4%聚乙烯吡咯烷酮和1%Triton X-100)，在冰浴下研磨成勻漿，于4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液，即為酶提取液，放置4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

PPO活性測(cè)定：參考ZHOU等[18]方法略作修改，取一支干凈試管，向其加入4.0 mL 0.1 mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 100 mmol/L鄰苯二酚溶液，再加入1 mL酶提取液，立即混合均勻，在波長(zhǎng)420 nm測(cè)吸光度，重復(fù)3次。以每克果蔬樣品在420 nm處每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個(gè)PPO活性單位。

POD活性測(cè)定：參考CHANCE等[19]方法略作修改，取一支干凈試管，向其加入3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液、0.5 mL酶提取液，再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合后啟動(dòng)反應(yīng)，在波長(zhǎng)470 nm測(cè)吸光度，重復(fù)3次。以每克果蔬樣品在470 nm波長(zhǎng)每分鐘吸光度變化值增加1為1個(gè)POD活性單位。

1.3.6 RNA提取、cDNA第一鏈合成及熒光定量PCR

1.3.6.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成

根據(jù)Tiangen植物多糖多酚總RNA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，提取果肉中RNA。以提取的RNA為模板，利用Tiangen FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA。

1.3.6.2 熒光定量PCR(qRT-PCR)

基因PAL、C4H、4CL、CHI、FLS、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT、GST的引物參考CARMONA[10]等；內(nèi)參基因(EF-1α)和CHS引物參考LO PIERO[20]等。qRT-PCR反應(yīng)在96孔PCR板上加入如下反應(yīng)體系：EvaGreen Express 2X，5 μL；Forward Primer，0.4 μL；Reverse Primer，0.4 μL；cDNA，1 μL；RNase-Free ddH2O，3.2 μL；總體積為10 μL。qRT-PCR反應(yīng)使用BIO-RAD CFX96TMReal-Time Systerm儀器，其中反應(yīng)程序是：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；58 ℃、30 s；經(jīng)過(guò)40個(gè)反應(yīng)循環(huán)。溶解曲線為：95 ℃、10 s，降溫至65 ℃之后再開(kāi)始升溫，維持5 s采集熒光信號(hào)，到95 ℃結(jié)束反應(yīng)。每個(gè)模板做3次重復(fù)，采用2-△△CT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018軟件繪圖和SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD多重比較及Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血橙果汁中的色差變化

血橙色差變化由L*、a*、b*、CCI參數(shù)大小來(lái)表示(圖1)。L*值表示血橙果汁的亮度，整個(gè)貯藏期間，CK組在貯藏30 d急劇上升，顯著高于T1、T2組，而T1、T2組在貯藏15 d后顯著下降，趨于穩(wěn)定狀態(tài)；a*值表示果汁的紅綠色差，在這里，a*值越大，表明紅色越深。T1和T2組a*值逐漸升高，而CK組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；b*值表示黃藍(lán)色差，這里則表明b*值越大，黃色越深，CK組升高趨勢(shì)顯著，突出CK組貯藏的果實(shí)的果汁顏色會(huì)傾向于黃色；CCI值表示綜合色差，CCI值越大，果汁紅色越深，T1和T2組逐漸升高，而CK組逐漸下降，可能由于在貯藏期間CK組中的亮度變亮，黃色占主要顏色，反之T1和T2組亮度變暗，紅色占主要顏色。其中，在貯藏后期，L*、a*、b*、CCI值在各處理溫度之間均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

a-顏色變化；b-L*；c-a*；d-b*；e-CCI；CK-15～20 ℃；T1-6～8 ℃；T2-4～6 ℃；下同圖1 貯藏期間血橙顏色變化Fig.1 Color changes of blood orange during storage注：圖中的不同字母表示在P<0.05范圍內(nèi)存在顯著性差異

2.2 血橙果肉中花色苷含量、總黃酮含量和總酚含量的變化

如圖2-a所示，T1、T2組，血橙中的花色苷呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。T2組，血橙果肉中花色苷從15.98 mg/L增加到28.36 mg/L。而CK組，血橙果肉中花色苷含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，貯藏到60 d時(shí)，血橙中花色苷含量為11.07 mg/L，與T1和T2組存在顯著差異(P<0.05)。相較于CK組血橙中花色苷的積累，T1、T2組更有利于花色苷的積累。由此可見(jiàn)，花色苷生成對(duì)低溫有一定依賴(lài)性，這與前人研究結(jié)果一致[21-22]。

如圖2-b所示，總黃酮含量均增加。在整個(gè)貯藏中，CK、T1和T2之間不存在顯著差異性(P>0.05)。其中，T2組的總黃酮含量一直呈現(xiàn)逐漸上升狀態(tài)，貯藏至60 d時(shí)，達(dá)到最大值。如圖2-C所示，血橙總酚含量也有一定的增加。T2組，其含量從0.76 mg/g增加到1.05 mg/g-1。其中，在貯藏至15，45，60 d時(shí)，CK與T1、T2均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

