綠茶、桑葉和臭黃荊葉細粉水提液抑菌和抗氧化能力

黃思雨，鄧?yán)?2，童芳，林致通，鐘耕*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶，401121)

茶葉(Camelliasinensis(L.) O. Ktze)主要生長在熱帶和溫帶地區(qū)，包括中國、印度、斯里蘭卡、日本以及幾個非洲和南美洲國家，根據(jù)發(fā)酵程度可以分為綠茶、白茶、紅茶和烏龍茶。其中綠茶是未發(fā)酵的，黃酮、多酚等功能成分得到了很好的保存[1]。在許多體外、動物和人體試驗中，發(fā)現(xiàn)綠茶具有抗癌、抑菌、抗氧化、降低心血管疾病死亡率等多種功效[2-5]。BALSAN等[2]探究了綠茶提取物的抑菌活性。MIJA等[3]通過大鼠實驗證明了綠茶具有降血脂的健康功效。來自日本的兩項研究表明，每天飲用綠茶能夠降低人的心血管疾病死亡率[4-5]。

桑(MorusalbaL.)是?？浦参?，在世界各地都有種植，特別是在亞洲，非洲和拉丁美洲。桑樹的所有部分，包括根、樹皮、果實和葉子，都是生物活性物質(zhì)的良好來源，具有很高的藥用價值[6]?，F(xiàn)有的研究證明桑葉具有治療發(fā)熱、保護肝臟、降低血壓、抗炎和抗癌等功效[7-8]。

臭黃荊(PremnaligustroidesHemsl)是一種馬鞭草科腐婢屬灌木，廣泛分布于中國的西南地區(qū)。臭黃荊葉含有豐富的果膠，是制作民間小吃“神仙豆腐”的原料；用來外敷涂抹時還可以起到消毒解腫、消除毒瘡的作用，具有豐富的食用和藥用價值[9]。

人們將這3種植物葉片沖調(diào)飲用的習(xí)慣由來已久，且已有研究證明三者均具有抑菌和抗氧化活性[2,8-9]。隨著對其認(rèn)識逐漸深入，新的飲品也不斷出現(xiàn)，同時開始將細粉用作食品添加劑來制造各種健康食品，如面包和糖果等[10-11]。目前對于綠茶、桑葉和臭黃荊葉的研究集中于其全葉和粗粉的醇提液活性研究，且對于三者生物活性的比較研究還未見報道。因為溶劑極性和原料粒度不同，提取液中活性成分的種類和含量差異很大，抑菌能力和抗氧化活性也有所不同。因此開展3種水提液的抑菌和抗氧化活性比較，能夠準(zhǔn)確清晰地認(rèn)識到3種植物細粉在日常攝入中的功效，為其健康消費選擇和生產(chǎn)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶，湄潭翠芽成品，貴州茶海大自然茶旅發(fā)展有限公司產(chǎn)；桑葉粉，重慶康家客食品有限公司提供(100%過200目篩)；臭黃荊葉粗粉，重慶源宇旅游開發(fā)有限公司提供；供試菌種為西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保存菌種。

蘆丁、沒食子酸，抗壞血酸，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)，東京化成工業(yè)株式會社；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

759紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；KQ-3200DB(40kHz)數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；H1850臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將綠茶、臭黃荊葉粗粉用粉碎機精粉碎后，過200目篩得細粉，密封包裝，低溫陰涼避光干燥處存放備用。

1.3.2 黃酮、多酚含量測定

參考盧秀彬[9]的方法，分別測定3種粉劑材料醇提和水提2種方式的黃酮和多酚含量。

1.3.2.1 供試樣品液制備

參照文獻[9]的提取方法，適當(dāng)調(diào)整。稱取1.50 g的樣品(干基計)，按料液比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇或蒸餾水，在70 ℃(加蒸餾水提取時為90 ℃)條件下超聲振蕩回流提取30 min，抽濾得濾液，連續(xù)提取3次，合并3次濾液，分別用70%的乙醇和蒸餾水定容至250 mL容量瓶中，搖勻。

1.3.2.2 黃酮含量測定

采用改良的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]測定黃酮含量。取1.3.2.1制備的樣品液1.0 mL，加入5%的NaNO2溶液1.0 mL，放置5 min，加10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL混勻，放置5 min后加4%的NaOH溶液10.0 mL，最后用30%的乙醇定容至25 mL，搖勻，靜置10 min。以不加樣品液管調(diào)零，于510 nm處測定吸光度值，黃酮含量以蘆丁當(dāng)量計。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.658 3x-0.034 3(R2=0.999 4)，式中y為OD510值，x為蘆丁濃度，單位為mg/mL。

1.3.2.3 多酚含量測定

使用Folin-Ciocalteu法[13]測定多酚含量。取1 mL樣品液，加入3 mL稀釋10倍的福林酚試劑混勻，反應(yīng)10 min后，再加入3 mL 10%的Na2CO3溶液混勻，避光顯色2 h后用蒸餾水定容至10 mL，在765 nm處測吸光度，多酚含量以沒食子酸當(dāng)量計。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.011 8x-0.038 9(R2=0.996 8)，式中y為OD765值，x為沒食子酸濃度，單位為mg/mL。

1.3.3 抑菌能力測定

1.3.3.1 樣品液制備

參照文獻[14]的提取方法，稍作調(diào)整。準(zhǔn)確稱取3 g樣品(干基計)，加入200 mL蒸餾水，沸水浴加熱15 min，離心取上清液，得綠茶水提液(GE)、桑葉水提液(ME)和臭黃荊葉水提液(PE)，裝入棕色瓶，保存于4 ℃冰箱中。

1.3.3.2 最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)與最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測定[15]

取13支試管，每支試管加入無菌肉湯培養(yǎng)基2.0 mL，然后于第一支試管中加入濃縮20倍的樣品液(0.3 g/mL)2.0 mL，混合均勻后取出2.0 mL注入第2支試管中，依次類推，直到第11管取出2.0 mL棄去。第12管不加樣品，作陽性對照；第13管不加菌液，作陰性對照。接著在1～12管中加入0.1 mL OD600值為1的菌液混合搖勻，第13支試管加入0.1 mL滅菌生理鹽水，將各試管37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

得出最小抑菌濃度(MIC)后，將未見細菌生長的試管培養(yǎng)物混勻，分別取培養(yǎng)物0.1 mL均勻涂布于瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用活菌計數(shù)器計數(shù)平板上的菌落數(shù)，平均菌落數(shù)小于5個的樣品濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.3.3 抑菌圈測定(牛津杯法)

根據(jù)文獻[16]的方法稍作修改。在無菌培養(yǎng)皿中加1.5%的水瓊脂10 mL，凝固后在平板上均勻放置4個牛津杯。再按1∶100的比例將OD600值為1的菌液接種至60 ℃左右的固體培養(yǎng)基中混合均勻，迅速加入培養(yǎng)皿中。凝固后取出牛津杯，在形成的4個小孔中分別加100 μL無菌生理鹽水和100 μL一定濃度的樣品液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 樣品的制備

與1.3.3.1的制取方法一致，同時取出制得的部分樣品液以1∶1的比例兩兩混合，得到綠茶+桑葉水提液(GEME)、綠茶+臭黃荊葉水提液(GEPE)、桑葉+臭黃荊葉水提液(MEPE)，探究它們之間抗氧化能力的協(xié)同性。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率

參照文獻[17]的方法，稍作調(diào)整。準(zhǔn)確稱取DPPH 0.02 g，用無水乙醇定容于250 mL容量瓶中，配成濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。取3支試管，分別標(biāo)記為A0、A1、A2。A0：2 mL蒸餾水+2 mL DPPH溶液；A1：2 mL樣品+2 mL DPPH溶液；A2：2 mL樣品+2 mL無水乙醇，搖勻后避光靜置30 min，在517 nm處測吸光值，每組做3個平行。

(1)