2.3 血橙果肉中酶活性變化

如圖3-a所示，在整個(gè)貯藏期間，CK、T1組，POD活性呈現(xiàn)先下降再升高再下降，且貯藏至30 d時(shí)，POD活性達(dá)到最大值，隨后CK組的酶活性出現(xiàn)大幅度下降。T2組，POD活性出現(xiàn)先下降再升高再降低再升高，且始終低于0 d時(shí)的酶活性。并且，在各個(gè)貯藏階段，各處理溫度之間均存在顯著差異(P<0.05)。其中，CK組的POD活性保持在較高水平，而在T2組處于較低狀態(tài)。

a-花色苷；b-總黃酮；c-總酚圖2 在貯藏期間花色苷含量、總黃酮含量、總酚含量的變化Fig.2 Changes of anthocyanin content、total flavonoids content and total phenols content during storage

圖3-b所示，CK組，PPO酶活性變化趨勢(shì)與POD活性一致，在貯藏到30 d時(shí)出現(xiàn)最大值，之后急劇下降；T1組，酶活性呈現(xiàn)先下降再升高再下降，并在貯藏后期的PPO活性高于CK和T2組；T2組，PPO活性出現(xiàn)先下降后略微上升趨于平穩(wěn)，處于最低水平。

a-POD；b-PPO圖3 貯藏期間血橙中POD、PPO的變化Fig.3 Changes of POD and PPO in blood oranges during storage

2.4 血橙果肉中花色苷生成相關(guān)基因表達(dá)

血橙中的花色苷合成通路已經(jīng)有較為成熟的闡述[10]。首先，由苯丙烷代謝途徑中的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、肉桂酸羥化酶(cinnamate hydroxylase，C4H)、香豆酞CoA連接酶(coriander CoA ligase，4CL)、查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H)和類(lèi)黃酮-3,5-羥化酶(flavonoid-3,5-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H)的作用下發(fā)生一系列反應(yīng)生成二氫黃酮醇。緊接著二氫黃酮醇可通過(guò)黃酮醇合成酶(flavonol synthase，F(xiàn)LS)作用下反應(yīng)生成黃酮醇，還可由二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)、花青素合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和類(lèi)黃酮3,5-糖苷轉(zhuǎn)移酶(flavonoid 3,5-glycoside transferase，UFGT)作用下生成穩(wěn)定的花色苷，最后，花色苷在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase，GST)作用下儲(chǔ)藏于液泡中。

如圖4所示，基因表達(dá)量T1、T2組均有增強(qiáng)。以二氫黃酮醇為分節(jié)點(diǎn)，即花色苷早期合成基因有PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H和F3′5′H；后期合成基因有DFR、ANS、UFGT和GST。從圖中看出，早期合成基因中無(wú)相對(duì)一致的變化規(guī)律性?；ㄉ盏暮铣沙跏蓟騊AL在3組溫度中出現(xiàn)明顯差異，CK組PAL表達(dá)量幾乎為零，而T2組貯藏至15、30 d時(shí)，PAL表達(dá)量提高，達(dá)到0 d的10.5～11.0倍，并達(dá)到CK組的34.3～49.1倍。隨后，在貯藏到60 d時(shí)，PAL表達(dá)量達(dá)到CK組的76倍。同時(shí)，T2組，早期結(jié)構(gòu)基因CHS和F3′5′H表達(dá)量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在貯藏60 d時(shí)，與CK組相比，達(dá)到13.4倍(CHS)，9.92倍(F3′5′H)；與T1組相比，達(dá)到1.8倍(CHS)，1.3倍(F3′5′H)。其他早期合成基因C4H、4CL、CHS、CHI、F3H的表達(dá)量出現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，但均高于CK組。而另一條途徑二氫黃酮醇通過(guò)黃酮醇合成酶(FLS)作用下反應(yīng)生成黃酮醇中FLS的基因表達(dá)在各貯藏溫度中均出現(xiàn)下調(diào)，T1和T2組基因下調(diào)更為顯著。后期合成花色苷的基因DFR、ANS、UFGT和GST。T2組，貯藏至30 d時(shí)，達(dá)到了貯藏期間的較高值，與CK組相比，達(dá)到14.2倍(ANS)，5倍(UFGT)，16.2倍(GST)；貯藏到60 d時(shí)，相比CK組，達(dá)到16倍(DFR)，15.1倍(ANS)，8.1倍(UFGT)，28.4倍(GST)。盡管基因DFR、ANS、UFGT和GST在貯藏30 d達(dá)到較大值，但貯藏60 d時(shí)與CK組的比值更大，即隨著貯藏時(shí)間加長(zhǎng)，花色苷合成速率減緩，在CK組血橙中花色苷合成途徑受到的影響更大。并且T1、T2組，DFR基因的高表達(dá)與FLS基因的低表達(dá)，從而誘導(dǎo)血橙中花色苷的生成。

a-PAL;b-C4H;d-SCL;e-CHI;f-F3H;g-F3′5′H;h-FLS;i-DFR;g-ANS;k-UFGT;l-GST圖4 血橙果肉中花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.4 Changes in relative expression of anthocyanin-related structural genes in blood orange pulp