式中：S，DPPH自由基清除率，%；A0，A0管測得的吸光度值；A1，A1管測得的吸光度值；A2，A2管測得的吸光度值。

以VC為標(biāo)品，得到VC濃度x(μg/mL)與DPPH自由基清除率y(%)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.299 6x+7.632(R2=0.999 2)。樣品的DPPH自由基清除率以達到同等效果所需VC的濃度計，單位為μgVc/mL。

1.3.4.3 羥自由基清除率

參考HUI等[18]的方法，稍作修改。取2.0 mL樣品液，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液、9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液和8.8 mmol/L的H2O2溶液各2.0 mL，置于37 ℃水浴鍋中水浴30 min。用同體積蒸餾水代替樣品液作空白組，用同體積的蒸餾水代H2O2溶液做對照，在510 nm波長處測量吸光度值。

(2)

式中：S，羥自由基清除率，%；A0，不加樣品液測得的吸光度值；A1，樣品液測得的吸光度值；A2，不加水楊酸測得的吸光度值。

以VC為標(biāo)品，得到VC濃度x(μg/mL)與羥自由基清除率y(%)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.148 7x+3.846(R2=0.995 4)。樣品的羥自由基清除率以達到同等效果所需VC的濃度計，單位為μg Vc/mL。

1.3.4.4 Fe2+螯合能力

參照文獻[19]的方法，稍作調(diào)整。取2 mL的樣品液、依次加入2 mmol/L的FeCl2溶液和蒸餾水各3 mL，混勻后加入0.4 mL 5 mmol/L的菲啰嗪溶液，37℃水浴30 min，測定562 nm波長下的吸光度。

(3)

式中：S，F(xiàn)e2+螯合能力，%；A0，不加樣品液測得的吸光度值；A1，樣品液測得的吸光度值。

以VC為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到VC濃度x(μg/mL)與Fe2+螯合能力y(%)的回歸方程為y=0.440 5x-3.985(R2=0.998 9)。樣品的Fe2+螯合能力以達到同等效果所需VC的濃度計，單位為μg Vc/mL。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 23進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示，Pearson法進行相關(guān)性分析，Duncan法進行顯著性分析，用Origin 8.5做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮多酚含量測定

2.1.1 黃酮含量

綠茶粉、桑葉粉、臭黃荊葉粉醇提液和水提液中黃酮含量見圖1。由圖中可以看出，無論是醇提液還是水提液，黃酮含量從高到低均表現(xiàn)為綠茶粉>桑葉粉>臭黃荊葉粉，且三者差異性顯著(P<0.05)。綠茶粉醇提液和水提液中黃酮含量沒有顯著差異，RUSAK等[20]測定的綠茶醇提液和水提液中黃酮含量也得到了相同的結(jié)果。桑葉粉和臭黃荊葉粉醇提液中黃酮含量遠遠高于其水提液中的含量(P<0.05)。這可能是因為桑葉粉和臭黃荊粉葉中的黃酮大多是極性較小的異黃酮，黃烷酮，甲基化黃酮和黃酮醇，而極性較大的類黃酮糖苷含量比較少[21]。從黃酮溶出的角度看，相較桑葉粉和臭黃荊葉粉，綠茶粉更適合沸水沖泡飲用。

圖1 3種原料醇提液和水提液中黃酮含量Fig.1 Flavonoids in alcohol extracts and aqueousextracts of three raw materials注：大寫字母不同表示不同提取方式差異顯著(P<0.05);小寫字母不同表示不同原料同一提取方法差異顯著(P<0.05),下同

2.1.2 多酚含量

綠茶粉、桑葉粉、臭黃荊葉粉醇提液和水提液中多酚含量見圖2。從圖中可以看出綠茶粉醇提液和水提液中多酚含量均顯著高于桑葉粉和臭黃荊葉粉醇提液和水提液中多酚含量，分別為166.58 mg/g、133.82 mg/g。桑葉粉和臭黃荊葉粉相比，無論是在醇提液中還是水提液中，兩者的多酚含量均沒有顯著差異。3種植物醇提液中多酚含量均顯著大于其水提液(P<0.05)，苑子夜等[22]也在研究中發(fā)現(xiàn)杜仲葉醇提液中多酚含量高于其水提液。這是因為存在于植物組織中的多酚通常通過氫鍵和疏水鍵與其他分子(例如蛋白質(zhì)和多糖)結(jié)合，分子的對稱性增加，極性減弱。相比于極性較強的水，多酚更容易溶解于極性較弱的乙醇水溶液中[23]。

圖2 3種原料醇提液和水提液中多酚含量Fig.2 Polyphenol in alcohol extracts and aqueousextracts of three raw materials

原料中黃酮、多酚含量的測定結(jié)果表明，綠茶粉中黃酮、多酚含量最高；桑葉粉和臭黃荊葉粉依次減少，且水提液中黃酮、多酚含量低于醇提液中的含量，差異顯著(P<0.05)。已有研究證明，物質(zhì)的抑菌、抗氧化能力與其黃酮、多酚含量有關(guān)[24-25]。因此，研究原料日常消費的水提液的抑菌和抗氧化活性，能夠更清晰地認(rèn)識到原料所帶來的健康益處。

2.2 抑菌能力分析

2.2.1 MIC和MBC測定

由表1可以看出3種水提液抑菌能力由強到弱依次為GE、ME、PE。GE對大腸桿菌的MIC為0.018 6 g/mL，MBC為0.037 5 g/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC、MBC均為0.009 4 g/mL。ME對金黃色葡萄球菌的MIC、MBC均小于對大腸桿菌的MIC、MBC。梁薇等[26]的研究表明桑葉醇提液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌均有抑制效果，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。PE的抑菌能力較弱，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用優(yōu)于大腸桿菌，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.300 0 g/mL。

表1 3種原料水提液最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果Table 1 Determination of minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) ofaqueous extracts of three raw materials

2.2.2 抑菌圈直徑測定

由表2可以看出GE、ME和PE的抑菌效果均隨著濃度的增大而增強，在相同濃度下，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于對大腸桿菌的抑菌圈直徑。三者相比，GE的抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，邊緣清晰完整，其次是ME，PE的抑菌效果最弱。

表2 3種原料水提液抑菌圈直徑測定結(jié)果Table 2 Determination of the diameter of the inhibition zone of the aqueous extracts of the three raw materials

注：-表示抑菌圈直徑小于6 mm

抑菌能力測定結(jié)果表明，GE的抑菌效果最好，ME次之，PE最弱，3種水提液對革蘭氏陽性菌的抑菌效果均優(yōu)于革蘭氏陰性菌。這是因為兩者細胞膜的組成和排列方式不同。革蘭氏陽性菌細胞膜外部有一個肽聚糖層，它是無效的滲透屏障。而革蘭氏陰性菌的外部磷脂膜帶有結(jié)構(gòu)性脂多糖，它與孔蛋白構(gòu)成選擇性屏障，使得溶菌酶這類親脂類的抑菌物質(zhì)不能滲透，從而無法起到抑菌作用[27]。GE、ME和PE的抑菌能力大小與其黃酮、多酚含量相關(guān)。這與對櫻桃果渣抑菌能力的研究[27]中所得結(jié)果一致。研究表明，黃酮、多酚分子上有很多酚羥基，這些基團能夠與蛋白質(zhì)或酶以氫鍵的方式結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)使其變性失活，導(dǎo)致細菌細胞質(zhì)固縮、解體，從而起到抑菌作用[28]。

2.3 抗氧化能力分析

2.3.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基帶有一個單電子，抗氧化劑對DPPH自由基有清除作用，表明其有提供電子或質(zhì)子的能力，因此測定DPPH自由基清除率是評估抗氧化劑活性的常用方法[17]。由圖3可知3種細粉水提液DPPH自由基清除率由高到低依次為GE>ME>PE，差異性顯著(P<0.05)。GEME的DPPH自由基清除率與GE沒有顯著性差異。GEPE的DPPH自由基清除率高于PE，低于GE。MEPE的DPPH自由基清除率與PE沒有顯著差異。三者混合后水提液的DPPH自由基清除率均小于混合前的DPPH自由基清除率，表明三者水提物在DPPH自由基清除能力方面無協(xié)同增效作用。