2.5 血橙貯藏過(guò)程中花色苷含量與結(jié)構(gòu)基因的相關(guān)性

如表1所示，在整個(gè)貯藏期間，血橙中花色苷含量與結(jié)構(gòu)基因PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT和GST呈正相關(guān)，與基因FLS呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，且結(jié)構(gòu)基因之間也基本呈現(xiàn)顯著正相關(guān)；基因C4H與其他結(jié)構(gòu)基因和花色苷未有顯著性。

3 討論

血橙因含有花色苷，酚類(lèi)物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，得到廣泛的關(guān)注。本文對(duì)血橙采后進(jìn)行不同溫度貯藏，貯藏30 d直至60 d，4～6 ℃條件的CCI值與15～20 ℃呈現(xiàn)顯著差距，其血橙果汁紅色逐漸加深。相應(yīng)的，在4～6 ℃條件下的花色苷含量從30 d開(kāi)始出現(xiàn)線性增加。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，血橙中花色苷合成的主要基因PAL、CHS、DFR、ANS、UFGT和GST的表達(dá)量處于較高水平，并與花色苷含量呈顯著正相關(guān)。其中，C4H與花色苷含量之間存在較低的相關(guān)性，可能因?yàn)镃4H屬于花色苷合成的前期基因，而低溫對(duì)花色苷合成的后期基因DFR、ANS、UFGT和GST有主要促進(jìn)作用。則還可能是低溫啟動(dòng)了血橙果實(shí)中Ruby轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而調(diào)控血橙中花色苷合成相關(guān)的后期結(jié)構(gòu)基因表達(dá)顯著上調(diào)。BUTELLI等[23]研究中低溫啟動(dòng)了血橙中Ruby轉(zhuǎn)錄因子的顯著表達(dá)，提高了花色苷合成的相關(guān)基因表達(dá)量，從而誘導(dǎo)血橙中花色苷積累。其他研究者也得出花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因受到相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，進(jìn)而影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。KOBAYASHI等[24]報(bào)道了MYB基因調(diào)控UFGT基因表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)巨峰葡萄果實(shí)中花色苷積累。柑橘中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因CsMYBF1，該轉(zhuǎn)錄因子可激活CHS基因的啟動(dòng)子，提高CHS基因的表達(dá)[25]。在菊花中，CmbHLH2和CmMYB6結(jié)合調(diào)控DFR基因表達(dá)上調(diào)而提高花色苷的含量[26]。因此，之后還可對(duì)血橙中花色苷合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行更深一步研究。

表1 皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 1 Pearson correlation coefficients

注：表中每列“**”表示P<0.01；“*”表示P<0.05

血橙中抗氧化活性成分除花色苷外，果實(shí)中富含的多酚、類(lèi)黃酮也具有抗氧化活性。本文中4～6 ℃條件，血橙中的總酚、總黃酮含量高于15～20 ℃、6～8 ℃條件的果實(shí)，并在貯藏期逐漸上升?？赡芤?yàn)槎喾?、?lèi)黃酮均屬于苯丙烷途徑中的代謝產(chǎn)物，4～6 ℃條件提高PAL、CHS、4CL的基因表達(dá)量，促進(jìn)了多酚及類(lèi)黃酮的積累，從而增強(qiáng)了果實(shí)的抗氧化性。HABIBI等[27]研究發(fā)現(xiàn)了血橙中的花色苷和酚類(lèi)物質(zhì)可增強(qiáng)總抗氧化活性。這一結(jié)果與何禮等[28]一致，低溫誘導(dǎo)花色苷積累，花色苷含量與血橙果實(shí)的抗氧化性呈顯著正相關(guān)。說(shuō)明在4～6 ℃條件下，血橙中的花色苷和總酚可提高果實(shí)的抗氧化能力。

POD和PPO活性高低與果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)的氧化有關(guān)[29-30]。圖3所示，在4～6 ℃條件下貯藏血橙，POD和PPO活性均處于較低水平。由此可見(jiàn)，該溫度貯藏抑制了果實(shí)中POD和PPO活性，降低血橙果肉中酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，而使血橙中酚類(lèi)物質(zhì)的含量高于15～20 ℃、6～8 ℃條件的果實(shí)。這一結(jié)論與王雅楠等[29]一致：水揚(yáng)酸(salicylicacid，SA)處理李果實(shí)，推遲POD和PPO活性上升，降低酚類(lèi)物質(zhì)氧化，從而減輕了果實(shí)褐變程度。

本文中低溫誘導(dǎo)血橙果實(shí)合成花色苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花色苷積累。同時(shí)，還提高果實(shí)中總酚總黃酮含量，增強(qiáng)了果實(shí)的抗氧化性，從而保持血橙采后品質(zhì)。其中，以4～6 ℃貯藏的血橙中花色苷含量、總酚總黃酮含量最高，所以4～6 ℃貯藏血橙最適宜。但本文對(duì)血橙果實(shí)抗氧化活性只在于初步研究，針對(duì)低溫下果實(shí)抗氧化活性變化規(guī)律還需進(jìn)一步研究。