圖3 3種原料水提液對DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of water extracts from three raw materials注：所有樣品濃度均為0.015 g/mL，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.3.2 羥自由基清除率

羥自由基具有非常強的電子獲得能力，它是自然界中僅次于氟元素的氧化劑[18]。羥自由基清除能力在一定程度上代表著物質(zhì)的抗氧化能力。由圖4可知，GE的羥自由基清除率最高，ME次之，PE最低。GEME、GEPE、MEPE的羥自由基清除率均在其混合前單獨水提液的羥自由基清除率范圍內(nèi)，即GE、ME和PE在羥自由基清除率方面沒有協(xié)同作用。

圖4 3種原料水提液的羥自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl scavenging ability of aqueous extracts of three raw materials

2.3.3 Fe2+螯合能力

Fe2+可以催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，絡(luò)合Fe2+，降低Fe2+濃度，可以減緩氧化反應(yīng)速率[19]。由圖5可知GE的Fe2+螯合力最強，顯著高于PE(P<0.05)，但GE與ME間沒有顯著性差異。GEME和GEPE的Fe2+螯合能力略低于GE。MEPE的Fe2+螯合能力低于ME，高于PE?；旌虾蟮乃嵋涸贔e2+螯合能力方面沒有表現(xiàn)出協(xié)同效果。

圖5 3種原料水提液的Fe2+螯合能力Fig.5 Fe2+ chelation ability of aqueous extractsof three raw materials

3種抗氧化指標(biāo)的結(jié)果均表明，GE、ME和PE的抗氧化活性依次減弱，且在抗氧化能力方面無協(xié)同作用。抗氧化能力強弱與試驗測得的黃酮、多酚含量相對應(yīng)。李玉晶等[25]發(fā)現(xiàn)啤酒花中黃酮、多酚含量與其抗氧化活性相關(guān)。有研究表明，黃酮和多酚能夠通過提供電子或氫原子來中和自由基，從而降低氧化反應(yīng)速率，具有抗氧化活性[27]。

2.4 黃酮、多酚含量與抗氧化指標(biāo)相關(guān)性分析

原料中黃酮、多酚含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除力、Fe2+螯合能力的相關(guān)性分析見表3。結(jié)果表明，3種抗氧化指標(biāo)結(jié)果相關(guān)，F(xiàn)e2+螯合力與DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，羥自由基清除力與DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)。黃酮含量與3種抗氧化指標(biāo)均呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，多酚含量與DPPH自由基清除率和羥自由基清除率有極顯著的正相關(guān)性(P<0.01)。這表明3種原料中黃酮和多酚含量與其抗氧化能力間存在顯著的量效關(guān)系(P<0.05)，即黃酮和多酚為3種植物主要的抗氧化成分。

表3 3種原料黃酮多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between flavonoids and polyphenolcontent and antioxidant activity of three raw materials

注：*顯著相關(guān)(P<0.05),**極顯著相關(guān)(P<0.01)

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)地研究了綠茶、桑葉和臭黃荊葉細粉水提液的抑菌和抗氧化能力，并且探究了3種植物抗氧化活性的協(xié)同性。結(jié)果表明：(1)綠茶粉水提液中黃酮、多酚含量最高，其次是桑葉粉，臭黃荊葉粉最低；(2)綠茶、桑葉和臭黃荊葉細粉水提液的抑菌能力依次減弱，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌；(3)綠茶、桑葉和臭黃荊葉細粉水提液均有一定的抗氧化能力，且綠茶粉優(yōu)于桑葉粉優(yōu)于臭黃荊葉粉，三者抗氧化活性無協(xié)同增效作用；(4)綠茶、桑葉和臭黃荊葉細粉中黃酮和多酚含量與其抑菌和抗氧化能力存在顯著的量效關(guān)系(P<0.05)。